Khi tia sáng đi từ một môi trường (không khí) vào một môi trường khác (chất lỏng). Tuỳ thuộc vào nồng độ các chất hoà tan mà độ lệch của tia sáng thay đổi. Dựa vào độ lệch của tia sáng, ta có thể xác định được nồng độ chất hoà tan [9].
Tiến hành: Chuẩn máy bằng nước cất về giá trị 0. Nhỏ dịch nguyên liệu vào và đọc kết quả. Tiến hành đo 2 lần, kết quả chênh lệch giữa 2 lần đo không quá 0,2. Nếu vượt quá giá trịđo đó, đo lần 3. Lấy trung bình của 2 kết quả.
3.4.2.2. Xác định hàm lượng anthocyanin tổng sốNguyên lý: Nguyên lý:
Chất màu anthocyanin thay đổi theo pH. Tại pH = 1 các anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu. Đo mật độ quang của mẫu tại pH = 1 và pH = 4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm.
Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer:
C l I I . . lg 0 = ε , Trong đó: I I0 lg
đặc trưng cho mức độ ánh sáng yếu dần khi đi qua dung dịch hay còn gọi là mật độ quang, ký hiệu là A, I: cường độ ánh sáng khi đi qua dung dịch, I0: cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch, C: nồng độ chất nghiên cứu, l: chiều dày của lớp dung dịch mà ánh sáng đi qua, ε: hệ số hấp thụ phân tử.
42
Hình 3.1: Màu của anthocyanin trong khoai lang tím tại pH = 1 và pH = 4,5
Hàm lượng anthocyanin xác định theo công thức: l V K M A a . . . . ε = , g (*) Trong đó: A = (Aλmax_pH=1 -
A700nm_pH=1) - (Aλmax_pH=4,5- A700nm_pH=4,5), với Aλmax, A700nm: độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và 700nm ở pH = 1 và pH = 4,5;
a: lượng anthocyanin, g;
M: khối lượng phân tử của anthocyanin, g/mol; l: chiều dày cuvet, cm;
K: độ pha loãng; V: thể tích chiết, l.
Từđó tính ra được hàm lượng anthocyanin theo phần trăm: % anthocyanin toàn phần = .100% 10 ). 100 ( −w −2 m a (**)
Trong đó: a: lượng anthocyanin tính được theo công thức (*), g; m: khối lượng nguyên liệu ban đầu, g; w: độ ẩm nguyên liệu, %.
Cách tiến hành:
- Xác định độẩm và chiết tách anthocyanin thô: + Xác định độẩm bằng máy phân tích độẩm.
+ Quá trình chiết tách anthocyanin được thực hiện theo sơđồ sau:
43
Nguyên liệu tươi→ Rửa sạch bằng nước, để ráo→ Cân 10 g/gói → Để lạnh đông -20oC → Nghiền nhỏ → Ngâm trong dung môi (cồn : nước tỷ lệ 1:1 có 1% HCl) → Lọc qua bông thấm nước → Ly tâm, đo thể tích dịch trong dùng làm mẫu phân tích.
+ Xác định bước sóng hấp thụ cực đại:
Lấy 5 ml dịch chiết pha loãng với dung dịch đệm pH =1,0 trong bình định mức 25ml, quét phổ hấp thụ trong vùng khả kiến (λ = 450 - 720) trên máy quang phổ UV- VIS.