gallat
Các nghiên cứu đã được công bố trong đó có định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat cho thấy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rất nhiếu để định lượng các hợp chất này.
Hiroyuki Sakakibara, Yoshinori Honda, Satoshi Nakagawa, Hitoshi Ashida, và Kazuki Kanazawa sử dụng phương pháp HPLC để xác định đồng thời tất cả các polyphenol trong rau, quả và trà. Hệ thống sắc ký Hitachi HPLC series D-7000 với detector mảng diod, quét phổ trong khoảng 200 đến 600 nm, cột Capcell pak C18 UG120 (250×4,6 mm, 5µm). Pha động: kênh A gồm 50 nM natri phosphat (pH 3,3) và methanol 10%; kênh B là dung dịch methanol 70%, tốc độ dòng 1,0 ml/ phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µL. Các giá trị đầy đủ của phương pháp bao gồm độ nhạy, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ tìm lại đã được kiểm soát. Trong nghiên cứu này đã sử dụng 28 chất chuẩn khác nhau để xác định thành phần các polyphenol. Kết quả đã xác định được một số lượnglớn các hoạt chất khác nhau đặc biệt trong lá trà chứa một lượng lớn đáng ngạc nhiên các polyphenol đặc biệt là epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), và epigallocatechin gallat (EGCG). Trong đó epigallocatechin gallat có thời gian lưu là 17 phút còn hesperidin có thời gian lưu là 45,6 phút [27].
Nhóm các nhà nghiên cứu người Trung Quốc đã sử dụng sắc ký lỏng khối phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng đồng thời 8 hợp chất có hoạt tính sinh học trong thuốc “Danning”. Hệ thống sắc ký Agilent-1100 HPLC, cột ZORBAX Extend C18, (5µm, 250 × 4,6 mm). Chế độ chạy gradient với kênh A (đệm format gồm dung dịch acid formic 0,05%, điều chỉnh pH về 5,0 bằng amoniac), kênh B là acetonitril. Tốc độ dòng là 0,8 ml/ phút, thể tích tiêm 20 µl. Phương pháp phân tích được thẩm định tính tuyến tính với giá trị hệ số tương quan cao R2> 0,9995; giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,06- 0,32 g/ml, giới hạn định lượng (LOQ) trong khoảng 0,25- 0,93 g/ml; độ thu hồi các hoạt chất nằm trong khoảng 99,3- 100,2% với giá trị RSD dao động trong khoảng 0,5 đến 1,5%. Kết quả phân tích xác
33
định được đồng thời hesperidin và resveratrol với thời gian lưu tương ứng là 24,5 phút và 35,4 phút [49].
Howard Mark Merken và Gary R. Beecher đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng để phân tách và định lượng các flavonoid aglycon điển hình chủ yếu có trong thức ăn. Nghiên cứu tiến hành trên hệ thống Hewlett-Packard Series 1100, cột Zorbax Eclipse XDB-C18, (250×4,6 mm, 5µm), pha động gồm nước, methanol và acetonitril, mỗi kênh thêm 0,05% (kl/kl) acid trifluoroacetic acid (TFA). Bước sóng phát hiện ở 210, 260, 278, 370 và 520 nm. Kết quả phân tích xác định được 17 flavonoid khác nhau trong đó xác định được epigallocatechin gallat có thời gian lưu 18,0 phút, hesperetin có thời gian lưu 45,9 phút [28].
Xavier Vitrac và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký để phân tích resveratrol và các flavonoid trong rượu, trong nghiên cứu này đã định lượng đồng thời một số catechin và resveratrol, hàm lượng trung bình của resveratrol trong các mẫu rượu vang đỏ là 2,3 mg/l. Phương pháp HPLC sử dụng cột Prontosil C18 (4 µm, 250 × 4,0mm), pha động nước : trifluoro acetic acid (TFA) (99: 1, v/v) (dung môi A), và acetonitrile: dung môi A (80: 20, v/v) (dung môi B), tốc độ dòng 1,0 ml/ phút. Quét phổ trong khoảng 200 đến 450 nm. Các nghiên cứu này cho thấy phương pháp HPLC với cột sắc ký pha đảo C18 phù hợp để có thể phân tích đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong các mẫu cao[53].
