Khảo sát hoạt tính và tinh sạch Protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae và Aspergillus Kawasaki trên môi trường bán rắn

Khảo sát hoạt tính và tinh sạch Protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae và Aspergillus Kawasaki trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

ĐẬU THỊ KIM DUNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006

NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY

SURVEYING ACTIVITY OF PROTEASE AND PURIFYING PROTEASE EXTRACTING FROM TWO FUNGAL SPECIES

ASPERGILLUS ORYZAE AND ASPERGILLUS KAWASAKI ON

SEMI SOLID MEDIUM

Graduation thesis Major : Biotechnology

Professors : Student :

PhD NGUYEN NGOC HAI ĐAU THI KIM DUNG Vice Professor-PhD NGUYEN TIEN THANG Term : 2002 - 2006 BA ĐO THI TUYEN

HCMC, 09/2006

iv

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến :

* Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

* Thầy Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hướng dẫn, giải đáp mọi thắc mắc của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

* Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn tất khóa luận này

* Anh Nguyễn Diên Sanh, anh Nguyễn Duy Long là những cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã hỗ trợ cũng như cung cấp cho em nhiều kiến thức xung quanh đề tài

* Các bạn lớp CNSH K28 đã động viên, giúp đỡ tôi những lúc khó khăn cũng như chia xẻ những vui buồn trong suốt thời gian học tập

* Các bạn phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

* Cuối cùng con xin cảm ơn bố mẹ đã, đang và mãi mãi là chỗ dựa vững chắc cả về tinh thần lẫn vật chất cho con niềm tin và động lực bước vào đời

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Đậu Thị Kim Dung, Đại học Nông Lâm Tp.HCM Tháng 9/2006 “KHẢO SÁT HOẠT TÍNH VÀ TINH SẠCH PROTEASE TỪ HAI CHỦNG NẤM MỐC

 Ở cả hai chủng, nồng độ muối 65% độ bão hòa và tỷ lệ cồn 1 : 4 là tối ƣu để tủa protease

 Protease của cả hai chủng hoạt động mạnh nhất ở pH = 7 và nhiệt độ 470C

 Hoạt tính protease của Aspergillus oryzae cao hơn hoạt tính của Aspegillus kawasaki

MỤC LỤC

Bìa i Trang tựa ii

2.1 Khái quát chung về enzyme 3

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3

2.1.2 Định nghĩa về enzyme 5

2.1.3 Phân loại enzyme 6

2.1.4 Hoạt tính và các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme 7

2.2 Khái quát chung về enzyme protease 11

2.2.1 Định nghĩa enzyme protease 11

2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease 12

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease 14

2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15

2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 15

2.3.1.1 Phân loại 15

2.3.1.2 Đặc điểm 15

2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt 16

2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease 18

2.5.1 Trích ly enzyme 19

2.5.2 Quá trình tủa 20

2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký 22

2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 27

3.3.1.3 Thí nghiệm 3 : Xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của protease 37

3.3.1.4 Thí nghiệm 4 : Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel 37

3.3.1.5 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lượng phân tử enzyme bằng phương pháp điện di SDS – PAGE 41

3.4 Phương pháp xử lý số liệu 44

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 45

4.1 Hàm lượng và hoạt tính của dịch chiết enzyme thô 45

4.2 Nồng độ muối (NH4)2SO4 tối ưu cho việc tủa protease 45

4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 46

4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 48

4.3 Tỷ lệ cồn tối ưu cho việc tủa protease 49

4.3.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 49

4.3.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 51

4.4 So sánh việc tủa enzyme trong cồn 960 và tủa bằng muối (NH4)2SO4 53

4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme protease 54

4.5.1 pH tối ưu 54

4.5.1.1 Kết quả đối với chủng Aspergillus oryzae 54

4.5.1.2 Kết quả đối với chủng Aspergillus kawasaki 54

4.5.2 Nhiệt độ tối ưu 55

4.5.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae 55

4.5.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki 56

4.6 Kết quả tinh sạch qua lọc gel 56

4.6.1 Kết quả đối với Asp.oryzae 57

4.6.2 Kết quả đối với Asp.kawasaki 59

4.7 So sánh hoạt tính riêng protease qua các lần tinh sạch của hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki 62

4.7.1 Tủa protease bằng muối 62

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ CÁC THUẬT NGỮ

Asp.oryzae : Aspergillus oryzae Asp.kawasaki : Aspergillus kawasaki

CP : Chế phẩm (Chế phẩm enzyme dạng bột thô do phòng vi sinh ứng dụng Viện Sinh Học Nhiệt Đới cung cấp)

ix

HT : Hoạt tính HTR : Hoạt tính riêng TCA : Trichloacetic acid A.U : Độ hấp thụ

mS/cm : Milisiemens/cm (đơn vị đo lường độ dẫn điện) UI : Đơn vị hoạt tính enzyme

