cytokinin (TDZ, Kin hay BA) lên khả năng phát sinh phôi soma ở lớp mỏng
phiến lá và đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84.
Tên NTz
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%)
Số rễ/mẫu
Chiều dài rễ (mm/mẫu)
TLT mẫu
(mg/mẫu) (mg/mTLK mẫu) ẫu % chất khô PD 97,2 ax 0 0 31,34 c 3,76 cd 12,13 bc PDK 100,0 a 0,06 0,18 52,52 a 6,74 a 12,41 bc PDT 79,2 a 0,01 0,07 35,00 b 4,62 bc 13,45 abc PDB 88,9 a 0 0 35,70 b 4,81 b 13,66 abc PN 27,8 bc 0 0 9,46 g 1,25 efg 14,10 abc PNK 16,7 c 0 0 6,31 h 0,94 g 15,63 ab PNT 27,8 bc 0 0 32,34 c 3,48 d 10,77 c PNB 19,4 c 0 0 13,12 f 1,71 efg 13,83 abc PI 22,9 c 0 0 7,01 h 1,09 fg 16,77 a PIK 18,3 c 0,03 0,06 13,89 f 2,01 ef 14,72 ab PIT 52,8 bc 0 0 26,21 d 3,16 d 12,70 bc PIB 4,40 c 0,03 0,08 16,20 e 2,10 e 13,19 bc ANOVAy Auxin (A) ** ns ns ** ** ns Cytokinin (B) * ns ns ** ** ns A x B ** ns ns ** ** * CV (%) 24,74 300,38 310,34 3,91 13,41 13,16 Chú thích: z
P bên trái đại diện cho phiến lá; D, N, I đại diện cho các auxin 2,4-D, NAA hay IBA; K, T, B bên phải đại diện cho cytokinin Kin, TDZ hay BA.
y
ns, *, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05 hay p < 0,01.
x
các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
• Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo sau 84 ngày nuôi cấy (12 tuần) khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 3.3). Các nghiệm thức sử dụng 2,4-D (PD, PDK, PDT, PDB) đều có những tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao hơn (80 – 100%) so với nghiệm thức dùng NAA hoặc IBA. Khi sử dụng cùng loại auxin, nghiệm thức không bổ sung cytokinin hoặc có bổ sung thêm các loại cytokinin khác nhau không có khác biệt về phương diện thống kê. Sự đáp ứng tạo mô sẹo thấp nhất (4,4%) ở nghiệm thức có 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 BA (Bảng 3.3). Khi bổ sung 0,2 mg l-1
TDZ vào môi trường có IBA, sự đáp ứng tạo mô sẹo tốt hơn (52,8%) so với các nghiệm thức bổ sung Kin, BA hay không có bổ sung cytokinin. Ngược lại, đối với các nghiệm thức có 2,4-D, 100% số mẫu nuôi cấy đều tạo mô sẹo với sự hiện diện của 0,2 mg l-1Kin trong môi trường nuôi cấy (Bảng 3.3).
• Số rễ (rễ/mẫu) và chiều dài rễ (mm/mẫu)
Nhìn chung, sự tạo rễ ở các nghiệm thức không đáng kể. Tất cả các mẫu nuôi cấy trên môi trường có NAA đều không hình thành rễ bất định. Số rễ và chiều dài rễ ở ngày thứ 84 không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức. Các nghiệm thức PDK, PDT, PIK và PIB có sự hình thành rễ tại vị trí vết thương (Hình 3.10). Số rễ và chiều dài rễ ở nghiệm thức PDK (0,06 rễ/mẫu và 0,18 mm/mẫu) đạt cao hơn so với các nghiệm thức còn lại (Hình 3.9).