34
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cao đặc hỗn hợp bào chế từ chiết xuất vang nho, cao trần bì, và cao chè xanh.
Chiết xuất vang nho do nhóm nghiên cứu của PGS. TS Vũ Đình Hoàng (đại học Bách Khoa Hà Nội) bào chế. Cao đặc trần bì được bào chế bởi nhóm nghiên cứu của TS. Phương Thiện Thương tại Viện Dược liệu. Cao đặc chè xanh là sản phẩm của đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu công nghệ chiết tách một số chế phẩm thiên nhiên có giá trị kinh tế cao bằng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn” do Viện Hóa học Công nghiệp chủ trì, TS. Lưu Hoàng Ngọc làm chủ nhiệm đề tài.
Các mẫu cao đặc hỗn hợp chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh (tỷ lệ 4:2:1) được bào chế bằng cách nghiền trộn trên cối tại Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ
- Máy HPLC Shimadzu (VKN/VL/06.26) detector DAD, cột phân tích Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6mm; 5µm).
Hình 2.1: Máy HPLC – UV - Cân phân tích Mettler Toledo AB204 (Thuỵ Sĩ), - Máy lắc siêu âm,
35 - Tủ sấy, tủ hút,
- Bộ lọc dung môi, màng lọc 0,45μm,
- Pipet chính xác các loại, micro pipet, và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác.
2.2.2. Hóa chất, thuốc thử
- Chất chuẩn resveratrol SKS: 11535200301 C4 (Viện kiểm nghiệm Dược phẩm và sinh phẩm Trung Quốc, NICPBP cung cấp). Hàm lượng 100,00% tính theo nguyên trạng.
- Chất chuẩn hesperidin SKS: QT214 010812 do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp. Hàm lượng 91,79% tính theo nguyên trạng.
- Chất chuẩn epigallocatechin gallat (EGCG) SKS: QT215 011012 do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp. Hàm lượng 93,29% tính theo nguyên trạng.
- Dung môi, hoá chất: nước cất, methanol (HPLC), acetonitril (HPLC), acid formic (PA)...
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xác định một số chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh
- Xác định tính chất vật lý: mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc, - Tro toàn phần: thử theo DĐVN IV (phụ lục 9.8),
Tiến hành theo phương pháp 1: cân chính xác khoảng 3,0 g mẫu thử vào một chén sứ đã nung và cân bì. Nung ở nhiệt độ không quá 450°C tới khi không còn carbon (nung đến khi thu được tro màu trắng hoặc gần như trắng), làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân.
Tính tỷ lệ phần trăm của tro toàn phần.
Tro toàn phần =Khối lượng sau nung Lượng cao ban đầu x 100
- Giới hạn kim loại nặng: thử theo DĐVN IV (phương pháp 3, phụ lục 9.4.8). + Dung dịch thử: lấy khoảng 1,0 g chế phẩm cho vào một chén nung silica, thêm 4 ml dung dịch magnesi sulphat 25% trong acid sulfuric 1M, trộn đều bằng 1
36
đũa thủy tinh nhỏ, rồi đun nóng cẩn thận. Đốt dần dần để than hóa (khoảng 600°C), tiếp tục đốt đến khi thu được cắn màu xám nhạt, để nguội, làm ẩm cắn bằng 0,2 ml dung dịch acid sulfuric 1M, bốc hơi rồi đốt lại, sau đó để nguội. Hòa tan cắn, dùng 2 lượng, mỗi lượng 5 ml dung dịch acid hydrocloric 2M. Thêm 0,1 ml dung dịch phenolphtalein, rồi cho từng giọt dung dịch amoniac đậm đặc đến khi có màu hồng. Để nguội, thêm acid acetic băng đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0,5 ml nữa, lọc rồi pha loãng dung dịch với nước thành 20 ml.