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính của protein 22 Bảng 3.1 Đường chuẩn Albumin 32

Bảng 4.11 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo pH 54

Bảng 4.12 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo pH 55

Bảng 4.13 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.oryzae theo nhiệt độ 55

Bảng 4.14 Sự thay đổi hoạt tính enzyme protease của Asp.kawasaki theo nhiệt độ 56

Bảng 4.15 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus oryzae qua sắc ký lọc gel 59

Bảng 4.16 Kết quả tinh sạch protease của Aspergillus kawasaki qua sắc ký lọc gel 61

Bảng 4.17 So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối 62

xi

bằng cồn 62

Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của những protein trong thang 65

Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae 66

Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lượng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki 66

DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Đường biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến tốc độ

xii

Hình 2.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ

cơ chất 8

Hình 2.3 Công thức cấu tạo enzyme protease 11

Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi 16

Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trường CBS – MEA2% 16

Hình 2.6 Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký 23

Đồ thị 4.2 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối 47

Đồ thị 4.3 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối 49

Đồ thị 4.4 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng cồn 51

Đồ thị 4.5 Hàm lượng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng cồn 52

xiii

Đồ thị 4.7 Ảnh hưởng của pH đối với hoạt tính enzyme protease từ Asp.kawasaki 55 Đồ thị 4.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.oryzae 55 Đồ thị 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính protease từ Asp.kawasaki 56

Đồ thị 4.10 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protein bằng muối 62 Đồ thị 4.11 Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bước tinh sạch khi tủa protease bằng cồn 63 Đồ thị 4.12 Sự tương quan giữa Lg của trọng lượng phân tử và giá trị Rf 65

Có bản chất là một protein, enzyme không chỉ có thể thực hiện khả năng xúc tác sinh học bên trong cơ thể mà còn có thể thực hiện các xúc tác bên ngoài cơ thể khi tạo cho chúng một điều kiện thích hợp để hoạt động Bởi lẽ đó, trong vòng vài chục năm gần đây việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzyme trên thế giới đã phát triển với tốc độ rất mạnh mẽ

Nhân tố quan trọng có tác dụng thúc đẩy cho sự phát triển của nền công nghiệp sản xuất enzyme đó là khả năng to lớn của vi sinh vật - những nhà máy chế tạo enzyme Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh do đó có khả năng tạo ra một lượng enzyme vô cùng lớn trong một thời gian ngắn, đồng thời enzyme do chúng tạo ra có hoạt lực cao và chúng ta có thể tận dụng các phế thải của ngành khác để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme

Protease là một trong những nhóm enzyme có nhiều ứng dụng quan trọng và phổ biến trong đời sống Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học…Hoạt tính của enzyme nói chung và của protease nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Điều kiện tối thích để mỗi loại enzyme hoạt động là khác nhau Do đó, để sử dụng enzyme hiệu quả nhất cần khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu cho hoạt động của enzyme đó Nhằm mục đích khảo sát hoạt tính protease và tìm hiểu về kĩ thuật sắc ký lọc gel dùng

trong việc tinh sạch enzyme, chúng tôi thực hiện đề tài :“Khảo sát hoạt tính và tinh

sạch enzyme protease từ hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus

kawasaki trên môi trường bán rắn”

Aspergillus oryzae từ lâu đã được dùng như là nguồn vi sinh vật được nuôi

cấy để thu nhận enzyme protease Tuy nhiên, đối với Aspergillus kawasaki thì người ta

chỉ biết đến nhƣ là nguồn vi sinh vật để thu nhận amylase Do đó, qua đề tài, chúng ta

có thể đánh giá đƣợc hiệu quả sử dụng protease của chủng Aspergillus kawasaki

1.2 Mục đích nghiên cứu

 Xác định các điều kiện thu nhận và đặc tính của enzyme protease từ hai chủng

nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspgillus kawasaki

 So sánh hoạt tính enzyme protease giữa hai chủng nấm mốc Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki

PHẦN 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát chung về enzyme

2.1.1 Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme

Từ trước thế kỷ 17, khi loài người hoàn toàn chưa hiểu biết gì về ezyme, người ta đã biết sử dụng rộng rãi các quá trình enzyme trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, làm bia, rượu,…Việc ứng dụng enzyme trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy và sử dụng enzyme thông qua hoạt động sống của tế bào vi sinh vật

Ngay từ thế kỷ 17, các nhà khoa học đã quen dùng từ “ferment” do nhà khoa học người Hà Lan Van Heltmon đề xướng Theo nghĩa tiếng La Tinh thì “fermentatio” nghĩa là sự lên men, đó cũng là nguồn gốc của từ “ferment” Theo ý kiến của ông, yếu tố tham gia tích cực vào quá trình lên men rượu là “ferment” Yếu tố đó là gì thì còn là điều bí ẩn Các nhà khoa học đã không vừa lòng với hiểu biết này và đã đi sâu vào thực nghiệm, quan sát, mô tả

