Tham khảo tài liệu và các nghiên cứu đã công bố về phương pháp HPLC định lượng các hoạt chất trong cao, lựa chọn chương trình sắc ký thích hợp nhất, thông thường có thể tham khảo được lựa chọn cột, pha động, bước sóng phân tích. Dựa vào cấu trúc phân tử và tính chất hóa lý (độ tan, tính chất phân cực, tính chất hấp thụ ánh sáng...) của resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat để tìm được điều kiện sắc ký phù hợp như pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu, nồng độ dung dịch thử và dung môi pha mẫu.
- Cột sắc ký: qua tham khảo các tài liệu [27],[28],[49],[53] lựa chọn cột pha đảo C18, sử dụng cột Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6mm; 5µm).
- Lựa chọn pha động: Do cả 3 chất resveratrol, hesperidin và epigallocatechin gallat đều tan trong methanol, có khối lượng phân tử nhỏ (Mw< 2000) và thuộc loại không ion hoá nên đều có thể sử dụng phương pháp sắc ký phân bố pha đảo để định lượng các hợp chất này. Dựa vào các tài liệu tham khảo [27],[28],[49],[53], lựa chọn pha động là acetonitril và dung dịch acid formic 0,1%, khảo sát các tỷ lệ khác nhau để tìm tỷ lệ thích hợp (khả năng tách tốt, thời gian lưu phù hợp, píc cân đối...).
- Bước sóng: quét phổ UV-Vis lựa chọn bước sóng thích hợp, - Tốc độ dòng: khảo sát tốc độ trong khoảng 0,5 đến 1ml/ phút, - Thể tích tiêm mẫu: khảo sát trong khoảng 5 đến 15 μl.
- Pha dung dịch chuẩn gốc:
Cân chính xác khoảng10,6 mg chuẩn resveratrol; 10,5 mg chuẩn hesperidin và 15,2 mg chuẩn epigallocatechin gallatvào bình định mức 50 ml, hòa tan và pha loãng bằng MeOH vừa đủ đến vạch, trộn đều. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, pha loãng bằng MeOH để được dung dịch gốc có nồng độ resveratrol; hesperidin và epigallocatechin gallat lần lượt là 42,40 µg/ml; 38,55 µg/ml và 56,72 µg/ml, lọc qua màng lọc 0,45µm.
38 - Pha dung dịch thử:
Các mẫu cao: cân chính xác khoảng 0,20 g cao hỗn hợp vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml MeOH, lắc siêu âm trong vòng 15 phút, để nguội về nhiệt độ phòng, thêm MeOH vừa đủ 50 ml. Hút chính xác 5 ml dung dịch này vào bình định mức 25 ml, trộn đều và lọc qua màng lọc 0,45 µm.