Kết quả phân tích mẫu cao hỗn hợp vang nho, trần bì, chè xanh bằng HPLC - UV với điều kiện chạy sắc ký như trên cho phép tách các chất hoàn toàn các píc
64
cân xứng, gọn,đẹp và có thời gian lưu phù hợp. Thời gian lưu của epigallocatechin gallat, hesperidin, resveratrol lần lượt là 4,3; 7,3; và 15,9 phút.
Trong quá trình nghiên cứu phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao chúng tôi tiến hành phân tích riêng các chất theo những quy trình khác nhau, kết quả cho thấy trên sắc đồ các píc có độ phân giải cao, thời gian lưu không quá dài. Tuy nhiên nếu định lượng các chất theo các quy trình riêng lẻ khối lượng công việc sẽ tăng gấp 3 lần gây tốn kém về hoá chất, thời gian và điều kiện máy móc phòng thử nghiệm không cho phép, chúng tôi quyết định tìm cách định lượng đồng thời các hoạt chất trong cao. Qua tham khảo các tài liệu [27],[28],[49],[53] và dựa vào tính chất lý hoá của ba chất resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat thấy các chất này đều tan trong ethanol, có khối lượng phân tử nhỏ (Mw<2000) và thuộc loại không ion hoá nên có thể sử dụng sắc ký phân bố pha đảo để định lượng các hợp chất này. Lựa chọn được pha động acetonitril - dung dịch acid formic 0,1%, cho khả năng tách tốt và thời gian lưu phù hợp để định lượng.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi xác định được hàm lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp lần lượt không nhỏ hơn 2,6%; 4,5% và 5,6%. Dựa vào tỷ lệ về khối lượng các thành phần các cao đơn khi bào chế cao đặc hỗn hợp là: chiết xuất vang nho: cao trần bì: cao chè xanh có tỷ lệ là 4: 2: 1, từ đó có thể tính được hàm lượng resveratrol trong cao vang nho, hesperidin trong cao trần bì và epigallocatechin gallat trong cao chè xanh lần lượt vào khoảng 4,55%, 15,75% và 39,2%. Kết quả này phù hợp với yêu cầu về hàm lượng hesperidin không nhỏ hơn 3%, (theo tiêu chuẩn chất lượng dược liệu trần bì của DĐVN IV) hàm lượng epigallocatechin gallat không nhỏ hơn 40% (theo dược điển Mỹ USP 34 NF 29).
65
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ * KẾT LUẬN
Khi hoàn thành đề tài này chúng tôi đã thực hiện được các mục tiêu đề ra: - Xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp vang nho, trần bì, chè xanh bằng phương pháp HPLC.
Trong đó, đưa ra chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – UV) để định lượng đồng thời resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc. Điều kiện sắc ký như sau:
Cột RP18, 5µm (4,6 x 250 mm) Pha động Acetonitril - Dung dịch acid
formic 0,1% (30 : 70) Detector UV ở bước sóng 280nm
Thể tích tiêm 8µl Tốc độ dòng 1 ml/phút Nhiệt độ phân tích nhiệt độ phòng
Phương pháp đã phân tích có độ nhạy cao, có tính đặc hiệu, thời gian phân tích ngắn, phân tích đúng, chính xác đối tượng cần phân tích. Vì vậy có thể áp dụng phương pháp này trong định lượng resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong cao đặc hỗn hợp phù hợp với điều kiện các phòng nghiên cứu có trang bị máy HPLC.
- Đã áp dụng điều kiện sắc ký trên để định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat trong mẫu cao đặc hỗn hợp vang nho, trần bì, chè xanh.
- Dự thảo một số chỉ tiêu chất lượng cao đặc hỗn hợp vang nho, trần bì, chè xanh.
Chỉ tiêu 1: tro toàn phần< 10%
Chỉ tiêu 2: kim loại nặng không quá 10 ppm.
Chỉ tiêu 3: định tính resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat Chỉ tiêu 4: định lượng resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat
66
* KIẾN NGHỊ
- Dựa vào tiêu chuẩn chất lượng đã xây dựng, bổ xung, hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng cho cao đặc hỗn hợp vang nho, trần bì, chè xanh.