• Trọng lượng tươi và trọng lượng khô mẫu (mg/mẫu)
Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy có sự khác biệt rất ý nghĩa về mặt thống kê ở tất cả các nghiệm thức. Sau 84 ngày nuôi cấy, các mẫu cấy từ lớp mỏng phiến lá ở nghiệm thức có bổ sung 2,4-D và Kin đạt tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo cao nhất nên trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu cấy cũng cao nhất (52,52 và 6,74 mg/mẫu). Tuy nhiên, trọng lượng tươi và khô thấp nhất ở nghiệm thức có sự hiện diện của NAA và Kin (Bảng 3.3). Đối với các nghiệm thức có NAA hoặc IBA, việc bổ sung 0,2 mg l-1 TDZ đã làm gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu đáng kể so với các nghiệm thức khác có bổ sung cùng loại auxin ở ngày thứ 84 (Bảng 3.3).
Hình 3.9. Hình thái mô sẹo và rễ hình thành từ lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở các vị trí khác nhau trên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin ở ngày thứ 84 (thanh ngang = 1 mm).
(a) Vị trí 1, (b) Vị trí 2, (c) Vị trí 3, (d) Vị trí 4, (e) Vị trí 5, (f) Vị trí 6.
Hình 3.10. Rễ hình thành từ vị trí thứ 6 của lớp mỏng phiến lá cây sâm Việt Nam in vitrotrên môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 BA ở ngày thứ 84. (a) thanh ngang = 1 mm; (b) thanh ngang = 100 µm, r: sơ khởi rễ.
• Phần trăm chất khô (%)
Ở ngày nuôi cấy thứ 84, phần trăm chất khô của mẫu cấy có sự khác biệt về mặt thống kê (Bảng 3.3). Phần trăm chất khô cao ở những mẫu có tỉ lệ tạo mô sẹo thấp, đồng thời trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mẫu ở ngày thứ 84 cũng thấp. Nghiệm thức PI có phần trăm chất khô cao (16,77%).
Khác với một số cây dược liệu tạo củ như Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) khi được nuôi cấy in vitro, các tế bào nhu mô lá của chồi đã phản phân hóa sau 3 ngày nuôi cấy và tạo mô sẹo vào ngày thứ 7 ở vị trí vết thương (Huỳnh Thị Đan San, 2009). Lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam in vitro cảm ứng tạo mô sẹo chậm hơn (sau 14 ngày nuôi cấy), có thể do đặc điểm sinh trưởng của cây sâm Việt Nam ngoài tự nhiên cũng diễn ra rất chậm. Ở ngày thứ 84, các nghiệm thức sử dụng 2,4-D riêng lẻ hoặc kết hợp với các loại cytokinin khác nhau đều có sự hình thành mô sẹo nhiều hơn, nhất là nghiệm thức PD và PDK (Hình 3.11). Mô sẹo màu vàng, bề mặt mềm phủ hết toàn bộ mẫu cấy trên môi trường bổ sung 2 mg l-1 2,4-D. Trên môi trường nuôi cấy có 2 mg l-1
2,4-D và 0,2 mg l-1 Kin, bề mặt mô sẹo vàng xuất hiện những khối mô sẹo xốp, màu trắng vào ngày thứ 56 (sau khi giảm nồng độ 2,4-D xuống còn 0,1 mg l-1
). Các mẫu cấy lớp mỏng phiến lá ở nghiệm thức PN, PNK hóa nâu dần từ vị trí vết thương và chết. Việc bổ sung thêm BA vào các nghiệm thức có 2,4-D hay NAA đã làm xuất hiện một số khối tròn màu vàng đục hoặc vàng xanh xuất hiện ở rìa dưới của mẫu cấy vào ngày thứ 42 (Hình 3.11).
