a. Cấu trúc chuyển hoá
Trong môi trường nước các anthocyanin tự nhiên giống như chất chỉ thị pH. Đỏở pH thấp, đỏ xanh ở pH trung gian và không màu ở pH cao. Tại pH đã cho, tồn tại một cân bằng giữa 4 cấu trúc của anthocyanin và aglycone: quinonoidal (anhydro) bazo (A) màu xanh, cation flavylium (AH+) màu đỏ, carbinol pseudobase (B) và chalcone (C) không màu.
Khi pH < 2, các anthocyanin tồn tại chủ yếu dạng cation flavylium màu đỏ (R3=0-đường) hoặc màu vàng (R3=H). Khi pH tăng, sự mất proton xảy ra nhanh
19
thành dạng quinononidal màu xanh dương hoặc màu đỏ. Dạng quinonoidal thường tồn tại như một hỗn hợp vì pKa của nhóm OH ở vị trí 4’,7 và 5 là tương tự.
Khi để yên, sự chuyển hóa xảy ra có sự tách nước của cation flavylium cho ra dạng pseudobase (hemiacetal). Dạng này cân bằng với dạng chalcone vòng mở không màu.
Hai dạng Cis (CE) và trans-chalcone (CZ) được tạo thành từ carbinol pseudobase bởi phản ứng mở vòng nhanh và isomer hóa chậm. Cả 2 chalcone này khác nhau so với chalcone bình thường là bởi chúng có nhóm chức carbonyl ở cạnh vòng B, trong đó chalcone bình thường có nhóm carbonyl ở kế cận vòng A.
b. Cấu trúc hoá học
Độ bền màu và cường độ màu của các anthocyanin phụ thuộc vào vị trí và số lượng của các nhóm hydroxyl, methoxyl, đường và các đường được acyl hóa. Khi số nhóm hydroxyl trong vòng B tăng,cực đại hấp thu ở vùng thấy được dịch chuyển về phía có bước sóng dài hơn và màu thay đổi từ cam đến xanh dương.
Ví dụ: Bước sóng hấp thu cực đại trong dung dịch HCl 0,01% MeOH đối với pelgonidin: λmax= 520 nm (cam), cyaniding: λmax= 535 nm (đỏ cam), dephinidin: λmax= 545 nm (đỏ xanh).
Khi nhóm methoxyl thay thế nhóm hydroxyl thì ta thu được kết quả ngược lại. Nhóm hydroxyl tại vị trí C-3 có ý nghĩa quan trọng vì dung dịch anthocyanin chuyển từ màu cam vàng đến màu đỏ. Điều này giải thích sự khác nhau giữa anthocyanin có màu đỏ trong khi đó 3-deoxyanthocyanin: apigenidin, luteolinidin và tricetinidin có màu vàng nhưng 3-deoxyanthocyanidin bền hơn các anthocyanidin khác (Mazza và Brouillard, 1987; Iacobucci và Sueny, 1983).
Sự có mặt của nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 và nhóm thế ở vị trí C-4, cả 2 biến hóa dạng có màu thông qua sự ngăn cản các phản ứng hydrat hóa đẫn đến sự tạo thành dạng không màu.
Khi mức độ hydroxyl hóa các aglycone tăng, tính bền của các anthocyanin sẽ giảm. Tuy nhiên khi tăng sự methoxyl hóa, sẽ thu được kết quả ngược lại.
Ví dụ: sự có mặt của nhóm OH ở vị trí 4’ và 7 trong phân tử làm bền hóa đáng kể các pigment, trong khi đó, sự methoxyl hóa có nhóm hydroxyl này làm giảm độ bền.
Các anthocyanin được glycosyl hóa và acyl hóa sẽ cho dạng màu xanh, sự glycol hóa những nhóm OH tự do làm tăng tính bền của anthocyanin. Vì vậy, các diglucoside bền hơn các monogluside của cùng một anthocyanin.
