- Tính đặc hiệu:
Tính đặc hiệu được chứng minh thông qua việc phương pháp phân tích sử dụng không bị ảnh hưởng bởi tạp chất có trong mẫu thử. Tiến hành phân tích một mẫu thử có chứa chất phân tích kèm theo những hàm lượng thích hợp các tạp chất và chứng minh rằng kết quả định lượng không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử.
- Độ đúng:
Độ đúng của phương pháp được xác định ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi nồng độ được thực hiện lặp lại 3 lần.
Độ đúng được khảo sát trên mẫu cao đặc hỗn hợp bằng phương pháp thêm chuẩn: thêm một lượng chính xác chất chuẩn vào trong mẫu thử sao cho nồng độ của hoạt chất vẫn nằm trong khoảng nồng tuyến tính đã khảo sát.
Định lượng tìm lại hàm lượng chất đã thêm vào để xác định độ thu hồi.
Độ thu hồi (%) = hàm lượng tìm thấy
hàm lượng thực cho vào x 100
Thông thường độ thu hồi phải đạt 98- 102%. - Độ lặp lại:
Đánh giá độ phù hợp giữa các kết quả kiểm nghiệm khi phương pháp được áp dụng để phân tích lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu. Độ lặp lại của phương pháp phân tích được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của nhiều lần đo đạc.
Cách xác định: tiến hành định lượng 6 lần ở nồng độ thử nghiệm. Tính độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD thường ≤ 2%.
39 - Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính:
Đánh giá mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic, tính tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R. Để đảm bảo yêu cầu về tính tuyến tính, thông thường R ≥ 0,998.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp pha trong MeOH có nồng độ resveratrol trong khoảng 16 -68 μg/ml; nồng độ hesperidin nằm trong khoảng 15- 62 μg/ml và nồng độ epigallocatechin gallat nằm trong khoảng 22- 95 μg/ml. Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được về mặt định tính nhưng không nhất thiết phải là định lượng được trong điều kiện cụ thể. Tại nồng độ phân tích có tỷ số tín hiệu trên nhiễu đường nền (S/N <3) được coi là giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích.
Giới hạn định lượng (LOQ): lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với độ đúng và độ chính xác thích hợp. LOQ được chấp nhận nếu đáp ứng của chất phân tích phải gấp ít nhất 10 lần tỷ số giữa độ lệch tín hiệu nền lân cận và độ nhạy của chất đó (LOQ = 3,3 x LOD).
Tiến hành: pha riêng biệt các dung dịch chuẩn resveratrol, hesperidin, epigallocatechin gallat trong MeOH, để được dung dịch chuẩn resveratrol có nồng độ 16 μg/ml; dung dịch chuẩn hesperidin có nồng độ 15 μg/ml; dung dịch chuẩn epigallocatechin gallat có nồng độ 22 μg/ml. Tiến hành phân tích theo các điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Sau đó giảm dần nồng độ bằng cách pha loãng gấp đôi và phân tích theo điều kiện sắc ký đã chọn.