Nghiệm thức PIK (IBA kết hợp Kin) có sự hình thành cụm phôi soma ở mẫu cấy của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro tại vị trí thứ 6 (phần hướng về cuống lá gần thân khí sinh) vào ngày nuôi cấy thứ 84. Cụm phôi soma có sự hiện diện của các giai đoạn phát triển khác nhau như phôi hình cầu, hình tim, hình thủy lôi và cả phôi có hai lá mầm (Hình 3.12). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trên cây sâm Triều Tiên (Panax ginseng) của Kim và cs. (2006). Trong nghiên cứu này, Kim và cs. đã ghi nhận được sự hình thành phôi soma trực tiếp từ lá mầm nuôi cấy trên môi trường MS.
Hình 3.11. Mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro sau 84 ngày nuôi cấy (thanh ngang = 1 mm).
(P ở phía trái đại diện cho phiến lá; D, N, I đại diện cho các auxin 2,4-D, NAA hay IBA; K, T, B đại diện cho cytokinin Kin, TDZ hay BA).
Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cs. (2009, 2010) cũng cho kết quả tương tự khi sử dụng 1 mg l-1 2,4-D trong việc tạo mô sẹo từ lá của cây sâm Việt Nam. Tuy nhiên, mô sẹo chỉ xuất hiện trên mẫu nuôi cấy là lớp mỏng từ củ của cây sâm
Việt Nam 10 năm tuổi khi môi trường MS có bổ sung 1 mg l-1 2,4-D kết hợp với 0,2 mg l-1 TDZ dưới điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày sau 8 tuần nuôi cấy.
Huỳnh Thị Đan San (2009) nuôi cấy mô sẹo 8 tuần tuổi của cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) có nguồn gốc từ lá in vitro trên môi trường MS bổ sung 1 mg l-1 2,4-D trong 1 tuần và sau đó chuyển sang môi trường MS không bổ sung CĐHSTTV trong 2 tuần đã quan sát thấy sự xuất hiện của phôi soma hình cầu. Những phôi hình cầu tiếp tục phát triển thành phôi hình tim và phôi hình thủy lôi trên môi trường MS có 0,5 mg l-1
NAA, 0,5 mg l-1 BA và 10% (v/v) nước dừa. Các phôi soma hình cầu, hình tim xuất hiện trực tiếp trên phiến lá cây sâm Việt Nam in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 84 sau khi mẫu cấy được cấy chuyền từ môi trường MS1/2 có CĐHSTTV sang môi trường không có CĐHSTTV (Hình 3.12). Điều này có thể do nồng độ CĐHSTTV đã giảm và được loại bỏ hoàn toàn sau đó đã giúp các tế bào phản phân hóa được tái biệt hóa và phát sinh hình thái theo những hướng khác nhau (rễ, chồi bất định hoặc phôi soma). Đồng thời, các chất ức chế tăng trưởng như ethylen cũng được loại bỏ khi mẫu cấy được cấy chuyền sang bình nuôi cấy khác.
Hình 3.12. Cụm phôi soma tại vị trí gốc lớp mỏng phiến lá của cây sâm Việt Nam
in vitro sau 84 ngày nuôi cấy trên môi trường ban đầu có 2 mg l-1 IBA và 0,2 mg l-1 Kin (thang ngang = 1 mm).
3.2.2. Thí nghiệm 2b: Nguồn vật liệu từ thân khí sinh
• Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo (%)
Sau 14 ngày nuôi cấy, do ảnh hưởng của các CĐHSTTV, các đoạn thân khí sinh bắt đầu gia tăng kích thước. Ở ngày thứ 21, mô sẹo tại các vị trí vết thương của thân khí sinh mới bắt đầu xuất hiện. Vào ngày nuôi cấy thứ 84, tỉ lệ mẫu đáp ứng tạo mô sẹo từ thân khí sinh đạt 100% ở đa số các nghiệm thức (Bảng 3.4). Tất cả mẫu cấy ở các nghiệm thức nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2,4-D (1 mg l-1) hay NAA (2 mg l-1), có hoặc không có Kin (0,2 mg l-1) hay TDZ (0,2 mg l-1) đều hình thành mô sẹo. Trong khi đó, việc kết hợp các loại auxin này với BA ở nồng độ 0,2 mg l-1 đã không đem lại hiệu quả cho việc hình thành mô sẹo. Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo ở các nghiệm thức này đều thấp, nhất là không có mẫu nào tạo mô sẹo khi IBA kết hợp với BA (0,2 mg l-1
) (Bảng 3.4). Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy IBA không hiệu quả trong sự tạo mô sẹo ở thân khí sinh so với các auxin khác, ngoại trừ việc kết hợp IBA với TDZ đã kích thích 100% mẫu cấy tạo mô sẹo (Bảng 3.4).