Mở rộng nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá và ngăn ngừa xơ vữa động mạch trên thực nghiệm của cao đặc hỗn hợp. Đánh giá độc tính và an toàn của chế phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn nội - Đại học Y Hà Nội (2004), Bài giảng bệnh học nội khoa, Nhà xuất bản Y học, Hà nội, tr. 56 - 62.
2. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội. 3. Bộ Y tế (2009), Hóa phân tích II, NXB Y học, Hà Nội.
4. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội. 5. Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB giáo dục, Hà Nội.
6. Bộ Y tế (2000), Quyết định của Bộ trưởng bộ Y tế số 1570 /2000 QĐ-BYT ngày22 tháng 5 năm 2000 về việc triển khai áp dụng nguyên tắc "thực hành tốt phòngkiểm nghiệm thuốc".
7. Bộ Y tế (2010), Thông tư 09/2010/TT-BYT ngày 28/4/2010 của BYT Hướng dẫn việc quản lý chất lượng thuốc.
8. Trần Lê Tuyết Châu (2011), “Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hoá ex vivo của cao chè xanh giàu epigallocatechin-3-gallate (EGCG)”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, Tập 15 (Phụ bản của Số 1).
9. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, Nhà xuấtbản Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh, tr.49- 234.
10. Nguyễn Thị Hà, Phạm Thiện Ngọc, Đặng Ngọc Dung, Trần Thị Hương (2003), “Tác dụng của chè xanh Việt Nam trên rối loạn chuyển hoá lipit ở thỏ uống cholesterol”, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 21(1), tr 14- 21. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11. Hiến pháp nước Cộng hòa XHCN Việt Nam (2006), Luật tiêu chuẩn và quy chuẩn kỹ thuật của Quốc Hội nước cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam số 68/2006/QH11 ngày 29 tháng 6 năm 2006.
12. Vũ Đình Hoàng (2008), Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh trung ương, tìm kiếm các loại thuốc chữa bệnh Alzheimer từ các loài thực vật Việt Nam (2006-2008),Đề tài nghiên cứu cấp bộ (2006-2008).
13. Vũ Đình Hoàng (2011)Nghiên cứu công nghệ chiết tách Resveratrol từ ngồn thực vật Việt Nam, đề tài cấp nhà nước.
14. Nguyễn Thị Hà Ly, Khổng Trọng Quân, Đỗ Thị Phương, Nguyễn Thị Phượng, Nguyễn Minh Khởi, Phương Thiện Thương (2014), Đánh giá sự thay đổi nồng độ của hesperidin trong huyết tương chuột sau khi dùng thuốc đường uống,
Tạp chí Dược liệu, tập 19, số 4.
15. Trần Thị Chi Mai, Nguyễn Thị Hà, Phạm Thiện Ngọc (2005), “Tác dụng của Polyphenol chè xanh (Camellia Sinensis) trên trạng thái chống oxy hóa trong máu ở chuột cống trắng gây đái tháo đường thực nghiệm”, Tạp chí Nghiên cứu y học, tập 38- số 5.
16. Nguyễn Hải Nam (2006), Nghiên cứu tổng hợp resveratrol (Synthesis of resveratrol). Tạp chí Dược học (J. Pharm. Sci.) số 6, tr. 9-11.
17. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2005), Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc,tr230- 250.
Tài liệu tiếng Anh
18. A. Garg, S. Garg, L. J. D. Zaneveld and A. K. Singla (2001), “Chemistry and Pharmacology of The CitrusBioflavonoid Hesperidin”, Phytother. Res, 15, pp. 655–669.
19. Belguendouz L., Fremont L., Linard A. (1997), "Resveratrol inhibits metal ion- dependent and independent peroxidation of porcine low-density lipoproteins",
Biochemical pharmacology, 53(9), pp. 1347-1355.