Lấy 12 ml dung dịch này thử theo phương pháp 3, phụ lục 9.4.8, DĐVN IV. + Dung dịch chì mẫu 1 ppm: lấy 1 ml dung dịch chì mẫu 100 ppm cho vào một chén nung silica, thêm 4 ml dung dịch magnesi sulphat 25% trong acid sulfuric 1M, sau đó tiếp tục xử lý như dung dịch thử, bắt đầu từ câu: “trộn đều bằng một đũa thủy tinh nhỏ...” đến câu: “lọc rồi pha loãng dung dịch với nước thành 20 ml”.
+ Tiến hành: chuẩn bị 3 ống nghiệm giống hệt nhau: Ống thử: 12 ml dung dịch thử,
Ống chuẩn: 10 ml dung dịch Pb 1 ppm và 2 ml dung dịch thử, Ống trắng: 10 ml nước cất và 2 ml dung dịch thử,
Thêm lần lượt vào mỗi ống:
+ 2 ml dung dịch đệm acetat pH 3,5 + 1,2 ml dung dịch thioacetamid Lắc đều, để yên trong 2 phút. + Yêu cầu:
Ống chuẩn có màu nâu nhạt khi so sánh với ống trắng, Ống thử có màu nâu nhạt hơn so với màu nâu của ống chuẩn.
37
2.3.2. Xây dựng, thẩm định phương pháp định tính, định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat bằng HPLC resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat bằng HPLC
2.3.2.1. Xây dựng phương pháp
Tham khảo tài liệu và các nghiên cứu đã công bố về phương pháp HPLC định lượng các hoạt chất trong cao, lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp nhất, thông thường có thể tham khảo được lựa chọn cột, pha động, bước sóng phân tích. Dựa vào cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý (độ tan, tính chất phân cực, tính chất hấp thụ ánh sáng...) của resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat để tìm được điều kiện sắc ký phù hợp như pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử và dung môi pha mẫu.
- Cột sắc ký: qua tham khảo các tài liệu [27],[28],[49],[53] lựa chọn cột pha đảo C18, sử dụng cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6mm; 5µm).
- Lựa chọn pha động: Do cả 3 chất resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat đều tan trong methanol, có khối lượng phân tử nhỏ (Mw< 2000) và thuộc loại không ion hoá nên đều có thể sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha đảo để định lượng các hợp chất này. Dựa vào các tài liệu tham khảo [27],[28],[49],[53], lựa chọn pha động là acetonitril và dung dịch acid formic 0,1%, khảo sát các tỷ lệ khác nhau để tìm tỷ lệ thích hợp (khả năng tách tốt, thời gian lưu phù hợp, píc cân đối...).
- Bước sóng: quét phổ UV-Vis lựa chọn bước sóng thích hợp, - Tốc độ dòng: khảo sát tốc độ trong khoảng 0,5 đến 1ml/ phút, - Thể tích tiêm mẫu: khảo sát trong khoảng 5 đến 15 μl.
- Pha dung dịch chuẩn gốc:
Cân chính xác khoảng10,6 mg chuẩn resveratrol; 10,5 mg chuẩn hesperidin và 15,2 mg chuẩn epigallocatechin gallatvào bình định mức 50 ml, hòa tan và pha loãng bằng MeOH vừa đủ đến vạch, trộn đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, pha loãng bằng MeOH để được dung dịch gốc có nồng độ resveratrol; hesperidin và epigallocatechin gallat lần lượt là 42,40 µg/ml; 38,55 µg/ml và 56,72 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
38 - Pha dung dịch thử:
Các mẫu cao: cân chính xác khoảng 0,20 g cao hỗn hợp vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml MeOH, lắc siêu âm trong vòng 15 phút, để nguội về nhiệt độ phòng, thêm MeOH vừa đủ 50 ml. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm.
2.3.2.2. Thẩm định phương pháp
- Tính đặc hiệu:
Tính đặc hiệu được chứng minh thông qua việc phương pháp phân tích sử dụng không bị ảnh hưởng bởi tạp chất có trong mẫu thử. Tiến hành phân tích một mẫu thử có chứa chất phân tích kèm theo những hàm lượng thích hợp các tạp chất và chứng minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử.
- Độ đúng:
Độ đúng của phương pháp được xác định ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 3 lần.
Độ đúng được khảo sát trên mẫu cao đặc hỗn hợp bằng phương pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng nồng tuyến tính đã khảo sát.