• Số rễ (rễ/mẫu) và chiều dài rễ (mm/mẫu)
Ở ngày nuôi cấy thứ 28, các nghiệm thức bổ sung IBA với nồng độ 2 mg l-1
có sự hình thành rễ bất định từ vị trí vết thương của thân khí sinh, trừ nghiệm thức TIT (2 mg l-1 IBA, 0,2 mg l-1 TDZ) (Hình 3.14). Sau 35 ngày nuôi cấy, số lượng rễ bất định từ vết cắt của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitro ở các nghiệm thức TI, TIK, TIB tăng lên rất nhanh (Hình 3.13 và 3.14). Vào ngày thứ 42, khi chuyển sang môi trường nuôi cấy cùng loại auxin nhưng có nồng độ giảm còn 0,1 mg l-1
, mẫu cấy ở các nghiệm thức TD, TDK, TNK đã bắt đầu xuất hiện rễ bất định. Vào ngày nuôi cấy thứ 84, số lượng rễ/mẫu hình thành từ thân khí sinh đạt cao nhất (3,21 rễ/mẫu) với chiều dài rễ trung bình 8,83 mm ở nghiệm thức TI (môi trường MS1/2 bổ sung 2 mg l-1 IBA) (Bảng 3.4). Mẫu cấy từ đoạn thân khí sinh hình thành rễ bất định nhiều hơn so với phiến lá. Số rễ và chiều dài rễ ở các nghiệm thức khác nhau có sự khác biệt rất ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.4).
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các loại auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình thái từ đoạn thân khí sinh của cây sâm Việt Nam nuôi cấy in vitro ở ngày thứ 84.
Tên NTz
Tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo
(%)
Số rễ/mẫu
Chiều dài rễ (mm/mẫu)
TLT mẫu
(mg/mẫu) TLK m(mg/mẫu) ẫu % chất khô TD 100 ax 0,38 bc 1,17 c 53,71 b 5,52 ab 10,27 d TDK 100 a 0,23 bc 0,54 c 48,75 c 5,14 b 10,40 cd TDT 100 a 0 c 0 c 59,04 a 6,46 a 11,32 abcd TDB 6,7 cd 0,08 c 0,57 c 52,45 b 6,41 ab 12,71 a TN 100 a 0 c 0 c 19,04 h 2,30 c 12,16 abc TNK 100 a 0,08 c 0,27 c 23,59 g 2,81 c 11,47 abcd TNT 100 a 0,02 c 0,13 c 59,27 a 6,12 ab 10,82 bcd TNB 16,7 bc 0,10 c 0,35 c 36,06 d 3,54 c 10,13 d TI 22,9 b 3,21 a 8,83 a 24,73 fg 3,25 c 13,22 a TIK 6,7 cd 1,39 b 5,33 b 27,21 ef 3,22 c 12,45 ab TIT 100 a 0,02 c 0,02 c 56,67 a 6,68 a 12,35 ab TIB 0 d 0,68 bc 1,22 c 28,45 e 3,48 c 12,79 a ANOVAy Auxin (A) ** ** ** ** ** ** Cytokinin (B) ** ** ** ** ** ns A x B ** ** ** ** ** * CV (%) 6,61 93,08 71,91 2,88 11,36 8,43 Chú thích:
z T bên trái đại diện cho thân khí sinh; D, N, I đại diện cho các auxin 2,4-D, NAA hay IBA; K, T, B bên phải đại diện cho cytokinin Kin, TDZ hay BA.
y ns, *, ** không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05 hay p < 0,01.
x
các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo Duncan’s Multiple Range Test.
