lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây
sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
• Gia tăng chồi (chồi/mẫu)
Gia tăng chồi ở ngày nuôi cấy thứ 49 có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 3.7). Nghiệm thức C50 (khoáng đa lượng, vi lượng CLC và 50 g l-1đường sucrose) có gia tăng số chồi đạt cao nhất (3,58 chồi/mẫu) vào ngày thứ 49. Môi trường nuôi cấy có khoáng đa lượng, vi lượng CLC giúp sự gia tăng chồi tốt nhất trong số các môi trường được sử dụng trong thí nghiệm này. Nồng độ đường sucrose cao (50 g l-1) thích hợp cho sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam
in vitro hơn 30 g l-1 sucrose trên môi trường nuôi cấy có thành phần khoáng đa lượng, vi lượng Gamborg B5 và CLC (Cheé, 1992) (Bảng 3.7).
• Chiều cao chồi (mm/mẫu)
Chiều cao chồi không có sự khác biệt về mặt thống kê vào ngày thứ 49 khi kết hợp các thành phần khoáng với các nồng độ đường sucrose. Nếu xét từng yếu tố thì kết quả vẫn có sự khác biệt. Trên cùng môi trường khoáng đa lượng, vi lượng, đường sucrose với nồng độ 30 g l-1
tỏ ra có hiệu quả hơn trong việc kéo dài chiều cao chồi. Sự tăng trưởng chồi đạt tốt nhất trên môi trường khoáng CLC nên chiều cao chồi cũng có kết quả cao trên môi trường này (Bảng 3.7).
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose lên khả năng tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro
ở ngày thứ 49.
Tên NTz Gia tăng chồi
(chồi/mẫu) Chi(mm/mều cao chồi ẫu) (rễ/mẫu) Số rễ Chi(mm/mều dài rễ ẫu) (mg/mTLT mẫu) ẫu M30 0,88 dex 11,92 0,21 0,92 65,72 M50 0,75 e 8,58 0,17 0,54 52,65 S30 0,79 e 13,75 0,38 1,71 64,28 S50 0,92 de 12,63 0,29 1,04 63,68 G30 1,38 d 10,42 1,71 4,33 82,85 G50 2,21 c 7,96 1,29 3,33 82,97 C30 2,83 b 15,92 1,42 3,42 154,77 C50 3,58 a 12,88 0,46 1,67 180,08 ANOVAy Khoáng (A) ** ** ** ** ** Đường (B) ** ** ** * ns A x B * ns ns ns ns CV(%) 17,12 10,74 41,08 41,05 12,34 Chú thích: z
M, S, G, C bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng, vi lượng MS, SH, Gamborg B5, CLC, 30 và 50 là nồng độ đường sucrose (30 g l-1
và 50 g l-1).
y ns, *, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05 hay p < 0,01.
x
các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
• Số rễ (rễ/mẫu) và chiều dài rễ (mm/mẫu)
Số rễ và chiều dài rễ ở các nghiệm thức vào ngày thứ 49 không có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 3.7). Nồng độ đường sucrose thấp (30 g l-1
) có tác dụng đối với sự hình thành rễ và kéo dài rễ hơn nồng độ 50 g l-1. Môi trường khoáng Gamborg B5 thích hợp cho sự tạo rễ và kéo dài rễ hơn các môi trường còn lại.
Hình 3.25. Cụm chồi cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro sau 49 ngày nuôi cấy với ảnh hưởng của thành phần khoáng đa lượng, vi lượng và nồng độ đường sucrose (thanh ngang = 5 mm).
(M, S, G, C bên trái tượng trưng cho khoáng đa lượng, vi lượng MS, SH, Gamborg B5, CLC; 30 và 50 là nồng độ đường sucrose (30 g l-1 và 50 g l-1).
• Trọng lượng tươi mẫu (mg/mẫu)
Trọng lượng tươi mẫu không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Nếu chỉ xét yếu tố khoáng thì vẫn có sự khác biệt (Bảng 3.7). Các mẫu cấy trên môi trường khoáng CLC có trọng lượng tươi cao hơn.