20
Anthocnin có chứa 2 hay nhiều nhóm acyl (như ternatin, platyconin, cinerarrin, gntiodenphin và zebrrinin) là bền trong môi trường trung tính hoặc axit yếu do liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của các nhân phenolic trong anthocyanin và axit vòng thơm. Brouillard (1981-1982) và Goto cùng với cộng viên (1982-1983) khảo sát rằng các anthocnin diacylate hóa được bền hóa bởi sự liên kết chặt kiểu sandwich nhờ sự tương tác giữa vòng anthocyanin và 2 nhóm acyl vòng thơm.
2.3.5.2. pH
Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể lên màu sắc của anthocyanin (Brouillard 1984,Mzza và Brouillard 1987). Cấu trúc, độ bền màu, màu sắc của anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH. Sự thay đổi cấu trúc của anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần cấu trúc chuyển hóa. Năm 1956 Lukton nghiên cứu thấy rằng: ở ph = 2 - 4,5 thì vận tốc phân hủy pelargonidin 3- glucoside trong dịch ép của quả dâu không xác định được khi không có O2.
Khi có mặt O2, pH tăng nhanh, sự biến tính tăng lên mãnh liệt.
Đến năm 1972, Adams nghiên cứu thấy rằng ở pH = 2 - 4 ít ảnh hưởng đến sự phân hủy của Anthocyanin trong suốt quá trình gia nhiệt khi không có O2. Khi có mặt O2 thì Anthocyanin bị biến tính mạnh ở pH trên cấu trúc của chúng cùng với độ bền màu thay đổi với sự thay đổi pH.
2.3.5.3. Nhiệt độ
Trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, Anthocyanin dễ dàng bị biến tính dướitác dụng của nhiệt độ (Markakis 1974). Anthocyanin bị phân hủy chậm ở nhiệt độ thường và nhanh ở nhiệt độ cao.
Khi một cấu trúc của anthocyanin bền với sự gia tăng của pH thì nó cũng bền với sự gia tăng của nhiệt độ. Sự hydroxyl hóa các aglycone làm giảm tính bền của anthocyanin, trong khi sự methxyl hóa, glycosyl hóa, acyl hóa sẽ cho kết quả ngược lại.
Cơ chế của sự phân huỷ xảy ra không những phụ thuộc vào nhiệt độ mà còn phụ thuộc vào bản thân của anthocyanin đó. Drazdina cho rằng coumarin glycoside là sản phẩm phân hủy phổ biến của anthocyanin 3,5 - diglycoside và cơ chế của sự phân hủy là đầu tiên, cation flavylium chuyển thành dạng quinolnidal base, tiếp
21
theo là hình thành nhiều dạng sản phẩm trung gian và cuối cùng thu đựơc dẫn xuất coumarin và thành phần tương ứng với vòng B của anthocyanidin. Sự biến tính này không những được xúc tiến bởi nhiệt độ mà còn bị ảnh hưởng bởi oxy.
Anthocyanidin 3 - glycoside thì không hình thành những dẫn xuất coumrin mà bước đầu tiên của sự phân hủy bao gồm sự chuyển hóa của dạng carbinol pseudobase không màu, sau đó là sự mở vòng pyrylium để hình thành dạng chalcone trước khi thủy phân liên kết glycoside.
Adams cho rằng, các anthocyanidin 3 - glycoside khi được nung nóng ở pH = 2,0-4,0 đầu tiên sẽ bị thủy phân liên kết glycoside (ở 100oC) sau đó là sự biến đổi aglycone thành chalcone.
Sự biến tính hơn nữa dẫn đến hình thành dạng sản phẩm màu nâu đặc biệt là với sự có mặt của oxy.