Hình 3.13. Số rễ hình thành trên thân khí sinh của cây sâm Việt Nam in vitro
theo thời gian nuôi cấy ở các nghiệm thức khác nhau.
(T bên trái đại diện cho thân khí sinh; D, N, I đại diện cho các auxin 2,4-D, NAA hay IBA; K, T, B bên phải đại diện cho cytokinin Kin, TDZ hay BA).
• Trọng lượng tươi và trọng lượng khô mẫu (mg/mẫu)
Trọng lượng tươi và trọng lượng khô mẫu ở các nghiệm thức có sự khác biệt rất ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.4). Trọng lượng tươi mẫu đều gia tăng rõ rệt ở các nghiệm thức có 2,4-D. Các nghiệm thức bổ sung TDZ (0,2 mg l-1) đều có trọng lượng tươi mẫu đạt cao nhất sau 84 ngày nuôi cấy (Bảng 3.4). Mặc dù các mẫu cấy trên môi trường chỉ có 2 mg l-1 NAA đều tạo mô sẹo nhưng trọng lượng tươi của mẫu thấp nhất (19,04 mg/mẫu) trong tất cả các nghiệm thức. Trọng lượng khô đạt cao nhất ở hai nghiệm thức TDT và TIT (Bảng 3.4). Tuy tỉ lệ mẫu tạo mô sẹo gần như thấp nhất ở nghiệm thức TDB (2,4-D kết hợp với 0,2 mg l-1BA), nhưng trọng lượng tươi (52,45 mg/mẫu) và trọng lượng khô (6,41 mg/mẫu) của mẫu đều rất cao ở ngày nuôi cấy thứ 84.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 14 28 42 56 70 84 Số rễ/m ẫu
Ngày nuôi cấy
TD TDK TDT TDB TN TNK TNT TNB TI TIK TIT TIB
• Phần trăm chất khô (%)
Phần trăm chất khô cũng có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức (Bảng 3.4). Các nghiệm thức có sự hiện diện của IBA đều có phần trăm chất khô rất cao, đặc biệt ở nghiệm thức TI (13,22%).
Hình 3.14. Sự hình thành mô sẹo, chồi và rễ bất định trên mẫu cấy tại vị trí thứ 1 của thân khí sinh cây sâm Việt Nam in vitroở ngày thứ 84 (thanh ngang = 1 mm). (T bên trái đại diện cho thân khí sinh; D, N, I đại diện cho các auxin 2,4-D, NAA hay IBA; K, T, B bên phải đại diện cho cytokinin Kin, TDZ hay BA).
Theo Nguyễn Hữu Hổ và cs. (2009), sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg l-1
2,4-D và 10% (v/v) nước dừa, phần gốc rễ của cây sâm Việt Nam
in vitro (kể cả toàn bộ đoạn rễ) có sự hình thành nhanh và nhiều mô sẹo, nhưng không quan sát thấy mô sẹo có khả năng sinh phôi soma hay cơ quan nào khác. Tuy nhiên, trên môi trường MS bổ sung 2 mg l-1
NAA và 0,2 mg l-1 Kin hoặc 2 mg l-1
IBA và 0,2 mg l-1 Kin, mô sẹo có khả năng sinh phôi soma và một số dạng phát triển của phôi soma được quan sát thấy sau 8 – 10 tuần nuôi cấy. Trong thí nghiệm này, sự hình thành phôi soma cũng đã được phát hiện trên môi trường có bổ sung NAA và BA hay IBA và Kin sau 12 tuần nuôi cấy (Hình 3.15 và 3.16).
Ảnh hưởng của TDZ kết hợp với 2,4-D trong môi trường MS có bổ sung 10%