khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí cắt khác nhau trên môi
trường MS có bổ sung NAA, IBA và TDZ. 3.1.1. Thí nghiệm 1a: Nguồn vật liệu từ phiến lá
Hình 3.1. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro.
(P bên trái tượng trưng cho phiến lá, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Các mẫu cấy ở nghiệm thức PI1T1 (2 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 IBA và 1 mg l-1 TDZ) đáp ứng tạo mô sẹo sớm nhất vào ngày nuôi cấy thứ 14. Trong khi đó, các nghiệm thức còn lại vẫn chưa có sự thay đổi đáng kể. Đến ngày nuôi cấy thứ 28, mô sẹo đã bắt đầu hình thành ở hầu hết các nghiệm thức (trừ PI0T1). Mô sẹo có màu vàng, được quan sát thấy xuất hiện ở phần rìa của mẫu cấy (nơi có vết thương). Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao ở ngày thứ 28 là 16% ở nghiệm thức PI1T0,2 (2 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 TDZ). Trong 14 ngày nuôi cấy tiếp theo, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo tăng nhanh ở các nghiệm thức PI0T0,2, PI0T1, PI0,5T0,2, PI1T1. Từ ngày thứ 49 đến ngày thứ 56, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá trên các môi trường nuôi
0 20 40 60 80 100 14 28 42 56 Tỉ lệ m ẫu tạo m ô sẹo (% )
Thời gian nuôi cấy (ngày)
PI0T0,2 PI0T0,5 PI0T1 PI0,5T0,2 PI0,5T0,5 PI0,5T1 PI1T0,2 PI1T0,5 PI1T1
cấy đạt trạng thái ổn định. Nghiệm thức PI0,5T0,2 (2 mg l-1 NAA, 0,5 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 TDZ) có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao (72%) vào ngày nuôi cấy thứ 56 (Hình 3.1).
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56.
Tên NTz Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 Vị trí 4 Vị trí 5 Phiến lá PI0T0,2 80 60 60 40 40 abx 56 PI0T0,5 20 40 60 60 40 ab 44 PI0T1 60 80 80 40 20 ab 56 PI0,5T0,2 80 60 80 40 100 a 72 PI0,5T0,5 60 80 80 40 40 ab 60 PI0,5T1 60 100 60 40 40 ab 60 PI1T0,2 80 60 60 20 20 ab 48 PI1T0,5 40 40 60 60 0 b 40 PI1T1 20 40 100 80 100 a 68 ANOVAy IBA (A) ns ns ns ns ns ns TDZ (B) ns ns ns ns ns ns A x B ns ns ns ns ** ns CV(%) 88,99 79,46 67,93 112,94 94,87 63,55 Chú thích: z
P bên trái tượng trưng cho phiến lá, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng.
y
ns, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,01.
x
các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo nhìn chung ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 56 không có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 3.1). Các vị trí cắt khác nhau trên phiến lá cũng không khác biệt về tỉ lệ tạo mô sẹo, trừ vị trí thứ 5 (vị trí gần cuống lá). Theo Bùi Trang Việt (2000), auxin nội sinh được tổng hợp trong lá non, sau đó
di chuyển tới rễ. Các vị trí khác nhau của phiến lá đều có hàm lượng auxin nội sinh cao kết hợp với tác động của CĐHSTTV ngoại sinh nên các mẫu cấy đều có khả năng đáp ứng tạo mô sẹo tương đồng nhau ở các nghiệm thức khác nhau. Sau 8 tuần nuôi cấy, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo của vị trí thứ 5 trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm 0,5 mg l-1 IBA, 0,2 mg l-1 TDZ và 1 mg l-1 IBA, 1 mg l-1 TDZ đạt cao (100%). Tỉ lệ nồng độ auxin/cytokinin thích hợp cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự tạo mô sẹo. Khi nồng độ auxin (IBA) quá thấp hoặc quá cao so với cytokinin (TDZ), tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo thấp hơn.
Hình 3.2. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 5 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitroở ngày thứ 56 (thanh ngang = 1 mm).