Khi đun nóng lâu dài các anthocyanin có thể bị phân huỷ và mất màu, đặc biệt là cácanthocyanin của dây tây, anh đào, củ cải. Ngược lại các anthocyanin của phúc bồn tử đen cũngtrong điều kiện đó lại không bị thay đổi. Các nghiên cứu màu anthocyanin cũng cho thấy, trong dâu tây cho thấy khi tồn trữ ở 1,1oC lượng anthocyanin giảm rất ít so với khi tồn trữ ở 18,3oC, 21,1oC và 37,8oC. Nhiều nghiên cứu trên quả nho Hy Lạp, quả mâm xôi và quả dâu cũng cho kết quả giống nhau. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.5.4. Oxy
Oxy và nhiệt độ được xem là những tác nhân đặc trưng xúc tiến sự phân hủy của anthocyanin, do đó mà sinh ra những dạng sản phẩm không màu hoặc màu nâu. Chính sự oxy hóa trực tiếp dạng carbinol pseudobase đã gây ra sự kết tủa và đóng váng trong nước trái cây.
Trong quá trình đun nóng các anthocyanin bị oxy hóa mãnh liệt. Oxy và nhiệt độ là những tác nhân xúc tiến đặc biệt nhất trong nước ép của quả anh đào, nho dâu. Lượng anthocyanin còn lại của dâu sẽ lớn hơn khi đóng chai dưới điều kiện chân không hoặc nitrogen (Baravingas và Cain, 1965). Độ bền của các pigment của nho còn được sử dụng như là chất màu ở nước giải khát được tăng lên khi đóng hộp với nitrogen.
2.3.5.5. Enzyme
Nhiều enzyme ( thủy phân hay oxy hóa) nội sinh trong tế bào của nguyên liệu có khả năng làm mất màu anthocyanin. Những enzyme này được gọi chung là anthocyanidaza. Dựa vào đăc tính của các enzyme mà người ta phân làm 2 nhóm:
22
Glycosidase và polyphenol oxidase (PPO). Các enzyme này thu được từ nấm (fugal).
- Glycosidase: là enzyme thủy phân liên kết 3-glycoside thành đường tự do và anthocyanidin, aglycone này kém bền hơn rất nhiều và mất màu rất nhanh khi có mặt của catecol (Huang, 1955).
- Polyphenol oxidase (PPO): tác dụng lên anthocyanin với sự có mặt của O-diphenol thôngqua cơ chế oxy hóa kết hợp. Theo Gromeck và Markakis, sự thêm vào glycosidase và PPOxúc tác cho quá trình peroxide hóa phân hủy anthocyanin. Các enzyme này có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 90 ÷ 100oC trong 45÷60 giây (Bùi Hữu Thuận, 2000).
Peng và Markakis đã đề nghị một cơ chế mà trong đó O-quinine được tạo thành bởi sự oxy hóa anthocyanin. Blom phân lập được enzyme anthocyanin- glycosidase từ Aspergillus Niger và chỉ ra ảnh hưởng của nó trong quá trình thủy phân liên kết glycoside của anthocyanin. PPO là enzyme có ảnh hưởng yếu lên anthocyanin dạng quinonoidal base dễ bị thủy phân bởi PPO hơn dạng cation flavylium. Tốc độ phân hủy bởi PPO phụ thuộc vào sự thay thế mô hình của vòng B và mức độ glycosyl hóa.
2.3.5.6. Ánh sáng
Các anthocyanin thường không bền khi tiếp xúc với tia tử ngoại, ánh sáng thấy được, và các nguồn pháp xạ khác. Ánh sáng có 2 ảnh hưởng đến anthocyanin:
- Tăng cường cho quá trình sinh tổng hợp. - Xúc tiến sự biến tính của chúng.