20. Das J., Mao A., Handique P. (2011), "Terpenoid compositions and antioxidant activities of two Indian valerian oils from the Khasi Hills of north-east India",
Natural product communications, 6(1), p. 129.
21. Diaz M. N., Frei B., Vita J. A., Keaney J. F. Antioxidants and atherosclerotic heart diseases. New Engl. J. Med. 337, 408−416, 1997.
22. Elisa Tripoli et al (2007), “Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties”, A review. Food Chem, Vol 104 No 2, pp 466-479.
23. Fan E., Zhang L., Jiang S., et al. (2008), "Beneficial effects of resveratrol on atherosclerosis", Journal of medicinal food, 11(4), pp. 610-614.
24. Fiala, E.S et al (1996), “(-)-Epigallacatechin gallate, a polyphenolic tea antioxydant, inhibits peroxynitrite-mediated formation of 8- oxodeoxyguanosine and 3-nitrotyrosine”. Experientia, 52, pp. 922-926.
25. F. I. Kanaze et al (2003), “Simultaneous reversed-phase high-performance liquid chromatographic method for the determination of diosmin, hesperidin and naringin in different citrus fruit juices and pharmaceutical formulations”, J Pharm Biomed Anal, 33(2), 243-249.
26. F I. Kanaze et al (2007), “Pharmacokinetics of the citrus flavanone aglycones hesperetin and naringenin after single oral administration in human subjects”,
Eur. J. Clin. Nutr, vol. 61 no4, pp. 472- 477.
27. Hiroyuki Sakakibara et al (2003), Simultaneous Determination of All Polyphenols in Vegetables Fruits, and Teas, J Agric Food Chem, 51(3), page. 571-81.
28. Howard Mark Merken , Gary R. Beecher (2000),Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones, Journal of Chromatography A, vol 897, pp. 177–184.
29. Huafu Wang et al (2003), HPLC determination of catechins in tea leaves and tea extracts using relative response factors, Food Chemistry, vol. 81, page. 307– 312.
30. Jaime A. et al (2005), Stereospecific high-performance liquid chromatographic analysis of hesperetin in biological matrices, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,vol. 37, page. 591–595.
31. Jessica D. Freeman and Emily D. Niemeyer (2008) Quantification of Tea Flavonoids by High Performance Liquid Chromatography, Journal of Chemical Education, vol. 85, Issue 07, p.951
32. Johnson & G. Williamson (2003), Phytochemical functional foods, Cambridge, UK: Woodhead Publishing, pp. 135-145.
33. Kawaii S., Tomono Y., Katase E., et al.(1999), "Quantitation of flavonoid constituents in citrus fruits", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47(9), pp. 3565-3571.
34. Laszlo Mark et al (2005), A Validated HPLC Method for the Quantitative Analysis of Trans-Resveratrol and Trans-Piceid in Hungarian Wines, Journal of Chromatographic Science, Vol. 4, pp. 445-449.
35. Mandel, S., Youdim,M.B (2004), “Catechin polyphenols: neurodegeneration and neuroprotection in neurodegenerative diseases”, Free Radical Biology and Medicine, 37 (3), pp. 304–317. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
36. Nakagawa, K. and Miyazawa, T. Chemiluminescence (1997), “High performance liquyd chromatographic determination of tea catechin, (-)- epigallacatechin 3-gallate, at picomole levels in rat and human plasma”, Anal. Biochem, 248, pp. 41-49.
37. Namita P., Mukesh R., Vijay K. J. (2012), "Camellia Sinensis (green tea): a review", Global J Pharmacol, 6, pp. 52-59.
38. Nance, C.L., Shearer,W.T (2003) “Is green tea good for HIV-1 infection”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 112(5), 851–853.
39. National Research Council (1982), DietNutrition and Cancer, page 286.
40. Nogata Y., Sakamoto K., Shiratsuchi H., et al.(2006), "Flavonoid composition of fruit tissues of citrus species", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 70(1), pp. 178-192.
41. Nuno Ratola et al (2004), Analysis and Quantification oftrans-Resveratrol in Wines from Alentejo Region (Portugal), Food Technol. Biotechnol, 42(2), pp. 125–130.