(P bên trái tượng trưng cho phiến lá, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Các mẫu cấy từ phiến lá đều xuất hiện mô sẹo dạng khối tròn, bề mặt mềm, màu vàng tại vị trí vết thương và khắp bề mặt mẫu cấy. Hình thái mô sẹo bắt đầu có sự khác biệt giữa các nghiệm thức vào ngày thứ 35. Một số ít mô sẹo xốp, màu trắng được quan sát thấy. Mô sẹo xốp hình thành nhiều hơn ở nghiệm thức PI0T0,5, PI0T1, PI0,5T0,5 vàongày thứ 56 (Hình 3.2).
3.1.2. Thí nghiệm 1b: Nguồn vật liệu từ thân khí sinh
Sau 10 ngày nuôi cấy, đoạn thân khí sinh bắt đầu phình lên tại vị trí vết thương, nhất là phần gốc của mỗi mẫu cấy. Mô sẹo hình thành vào ngày nuôi cấy thứ 14 ở tất cả các nghiệm thức (Hình 3.3). Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao (26,66%) vào ngày thứ 14 ở nghiệm thức TI0,5T0,2 có bổ sung 2 mg l-1 NAA, 0,5 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 TDZ. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo rất thấp (6,66%) ở các nghiệm thức TI0T0,5, TI0,5T1 và TI1T0,2 (Hình 3.3). Đến ngày thứ 35 của quá trình nuôi cấy, sự đáp ứng tạo mô sẹo tăng lên rất nhanh (hơn 2 – 4 lần so với ngày nuôi cấy thứ 28), trừ nghiệm thức TI0,5T0,2, TI0,5T0,5. Vào ngày nuôi cấy thứ 42, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo đạt rất cao (80,02%) ở nghiệm thức TI0T0,2 (2 mg l-1 NAA, 0,2 mg l-1 TDZ) và TI1T0,5 (2 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 IBA, 0,5 mg l-1 TDZ). Các nghiệm thức TI0T0,2, TI0T0,5, TI0,5T0,2, TI1T0,2, TI1T0,5 và TI1T1 có tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo hầu như không thay đổi ở ngày thứ 56.
Vào ngày thứ 28, ở nghiệm thức TI0T0,2 (2 mg l-1 NAA và 0,2 mg l-1 TDZ) có sự xuất hiện các thể giống hình cầu và hình tim của phôi soma (Hình 3.4) tại phần gốc của vị trí đoạn cắt thứ 3 (gần gốc thân) ở thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro. Các cấu trúc này vẫn giữ nguyên và không phát triển thành cây hoàn chỉnh cho đến ngày thứ 56.
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ đoạn thân khí sinh giữa các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 56 không có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 3.2). Các vị trí cắt khác nhau trên thân khí sinh cũng không có sự khác biệt, trừ vị trí thứ 1 (nơi tiếp giáp với phiến lá). Có thể do phần mẫu cấy bị thương tiếp xúc với môi trường còn ít, các tế bào ở sâu bên trong không tiếp nhận được CĐHSTTV để cảm ứng cho sự tạo mô sẹo.
Hình 3.3. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo theo thời gian nuôi cấy của đoạn thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro.
(T bên trái tượng trưng cho thân khí sinh, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Hình 3.4. Các thể giống phôi hình cầu và hình tim của phôi soma hình thành tại vị trí thứ 3 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở nghiệm thức có 2 mg l-1
NAA và 0,2 mg l-1 TDZ vào ngày thứ 28 (a) và ngày thứ 56 (b) (thanh ngang = 1 mm). 0 20 40 60 80 100 14 28 42 56 Tỉ Lệ m ẫu tạo m ô sẹo (% )
Thời gian nuôi cấy (ngày)
TI0T0,2 TI0T0,5 TI0T1 TI0,5T0,2 TI0,5T0,5 TI0,5T1 TI1T0,2 TI1T0,5 TI1T1 a b
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA và TDZ lên tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo, vị trí tạo mô sẹo từ thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 56.
