- Hoà tan mẫu:
+ Mẫu được hoà tan trong dung môi thích hợp sao cho khi gặp pha động các chất tan không bị tủa làm tắc cột và ảnh hưởng đến quá trình sắc ký.
+ Thông thường mẫu được hoà tan bằng chính pha động sử dụng, nếu có sự hoà tan tốt. Tuy vậy, không nên chọn dung môi có tính hoà tan cao để pha mẫu thử vì có khả năng gây tắc cột khi chất tan giảm độ hoà tan trong pha động.
+ Sử dụng máy lắc siêu âm hoặc các chất trợ tan để giúp hoà tan dễ dàng và hoàn toàn.
- Loại các chất không tan và ảnh hưởng đến quá trình sắc ký: + Thường dùng màng lọc 0,45µm, trước khi tiêm vào máy HPLC, + Ly tâm để loại chất không tan sau đó lọc qua màng lọc 0,45µm, + Loại muối và các chất diện hoạt,
23 - Cô đặc và pha loãng mẫu:
Điều chỉnh lượng mẫu thử và dung môi cho phù hợp, thường bắt đầu với một mẫu đậm đặc, sau đó điều chỉnh bằng cách pha loãng ra.
- Chiết xuất:
Với mẫu thử có nhiều thành phần hoặc có nhiều tạp chất, việc chiết tách giúp mẫu thử sạch hơn, nhờ vậy sự phân tách sẽ tốt hơn.
Có thể chiết xuất mẫu bằng phương pháp chiết xuất pha lỏng hoặc chiết xuất pha rắn [9].
1.4.2. Tổng quan về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.4.2.1. Khái niệm
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố khác nhau của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý [3].
1.4.2.2. Pha tĩnh
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Trong HPLC pha tĩnh thông dụng nhất là silicagel dưới dạng hình cầu có kích thước 3- 10 µm. Hiện nay, trong HPLC phân tích đều được tiến hành với silica được biến đổi hoá học, trong đó quan trọng nhất là loại C- 18 không phân cực [9].
1.4.2.3. Pha động
Pha động trong HPLC là dung môi chảy qua pha tĩnh một cách liên tục. Pha động đóng vai trò một chất mang đối với dung dịch mẫu thử.
- Một số yêu cầu cơ bản cần phải có của một dung môi hay pha động sử dụng trong HPLC [9].
+ Có khả năng hoà tan hoàn toàn mẫu thử mà không có tương tác về mặt hoá học,
24 + Phù hợp với detector sử dụng,
+ Có độ nhớt thấp,
+ Sẵn có trên thị trường và có độ tinh khiết cần thiết, + An toàn, ít độc, ít cháy nổ,
- Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC [9] như bảng 1.2.
Bảng 1.2: Đặc điểm một số dung môi thường dùng trong HPLC
STT Dung môi Độ phân cực Tính tan trong nước UV cut off (nm) Độ nhớt (cP, 25°C) 1 Cloroform 4,1 - 245 0,57 2 Tetrahydrofuran 4,0 + 215 0,55 3 Ethanol 4,3 + 210 1,08 4 Methanol 5,1 + 205 0,60 5 Acetonitril 5,8 + 190 0,34 6 Nước 10,2 + - 0,89 - Quá trình rửa giải:
+ Rửa giải đẳng dòng: thành phần và tỷ lệ pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải.
+ Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỷ lệ các thành phần tạo nên pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải. Lúc này, độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường tăng hiệu quả tách [3].
1.4.2.4. Detector dùng trong HPLC
- Đặc điểm detector
Detector là một trong những bộ phận thiết yếu nhất của máy HPLC để phát hiện ra chất phân tích sau khi đi ra khỏi cột.
Phát hiện chất phân tích có thể dựa vào: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Đáp ứng chọn lọc với chất phân tích: detector UV-Vis hoặc huỳnh quang. + Tính chất chung của chất phân tích trong pha động: detector chỉ số khúc xạ và detector đo độ dẫn điện [3].
25
Cho đến nay, detector hấp thụ tử ngoại- khả kiến là loại detector thông dụng nhất trong HPLC. Nguyên tắc của detector này là pha động từ cột đi ngang qua tế bào đo được chiếu một chùm tia tử ngoại hay khả kiến. Detector này có tính chọn lọc vì chỉ phát hiện được các chất tan hấp thụ tia UV hay khả kiến. Dung môi dùng trong trường hợp này phải hấp thụ rất ít hay không hấp thụ tia bức xạ và chỉ được phép chứa một lượng cực nhỏ các tạp chất hấp thụ trong vùng tử ngoại.
Các detector UV-Vis có thể có bước sóng cố định hoặc thay đổi được. Detector có bước sóng biến đổi có thể vận hành trong khoảng bước sóng 190- 700nm. Detector này có độ nhạy khá cao, khoảng 1 µg/ml [9].