Bên cạnh môi trường MS cơ bản, các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật còn sử dụng các loại môi trường khoáng khác như Gamborg B5 (1968), SH (1972), CLC (1992). Các môi trường nuôi cấy trên có thành phần khoáng đa lượng và vi lượng khác nhau đáng kể. Sự khác biệt giữa các môi trường khoáng là nồng độ nitrogen. Môi trường SH và Gamborg B5 không có NH4NO3, nhưng được thay thế bằng (NH4)H2PO4 và (NH4)2SO4 với hàm lượng rất thấp (tương ứng là 300 mg l-1
và 134 mg l-1). Môi trường CLC có thành phần khoáng đa lượng, vi lượng giống như môi trường MS, chỉ khác ở CLC có thêm 2237 mg l-1
KCl (Phụ lục 1). Trong phạm vi nhất định, mô thực vật có thể chịu được nồng độ ion Cl- tương đối cao mà không bị tổn hại. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung Cl- để điều tiết nồng độ ion các nguyên tố cần thiết khác (Nguyễn Quang Thạch, 2009). KCl và KNO3 đều có thể cung cấp K+ cho mô nuôi cấy, nhưng khi dùng KNO3 sẽ làm tăng nồng độ NO3- trong môi trường nuôi cấy, còn sử dụng KCl thì không ảnh hưởng đến nồng độ ion khác. Theo Nguyễn Ngọc Dung (1995), cây sâm Việt Nam trong tự nhiên là cây tạo củ tổng hợp saponin, cần trao đổi đường nên phải có K giúp cây tạo củ, vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần hàm lượng K cao, đạm nitrat thấp. Môi trường CLC có nồng độ ion K+ cao nhất trong các môi trường sử dụng. Điều này có lẽ đã giúp cụm chồi cây sâm Việt Nam tăng trưởng nhanh.
Môi trường SH thường được sử dụng trong nuôi cấy cây thân thảo và là môi trường được sử dụng trong nuôi cấy một số loài sâm trên thế giới. Theo Dương Tấn Nhựt và cs. (2010), môi trường tái sinh chồi tốt nhất từ mô sẹo là môi trường SH bổ sung 1 mg l-1 NAA, 1 mg l-1 BA, 30 g l-1 sucrose và 2 g l-1 than hoạt tính sau 4 tuần nuôi cấy, với số lượng chồi/mẫu (7,5 chồi) và trọng lượng tươi của chồi (1 mg) trên môi trường SH vượt trội hơn so với môi trường MS. Kết quả thí nghiệm này lại cho thấy môi trường SH không có hiệu quả trong việc tăng sinh chồi cây sâm Việt Nam
in vitro. Số chồi gia tăng trên môi trường SH bổ sung 30 g l-1 sucrose thấp (0,79 chồi/mẫu) và trọng lượng tươi chỉ đạt 64,28 mg/mẫu. Trong khi đó, môi trường CLC bổ sung 50 g l-1
sucrose có gia tăng chồi cao (3,58 chồi/mẫu) với trọng lượng tươi đạt 180,08 mg/mẫu (Bảng 3.7).
Môi trường SH cũng được dùng để nuôi cấy rễ bất định của cây sâm Mỹ trong hệ thống bioreactor. Số rễ trung bình và sự tăng trưởng của rễ đạt cao nhất trên môi trường SH (Park và cs., 2000). Rễ bất định từ cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro
trên môi trường SH hình thành không nhiều. Môi trường Gamborg B5 có số lượng rễ và chiều dài rễ đạt tốt hơn (Bảng 3.7).
Thành phần carbohydrate trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đóng vai trò rất quan trọng, đặc biệt là đường. Đường cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy theo kiểu truyền thống vì trong điều kiện bình kín, thiếu CO2
nên quá trình quang hợp của mô không đủ cung cấp chất dinh dưỡng và năng lượng. Loại đường sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật là đường sucrose ở nồng độ 10 – 50 g l-1 (Nguyễn Quang Thạch, 2009). Choi và cs. (2006) cũng thành công trong việc tạo phôi soma từ mô sẹo có khả năng sinh phôi nguồn gốc lá mầm của cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) trên môi trường MS có 50 g l-1đường sucrose. Trong thí nghiệm này, nồng độ 50 g l-1 của đường sucrose rất thích hợp cho sự tăng sinh thêm chồi mới khi môi trường nuôi cấy có bổ sung thành phần khoáng Gamborg B5 hay CLC.
Tóm lại, trong điều kiện thí nghiệm này, môi trường khoáng đa lượng, vi lượng CLC bổ sung vitamin Gamborg B5 và 50 g l-1đường sucrose thích hợp nhất cho sự tăng trưởng của cụm chồi cây sâm Việt Nam in vitro.
CHƯƠNG 4.