Tên NTz Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Vị trí 1 Vị trí 2 Vị trí 3 Thân khí sinh TI0T0,2 100 ax 40 100 80,02 TI0T0,5 40 ab 40 60 46,68 TI0T1 80 a 20 80 60,02 TI0,5T0,2 0 b 60 80 46,68 TI0,5T0,5 80 a 60 60 66,68 TI0,5T1 80 a 100 100 93,34 TI1T0,2 60 ab 60 80 66,68 TI1T0,5 80 a 80 80 80,00 TI1T1 60 ab 60 100 73,34 ANOVAy IBA (A) ns ns ns ns TDZ (B) ns ns ns ns A x B * ns ns ns CV(%) 67,44 85,57 47,97 51,04 Chú thích:
z T bên trái tượng trưng cho thân khí sinh, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng.
y ns, * không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.
x
các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
Vào ngày nuôi cấy thứ 14, mô sẹo có màu vàng, bề mặt mềm, xuất hiện ở nghiệm thức TI0T1, TI0,5T1, TI1T0,2, TI1T0,5 và TI1T1. Nồng độ TDZ càng tăng (từ 0,5 – 1 mg l-1) thì tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo xốp, trắng càng nhiều (nghiệm thức TI0T1, TI0,5T0,5, TI0,5T1, TI1T0,5 và TI1T1) (Hình 3.5).
Hình 3.5. Hình thái mô sẹo hình thành từ vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro sau 56 ngày nuôi cấy (thanh ngang = 1 mm).
(T bên trái tượng trưng cho thân khí sinh, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Những nghiên cứu trên các đối tượng thuộc chi Panax trước đây cho thấy để cảm ứng tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy thường có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin. Đối với sâm Triều Tiên, nếu nguồn mẫu cấy là hạt thì môi trường khởi tạo mô sẹo là khoáng MS bổ sung 1 mg l-1 2,4-D và 0,01 mg l-1 Kin (Arya và cs., 1993); từ lá mầm và trụ thượng diệp là khoáng MS bổ sung 1 mg l-1 2,4-D và 0,1 mg l-1 Kin (Lim và Lee, 1997). Sâm Việt Nam tạo mô sẹo từ rễ củ với nồng độ auxin phù hợp nhất là 1 mg l-1 2,4-D (Nguyễn Trung Thành và cs., 2007; Dương Tấn Nhựt và cs., 2009). Với suy nghĩ 2,4-D là một auxin mạnh có thể gây biến dị và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm thu được từ cây sâm Việt Nam in vitro, nên trong thí
nghiệm này 2,4-D đã không được sử dụng để cảm ứng tạo mô sẹo. Thay vào đó, NAA và IBA kết hợp với TDZ đã được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Vai trò của NAA, IBA và TDZ trong việc cảm ứng tạo mô sẹo ở thực vật đã được chứng minh ở nhiều loại cây trồng. Odnevall và cs. (1989) đã tạo được mô sẹo từ hạt cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) và giả sâm (Panax pseudoginseng) trên môi trường MS bổ sung 1 mg l-1 2,4-D và 1 mg l-1 NAA. Trong nghiên cứu của Takagi và cs. (1993), mô sẹo được hình thành từ rễ cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg l-1
IBA và 1 mg l-1 Kin.
Cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào. Những nồng độ cao của cytokinin cần cho sự tăng trưởng và phát triển mô nuôi cấy, vì có nhiều enzym làm thoái hóa chúng như cytokinin oxydase. Điều này có thể được hạn chế nếu có sự hiện diện của auxin trong quá trình nuôi cấy, vì auxin cũng có tác dụng giúp phân chia tế bào. Do đó, sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là cần thiết cho sự hình thành, tăng sinh và phát sinh hình thái mô sẹo. Trong nhóm cytokinin, TDZ là chất có hoạt tính sinh học mạnh, rất dễ kháng lại sự phân hủy bởi các chất oxy hóa cytokinin nên TDZ khá bền trong môi trường nuôi cấy (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Kết quả tạo mô sẹo từ lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro trong thí nghiệm 1a cũng tương đồng với kết quả tạo mô sẹo của Nguyễn Vũ Phong và Ngô Thị Tú Trinh (2010) trên cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L. Harms), thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). Ở nồng độ 0,2 mg l-1
TDZ, nồng độ auxin (2,4-D) càng cao thì mẫu lá đinh lăng từ chồi in vitro phát sinh mô sẹo nhanh hơn trong thời gian đầu (20 ngày). Có thể nồng độ auxin cao kích thích sự dãn dài và phân chia tế bào, nhất là những tế bào ở vùng bị tổn thương. Mô sẹo thường xuất hiện xung quanh vết cắt của mẫu cấy. Sau khi hình thành mô sẹo, nồng độ auxin cao có thể sẽ ức chế sự tăng sinh mô sẹo. Mẫu cấy từ phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro trên môi trường MS bổ sung 2 mg l-1
NAA, 1 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1TDZ đáp ứng tạo mô sẹo chậm hơn (ở ngày nuôi cấy thứ 28). Có thể do cây sâm Việt Nam với đặc điểm di truyền là sinh trưởng rất chậm ngoài tự nhiên nên thời gian mẫu nuôi cấy
đáp ứng với việc phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật cũng kéo dài hơn. Theo Bùi Trang Việt ( 2000), auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống tốt hơn. Tương tự, Nguyễn Thành Sum và cs. (2009) đã tạo được mô sẹo từ lớp mỏng củ sâm Việt Nam trên môi trường MS bổ sung 3 mg l-1 2,4-D sau 2 tháng nuôi cấy.