- Detector dãy diod quang (PDAD)
Đây là detector được phát triển từ detector UV-Vis. Hiện nay, detector này được dùng rộng rãi nhất trong lĩnh vực kiểm nghiệm và nghiên cứu. Tia đa sắc sau khi đi qua tế bào đo mang chất mẫu được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một dãy diod quang. Mỗi diod quang nhận một tia tương ứng với một băng có độ dài sóng hẹp. Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thụ ở một bước sóng nhất định. Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong một giây bởi một bộ phận vi xử lý.
Ưu điểm của detector này là tạo được phổ UV của các chất phân tách trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ tương ứng của píc sắc ký với phổ của một ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn biết trước.
1.4.2.5. Các thông số đặc trưng của HPLC
- Thời gian lưu: của một chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện píc của chất tan trên sắc ký đồ. Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của một chất tan, trong điều kiện sắc ký nhất định thời gian lưu là một hằng số đối với một chất tan Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau có thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo, và tính chất của chất đó. Trong một phép phân tích nếu thời gian lưu quá nhỏ thì sự tách kém, còn thời gian lưu quá dài (tR> 20 phút) thì píc bị doãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài [9], [17].
26
Hình 1.9: Sắc ký đồ và các thông số đặc trưng.
: thời gian chết
, : thời gian lưu của hai chất 1 và 2
, : chiều rộng của píc 1 và 2
h: chiều cao pic
: thời gian lưu
Để định tính cần so sánh thời gian lưu của píc chất đó trên sắc ký đồ của dung dịch thử với thời gian lưu của chất chuẩn trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn [5].
- Hệ số phân bố: là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh và trong pha động tại thời điểm cân bằng:
=
Khi nồng độ chất tan không quá cao thì K là một hằng số, chỉ phụ thuộc vào bản chất các pha, chất tan và nhiệt độ. Đối với một chất, K càng lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh nên sẽ di chuyển chậm và ngược lại [17].
- Hệ số dung lượng k’: biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong pha động với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất
27
tan trong pha động ở thời điểm cân bằng. Cần chọn cột, pha động sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8 [5].
- Độ chọn lọc α:
Độ chọn lọc α cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký, khi hai chất A, B có và khác nhau thì mới có khả năng tách, mức độ tách biểu thị độ chọn lọc α:
α = = với điều kiện >
α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng (α từ 1,5 đến 2,0 là tối ưu) [17].
- Số đĩa lý thuyết N: là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký như một lớp pha tĩnh có chiều cao là H, lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo một trong ba công thức sau:
= 16 × hoặc = 5,54 × (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
, hoặc =
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ, tối thiểu là 1000 [17].
- Độ phân giải : biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong một điều kiện sắc ký đã cho.
=2( − ) +
≤ 0,4: dạng píc không rõ, bị chồng phủ lên nhau nhiều.
≤ 0,5- 1: hai píc tách nhau, có thể xác định được nhưng bị chồng phủ nhiều hay ít.
≤ 1: hai píc có thể bắt đầu tách nhau nhưng chưa hoàn toàn. ≤ 1,25: hai píc hầu như tách khỏi nhau hoàn toàn.
- Hệ số bất đối xứng: hệ số bất đối xứng thường dùng để đánh giá tính cân đối của pic.
28
= / 2 / : độ rộng píc ở 1/20 chiều cao.
f: khoảng cách từ đường cao của píc đến chân trước của píc ở 1/20 chiều cao. Thông thường , trị số chấp nhận được ở trong khoảng 0,8- 1,5. Hiện tượng píc kéo đuôi có thể là do tương tác giữa chất cần phân tích với pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. píc kéo tuyến trước có thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột. Khi sự bất đối xứng của píc càng gia tăng, tính thích hợp và độ chính xác sẽ càng trở nên kém tin cậy hơn [9].
1.4.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất trong cao
1.4.3.1. Phươngpháp phân tích resveratrol
Các nghiên cứu về phương pháp phân tích resveratrol trong nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau đã công bố ở việt Nam cũng như trên thế giới cho thấy phương pháp chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao vớidetector UV hoặc detector khối phổ. Đây là hai phương pháp chính được sử dụng để định lượng resveratrol.
Nuno Ratola, Joaquim Luís Faria và Arminda Alves đã sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để nghiên cứu phân tích và định lượng resveratrol trong rượu vang nho ở vùng Alentejo Bồ Đào Nha. Với điều kiện sắc ký: cột Lichrokart C18 của Merck (5 µm, 4,6 × 250 mm), pha động nước : acetonitril : acid acetic tỷ lệ ( 70 : 29,9 : 0,1), tốc độ dòng 1ml/ phút, thể tích tiêm 20 µl, detector 310 nm. Kết quả nghiên cứu xác định được sự có mặt của resveratrol trong tất cả 47 mẫu rượu vang đỏ với nồng độ khác nhau, trong khoảng từ 0,13 đến 2,64 mg/ l [41].