Năm 1964, Siegenman cho rằng những quả táo giống đỏ sẽ chuyển sang màu xanh khi để trong bóng tối. Năm 1968, Vanburen và các cộng sự cho rằng các diglucoside được acyl hóa và methyl hóa thì các anthocyanin trong rượu bền nhất khi để ngoài ánh sáng, các diglucoside không bị acyl hóa là ít bền hơn và monoglucoside là kém bền nhất. Năm 1975, Palamidis và Markakis đã tìm thấy rằng ánh sáng thúc đẩy quá trình phân hủy anthocyanin trong nước giải khát có CO2 được phối màu với anthocyanin từ xác nho. Macccarone và cộng sự đã nghiên cứu sự quang hóa của anthocyanin và chỉ ra rằng, anthocyanin diglycosyl hóa tại vị trí C-3 và C-5 là bền hơn các anthocyanin mono glycoyl hóa tại vị trí C-3 đồng thời chúng bền hơn so với các aglycone tương ứng.
23
2.3.5.7. Đường và các sản phẩm biến tính của chúng
Ở nồng độ 100 ppm, đường và các sản phẩm phân hủy của chúng có tác dụng thúc đẩy sự phân hủy các anthocyanin, trong đó fructose, arabinose, lactose và sorbose có khả năng phân hủy anthocyanin mạnh hơn glucose, sucrose, và maltose. Tốc độ phân hủy của anthocyanin liên quan đến tốc độ phân hủy của đường. Các sản phẩm phân hủy của đường gồm có: furfura l,5-hydroxymethyl furfural và acctaldehyde thu được từ phản ứng Mailard hoặc từ sự oxy hóa của axit ascorbic, polyuronic hoặc ở bản thân các anthocyanin. Những sản phẩm phân hủy này dễ dàng ngưng tụ với các anthocyanin hình thành những hợp chất phức tạp có màu nâu sẫm.
Sự phân hủy anthocyanin với sự có mặt của furfural và HMF trực tiếp phụ thuộc vào nhiệt độ và được thấy rõ nhất là trong nước trái cây sự có mặt của nó làm tăng thêm hiệu quả phân huỷ của tất cả các loại đường và các dẫn xuất của chúng.
2.2.5.8. Các ion kim loại
Một số ion kim loại đa hóa trị có thể tương tác với các anthocyanin có nhóm OH ở vị trí ortho gây ra hiệu ứng sẫm màu (bathocromic). Hiện tượng này xảy ra khi kim loại tiếp xúc với anthocyanin trong quá trình chế biến rau quả hoặc sự cho thêm các muối kim loại vào trong thực phẩm.
Anthocyanin chứa glycoside o-dihydroxy như cyanidin, delphinidin tạo màu với kim loại. Các hợp chất này ổn định với ánh sáng và pH. Màu sắc muối kim loại của anthocyanin không chỉ phụ thuộc vào anthocyanin mà còn phụ thuộc vào ion kim loại đó và hầu hết có màu đỏ tía hơi xám. Các ion kim loại này có trong các dụng cụ chứa đựng trong quá trình chế biến. Các hộp thiếc dùng để chứa rau quả có chứa anthocyanin có thể bị trầy xước do quá trình vận chuyển, gia công làm cho thiếc di chuyển vào trong hộp làm cho cùi của quả việt quất chuyển sang xanh xám, anthocyanin tạo phức với thiếc cho màu xanh da trời trong một số nước berry. Khi lớp thiếc bị bong tróc ra thì làm cho sắt bên trong bị phân hủy bởi acid trong thực phẩm (rau quả), ion sắt có thể ảnh hưởng lên anthocyanin, với muối Fe2+
, Fe3+ tạo phức màu xanh da trời với anthocyanin ở pH > 5,5. Nếu quả dâu được cắt bởi dao thép thì vết cắt sẽ trở nên sậm màu. Muối nhôm được tạo thành với anthocyanin cũng làm thay đổi màu sắc ban đầu của nó, cyanidin 3-glycoside tạo phức đỏ với nhôm ở pH trên 5,5. Istrunk và Cash đã chứng minh rằng có thể bền hóa màu của dịch trích dâu bằng cách thêm vào đó muối thiếc. Francis (1977) công bố rằng, các ion Ca, Fe, Al tạo thêm sự bảo vệ cho anthocyanin của nước ép trái mận việt quất
24
(cranberry), nhưng sự biến đổi màu xảy ra là do sự tạo phức giữa ion kim loại và tannin, kết quả sau cùng là không có lợi.