Khả năng tạo mô sẹo từ mẫu cấy thân khí sinh khá cao và nhanh hơn so với từ phiến lá. Ở một số nghiệm thức I0T0,2; I0,5T1; I1T0,5, tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ thân khí sinh còn vượt trội hơn từ mẫu cấy phiến lá (Hình 3.6).
Hình 3.6. So sánh tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo từ mẫu cấy phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày thứ 56.
(I bên trái tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Khi tiếp tục theo dõi sau ngày thứ 56, các mẫu cấy lớp mỏng từ phiến lá hóa nâu dần. Ở nghiệm thức TI1T0,5 và TI1T1, đoạn thân khí sinh có sự xuất hiện của chồi và rễ bất định (Hình 3.7). Mặt khác, đến ngày thứ 77, mẫu cấy ở các nghiệm thức đều được chuyển sang môi trường không có 2 mg l-1
NAA. Sau 9 tuần cấy
0 20 40 60 80 100 120 Tỉ lệ m ẫu tạo m ô sẹo (% ) Nghiệm thức Phiến lá Thân khí sinh
chuyển, lớp mỏng phiến lá cũng hóa nâu và chết. Một số mẫu cấy từ đoạn thân khí sinh đã xuất hiện những khối tròn trắng, trong, dính với nhau thành từng cụm từ phần mô sẹo được hình thành trước đó, chủ yếu ở nghiệm thức TI0T0,5, TI0,5T0,5, TI1T0,5 (Hình 3.8).
Hình 3.7. Chồi và rễ bất định hình thành trên đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro sau 4,5 tháng nuôi cấy (thanh ngang = 2 mm).
(T bên trái tượng trưng cho thân khí sinh, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Hình 3.8. Hình thái mô sẹo từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro
trên môi trường không có 2 mg l-1
NAA sau 9 tuần cấy chuyển (thanh ngang = 2 mm).
(T bên trái tượng trưng cho thân khí sinh, I tượng trưng cho IBA, T bên phải tượng trưng cho TDZ, các số tượng trưng cho nồng độ sử dụng).
Nồng độ NAA, IBA và TDZ sử dụng trong thí nghiệm này đã đem lại một số kết quả nhất định trong việc tạo mô sẹo ở cây sâm Việt Nam in vitro. Đồng thời, thân khí sinh in vitro đã đáp ứng tạo mô sẹo nhanh và tốt hơn so với phiến lá (Hình 3.6). Mặc dù đã có sự hình thành mô sẹo, nhưng chưa có biểu hiện rõ rệt nào về sự phát sinh phôi soma trên các mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức nuôi cấy phiến lá và thân khí sinh của cây sâm in vitro. Cây sâm Việt Nam ở điều kiện tự nhiên đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng râm, nên độ ẩm tương đối 55 + 5 % của phòng nuôi cấy cùng cường độ ánh sáng 25 + 5 µmol m-2 s-1 có thể không phù hợp cho sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, việc nuôi mẫu cấy liên tục trong bình nuôi cấy kín, không có sự trao đổi khí có thể đã sinh ra một số chất ức chế sự phát triển của mẫu cấy, chẳng hạn như ethylen. Ethylen là một chất khí, do tế bào thực vật sinh ra trong