Định lượng tìm lại hàm lượng chất đã thêm vào để xác định độ thu hồi.
Độ thu hồi (%) = hàm lượng tìm thấy
hàm lượng thực cho vào x 100
Thông thường độ thu hồi phải đạt 98- 102%. - Độ lặp lại:
Đánh giá độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm khi phương pháp được áp dụng để phân tích lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu. Độ lặp lại của phương pháp phân tích được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của nhiều lần đo đạc.
Cách xác định: tiến hành định lượng 6 lần ở nồng độ thử nghiệm. Tính độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD thường ≤ 2%.
39 - Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính:
Đánh giá mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic, tính tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R. Để đảm bảo yêu cầu về tính tuyến tính, thông thường R ≥ 0,998.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp pha trong MeOH có nồng độ resveratrol trong khoảng 16 -68 μg/ml; nồng độ hesperidin nằm trong khoảng 15- 62 μg/ml và nồng độ epigallocatechin gallat nằm trong khoảng 22- 95 μg/ml. Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được về mặt định tính nhưng không nhất thiết phải là định lượng được trong điều kiện cụ thể. Tại nồng độ phân tích có tỷ số tín hiệu trên nhiễu đường nền (S/N <3) được coi là giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích.
Giới hạn định lượng (LOQ): lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải gấp ít nhất 10 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó (LOQ = 3,3 x LOD).
Tiến hành: pha riêng biệt các dung dịch chuẩn resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong MeOH, để được dung dịch chuẩn resveratrol có nồng độ 16 μg/ml; dung dịch chuẩn hesperidin có nồng độ 15 μg/ml; dung dịch chuẩn epigallocatechin gallat có nồng độ 22 μg/ml. Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Sau đó giảm dần nồng độ bằng cách pha loãng gấp đôi và phân tích theo điều kiện sắc ký đã chọn.
2.3.2.4. Định tính, định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallattrong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh gallattrong cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh
Mẫu nghiên cứu: mẫu cao đặc hỗn hợp từ chiết xuất vang nho, cao trần bì và cao chè xanh.
40
+ So sánh thời gian lưu: so sánh thời gian lưu của píc tương ứng thu được từ sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của píc trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.
+ So sánh phổ UV-Vis: so sánh phổ UV-Vis của píc tương ứng thu được trên sắc ký đồ dung dịch thử với phổ UV-Vis của píc tương ứng trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn.
- Định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV (HPLC - UV) Định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong mẫu nghiên cứu với điều kiện đã được thẩm định.
Định lượng dựa vào diện tích (hoặc chiều cao) píc của mẫu thử so sánh với mẫu chuẩn.
- Hàm lượng % hoạt chất trong cao đặc hỗn hợp được tính theo công thức:
% = × × × 100
St, Sc: là diện tích píc mẫu thử và chuẩn; mt, mc: khối lượng của thử và chuẩn; ft, fc : hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn;
Có thể sử dụng chiều cao píc để tính (Ht, Hc).
2.4. Tính toán kết quả và xử lý số liệu
- Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các công thức hoặc dựa vào các hàm số trong Microsoft Excel.
Tiến hành thử nghiệm n lần, thu được các kết quả xi là x1, x2, x3,….xn, khi đó: Trung bình các kết quả: 1 1 1 n i X x n Độ lệch chuẩn: n 2 1 i = 1 (x - x) S = n - 1
41 Sai số chuẩn: x S
S
n
Sai số tương đối: 100
% Sx t
x
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) S 100
x
Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích píc sắc ký: Y = aX+ b.
Trong đó:
+ Hệ số góc (a) được tính dựa vào hàm slope trong Microsoft Excel. + Hệ số chắn (b) được tính dựa vào hàm intercept trong Microsoft Excel. + Hệ số tương quan (r) được tính dựa vào hàm correl trong Microsoft Excel.
42
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác định các chỉ tiêu chất lượng chung của cao đặc hỗn hợp gồm chiết xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh xuất vang nho, cao trần bì, cao chè xanh
Các mẫu thử được đem đi xác định một số tính chất vật lý theo yêu cầu của