Trong công nghiệp đồ hộp, sự mất màu của những trái cây có chứa anthocyanin là do có phản ứng với thiếc của đổ hộp (Culpepper và caldwell, 1972). Trong phản ứng với thiếc, anthocyanin đóng vai trò như chất khử cực catod hoặc anod. Chất khử cực catod có thể bị khử bởi hydro mới sinh từ phản ứng giữa kim loại và acid, còn chất khử cực anod thường là các anthocyanin có ít nhất 2 nhóm hydroxyl ở vị trí ortho.
2.3.5.9. Sunphurdioxide (SO2)
Các anthocyanin thường bị mất màu khi có mặt của SO2. Hiện tượng này thường xảy ra trong quá trình xử lý các sản phẩm thực phẩm có chứa anthocyanin bằng SO2. Quá trình khử này có thể là thuận nghịch hoặc bất thuận nghịch. Trái cây và nước quảđược xử lý bằng một lượng trung bình SO2 (500 - 2000 ppm), làm mất màu các anthocyanin của chúng trước khi chế biến, hơn nữa, chúng được desunfit hoá và màu anthocyanin được phục hồi. Jurd đã đề nghị sơ đồ phản ứng thuận nghịch giữa SO2 và anthocyanin trong đó, dạng có màu flavylium phản ứng với ion bisulphate tạo thành chromene-2-(hoặc 4)- sulphonic axit.
SO2 ở nồng độ rất thấp (khoảng 30 ppm) có thể ức chế sự biến tính do enzyme của anthocyanin trong quả anh đào nhưng không làm mất màu chúng (Goodman và Markakis, 1965). Sự tẩy màu bất thuận nghịch xảy ra trong quá trình tẩy quả với lượng lớn SO2 (0,8 - 1,5%) và soda (0,4 - 1%) được dùng trong quá trình tẩy quả. Phản ứng bất thuận nghịch này chưa được biết hoàn toàn.
2.3.5.10. Axit ascorbic
Nhiều nhà khảo sát Beatic và cộng sự, 1943; Pederson và cộng sự, 1947; Kertesz, 1952; Meschter, 1953; Markakis và cộng sự, 1957; Starr và Francis 1968, quan sát sự biến mất đồng thời của acid ascorbic và anthocyanin trong nước trái cây tồn trữ và đề nghị một tương tác có thể có giữa 2 hợp chất này. Acid ascorbic hiện diện trong hầu hết các sản phẩm trái cây, vitamin này bị oxy hoá tạo thành H2O2 và chính H2O2 làm mất màu anthocyanin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Shrikhande và Francis đã tìm thấy các ion đồng xúc tiến và các flavonoid làm giảm sự phân huỷ của cả hai axit ascorbic và anthocyanin. Những sản phẩm không màu, axit dehydroascorbic cũng có thể làm mất màu anthocyanin nhưng tại tốc độ thấp hơn axit ascorbic.
25
2.2.5.11. Một số yếu tố khác
- H2O2 oxy hóa anthocyanin.
- Anthocyanin ngưng tụ với chính nó và các chất hữu cơ khác tạo thành phức với protein, tannin, flavonoid, polysaccharide. Phản ứng này làm gia tăng màu của anthocyanin, bền hơn trong chế biến và tồn trữ. Màu ổn định của rượu vang đỏ được cho là sự liên kết của anthocyanin. Các chất này ít nhạy cảm với pH, sự liên kết ở vị trí C4 chống lại sự mất màu bởi SO2. Những phản ứng ngưng tụ khác có thể dẫn đến sự mất màu: một số chất thân hạch như amino axit, catechin…có thể ngưng tụ với flavonoid cho chất không màu.