42. R. Omidbaigi and M. Faghih Nasiri, Z. Bashiri Sadr (2002),Hesperidin in Citrus species, quantitative distribution during fruit maturation and optimal harvesting time, Acta-Horticulturae, 576, pp. 91–97
43. Peterson J. J., Dwyer J. T., Beecher G. R., Bhagwat S. A., Gebhardt S. E, Haytowitz D. B., Holden J. M. Flavanones in oranges, tangerines (mandarins), tangors, and tangelos: a compilation and review of the data from the analytical literature. J. Food Comp. Anal. 19, S66−S73, 2006.
45. Rafaela Macedo Mendes De Oliveira (2012), Quantification of catechins and caffeine from green tea (Camellia sinensis) infusions, extract, and ready-to- drink beverages, Ciênc. Tecnol. Aliment. vol.32 no.1 Campinas Mar. 2012 Epub Jan 31, 2012 Ciênc. Tecnol. Aliment, 32(1), pp. 163-166.
46. Ramprasath V., Jones P. (2010), "Anti-atherogenic effects of resveratrol",
European journal of clinical nutrition, 64(7), pp. 660-668.
47. Rapisarda P., Calabretta M. L., Romano G., Intrigliolo F. Nitrogen metabolism components as a tool to discriminate between organic and conventional Citrus
fruits. J. Agric. Food Chem. 53, 2664−2669, 2005.
48. Robert J Nijveldt et al (2001), “Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications”, Am J Clin Nutr, 74, pp. 418–25.
49. Runhui Liu et al (2006), Simultaneous analysis of eight bioactive compounds in Danning tablet by HPLC-ESI-MS and HPLC-UV, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 43, pp, 1007–1012.
50. Tao Yi et al (2007), Analysis of rhizoma P. cuspidati by HPLC and HPLC- ESI/MS, Phytochem Analysis, 18, pp. 387- 392.
51. Thorne Research I. (2002), "Green tea", Alternative Medicine Review, pp. 200- 204.
52. Tripoli E., Guardia M. L., Giammanco S., et al. (2007), "Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review",
Food Chemistry, 104(2), pp. 466-479.
53. Xavier Vitrac et al (2002),Direct liquid chromatographic analysis of resveratrolderivatives and flavanonols in wines with absorbanceand fluorescence detection, Analytica Chimica Acta, 458, page 103–110.
54. Yashiro T., Nanmoku M., Shimizu M., et al.(2012), "Resveratrol increases the expression and activity of the low density lipoprotein receptor in hepatocytes by the proteolytic activation of the sterol regulatory element-binding proteins",
Atherosclerosis, 220(2), pp. 369-374.
55. Yoshida, H et al (1999),“Inhibitory effect of tea flavonoids on the ability of cells to oxydize low density lipoprotein”, Biochem. Pharmacol, 58, pp. 1695-1703.
56. Wu, L.Y et al (2004), “Green tea supplementation ameliorates insulin resistance and increases glucosetransporter IV content in a fructose-fed rat model”
PHỤ LỤC
1. Sắc ký đồ chuẩn khảo sát tỷ lệ pha động 2. Sắc ký đồ mẫu trắng 3. Sắc ký đồ chuẩn đơn 4. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 5. Sắc ký đồ dung dịch thử 6. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng 7. Sắc ký đồ khảo sát tính tuyến tính 8. Kết quả so phổ UV-Vis các hoạt chất
1. Sắc ký đồ chuẩn khảo sát tỷ lệ pha động 1.1. Tỷ lệ pha động (20: 80)
3. Sắc ký đồ chuẩn đơn 3.1. Chuẩn resveratrol.
4. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 4.1. Chuẩn hỗn hợp 1
5. Sắc ký đồ dung dịch thử 5.1. Dung dịch thử 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Sắc ký đồ khảo sát độ đúng 6.1. Độ đúng 1
7. Sắc ký đồ khảo sát tính tuyến tính 7.1. Tuyến tính 40%
8. So phổ tử ngoại các hoạt chất