Laszlo Mark, Martin S. Pour Nikfardjam, Peter Avar và Robert Ohmacht đã xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC để phân tích định lượng trans- resveratrol và trans-piceid trong rượu vang nho Hungary. Điều kiện sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18 (6µm, 250× 4,6 mm), pha động sử dụng là hỗn hợp acid axetic : methanol : nước (10: 90: 1) làm dung môi A, hỗn hợp methanol- acid acetic- nước (90: 10: 1) làm dung môi B, tốc độ dòng 1,5 ml/ phút vớichế độ chạy gradient,
29
detector ở 306 nm. Phương pháp phân tích được thẩm định tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, độ lặp lại, độ thu hồi. Khoảng tuyến tính của nồng độ từ 0,01 đến 101 mg/l với R2> 0,999; giới hạn phát hiện là 205 pg, độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích píc được xác định với độ lệch chuẩn lần lượt là 3,9% và 2,12%. Độ thu hồi trong khoảng 93,8% đến 100,8% [34].
Tao Yi và cộng sự sử dụng phương pháp HPLC với detector PDA và ESI/MS để phân tích định tính, định lượng thành phần hoá học chính trong thân rễ khô cốt khí củ. Dựa trên sắc ký đồ riêng rẽ trên cột Altima C18 sử dụng pha động acid acetic và acetonitril, 9 thành phần bao gồm stilben, stilben glycosid, anthraquinon, anthraquinon glycosid được xác định bằng phân tích ESI/MS và 7 thành phần được xác định bởi HPLC- DAD. Các giá trị thẩm định đầy đủ của phương pháp bao gồm độ nhạy, độ tuyến tính, độ lặp lại, và độ tìm lại đã được kiểm soát. Khoảng nồng độ tuyến tính từ 1- 200 mg/l với R2> 0,999, giới hạn phát hiện trong khoảng 0,51 đến 1,57 ng. Độ lặp lại được xác định với giá trị RSD < 2,2% [50].
Ngoài ra phương pháp HPLC – UV/ DAD cũng được ứng dụng trong phân tích thường quy rượu vang đỏ, vỏ nho và các sản phẩm phụ làm rượu vang để xác định trans-resveratrol và quercetin.
Như vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV hoặc detector khối phổ là phương pháp chính được ứng dụng để phân tích resveratrol cho kết quả nhanh nhạy và chính xác.
1.4.3.2. Phương pháp phân tích hesperidin
Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới phân tích hesperidin trong dược liệu và trong dịch sinh học đã công bố cho thấy phương pháp phân tích chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV hoặc detector khối phổ.
Để đánh giá sự thay đổi nồng độ của hesperidin trong huyết tương chuột sau khi dùng thuốc đường uống.Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà Ly và cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector UV để định lượng hesperidin trong huyết thanh và huyết tương chuột. Dung môi pha động sử dụng là acetonitril và nước, chương trình rửa giải gradient với tốc độ dòng 0,5
30
ml/phút, quan sát tại bước sóng 280 nm. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) trong phân tích hesperidin lần lượt là 0,44 và 1,46 μg/ml. Độ thu hồi của hesperidin từ mẫu huyết tương là 94,4 ± 2,4% và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích píc là 2,0%. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp chiết lỏng - lỏng với dung môi chọn lọc ethyl acetat để loại tạp và làm giàu mẫu phân tích. Sử dụng phương pháp xây dựng được, nhóm nghiên cứu đã định lượng nồng độ hesperidin trong huyết tương chuột tại nhiều thời điểm khác nhau sau uống thuốc, qua đó xây dựng đường cong nồng độ - thời gian và tính toán các thông số dược động học của hesperidin [14].
R. Omidbaigi, M. Faghih Nasiri và Z. Bashiri Sadr đã sử dụng phương pháp HPLC với detector UV để theo dõi sự thay đổi hàm lượng Hesperidin trong quả các loài cam quýt trong suốt quá trình quả chín để xác định thời điểm thu hoạch tốt nhất, nghiên cứu sử dụng cột sắc ký pha đảo Bondapak C18 (300× 3,9 mm) pha động acetonitril và nước với tỷ lệ (21,5: 78,5) tốc độ dòng 2ml/ phút, thể tích tiêm mẫu 5 µl detector 258nm. Kết quả đã xác định được hàm lượng hesperidin và nhận thấy hàm lượng hesperidin tăng liên tục từ lúc đậu quả đến 40 ngày tuổi [42].
Jaime A. Y´ a˜ nez, Xiao Wei Teng, Kathryn A. Roupe, Neal M. Davies sử dụng phương pháp HPLC để phân tích hesperidin trong dịch sinh học. Điều kiện sắc ký gồm hệ thống HPLC shimadzu, cột Chiralpak AD-RH(5 µm, 150 x 4,6 mm), pha động gồm acetonitril, nước và acid phosphoric với tỷ lệ (42: 58: 0,01), lọc và khử khí giảm áp suất trước khi sử dụng, tốc độ dòng 0,8 ml/ phút, bước sóng phát hiện ở 298 nm. Phương pháp được thẩm định các đặc tính: tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác và độ thu hồi. Tính tuyến tính của nồng độ trong khoảng 0,5 đến 100 µg/ ml với hệ số R2 = 0,999. Giới hạn phát hiện của hesperidin trong dịch sinh học là 0,5 mg/ml. Độ thu hồi trong khoảng từ 98,3 đến