Đến nửa cuối thế kỷ 18 bắt đầu có những thí nghiệm đầu tiên thô sơ và đơn giản chứng minh tác dụng của men tiêu hóa được nhà tự nhiên học người Pháp Réaunur tiến hành vào năm 1713 và được Spallanzani người Ý khẳng định lại một cách chặt chẽ hơn vào năm 1783 với tác dụng của dịch dạ dày phân hủy thịt

Năm 1814, viện sĩ viện hàn lâm khoa học Petecbua là Kirchov người Nga làm thí nghiệm chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ 40 – 600C

Năm 1817 hai nhà khoa học Manaxenia (Nga) và Buchner (Đức) đã làm thí nghiệm thành công quá trình lên men bằng chất dịch vô bào từ nấm men Nhà sinh lý học thực vật K.Tinniriazev đã viết “Không còn nghi ngờ gì nữa, lần đầu tiên người ta đã chứng minh được rằng hiện tượng lên men chung quy chỉ là một quá trình hóa học, nó có thể dễ dàng lập lại ngoài cơ thể sống nhờ những enzyme hòa tan chiết xuất từ những tế bào đã bị phá hủy cấu trúc”

Năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp là A.Payen và J.Person thu nhận được chế phẩm enzyme amylase ở dạng kết tủa bằng cách thêm cồn vào dịch chiết từ hạt lúa nảy mầm Kết tủa này có khả năng phân giải tinh bột thành đường và được gọi

là diastase Đây là thực nghiệm đặt nền móng cho các tiến bộ trong lĩnh vực enzyme vào nửa sau thế kỷ 19

Năm 1835, Berzelius lần đầu tiên đã đề ra khả năng giải thích tác dụng của enzyme trên cơ sở hóa học Ông gọi hiện tượng làm tăng quá trình phản ứng là sự xúc tác và chất gây ra hiện tượng này là chất xúc tác

Năm 1856, Pasteur đã tiến hành nghiên cứu bản chất của quá trình lên men rượu Theo ông, chính nấm men hay vi khuẩn lên men mà ta nhìn thấy dưới kính hiển vi là nguyên nhân gây ra hiện tượng lên men rượu Ông cho rằng chỉ có nấm men hay vi khuẩn còn sống mới có thể thực hiện quá trình lên men Từ đó dẫn đến hai khái niệm mâu thuẫn nhau : men hữu hình (ferment hữu hình ) và men không nhìn được (ferment hòa tan)

Năm 1862, nhà khoa học người Nga Danilevxki đã sử dụng một kỹ thuật đặc

biệt để tách chiết trypsine ra khỏi hỗn hợp với amylase trong dịch tụy bằng kỹ thuật “phương pháp hấp thụ chọn lọc enzyme” (tức là gắn enzyme lên bề mặt chất đỡ) và “phản hấp thụ” (nghĩa là giải phóng enzyme ra khỏi bề mặt chất đỡ) rồi kết tinh Hiện nay chúng ta gọi đó là một dạng của “kỹ thuật sắc ký ”

Năm 1894, nhà khoa học người Pháp G.Bertrand phát hiện ra một loại enzyme mới là enzyme oxy hóa với việc phát hiện ra enzyme lacasae trong nhựa mủ cây sơn ta

Rhus succedanea

Từ những thành tựu ban đầu đó, enzyme bắt đầu được chú ý nghiên cứu nhiều hơn vào cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 Liên tiếp trong những năm 1930, 1931 hai nhà khoa học D.Northop và M.Kunitz đã tách được pepsine và trypsine dưới dạng tinh thể (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982)

Năm 1913, hai nhà khoa học L.Michalis và Menten đã nghiên cứu cơ chế xúc tác nhờ enzyme có sử dụng chất đồng vị, sử dụng phương pháp quang học và phương pháp hóa học nghiên cứu các nhóm hoạt động của enzyme đã đem lại cho chúng ta “phương trình Michalis-Menten” nổi tiếng trong nghiên cứu động học của enzyme (Nguyễn Hữu Chấn, 1984)

Hiện nay enzyme đã trở thành một ngành khoa học mũi nhọn phát triển rất nhanh trên thế giới phân nhánh rất nhiều và liên quan chặt chẽ tới các ngành như hóa lý, hóa sinh, vi khuẩn, vi sinh học, sinh lý, y học,…Hàng năm trên thế giới xuất bản hàng chục nghìn công trình nghiên cứu về cơ chế tác dụng của enzyme, các phương

pháp tách chiết và tinh chế, sự điều hòa về rối loạn hoạt động của cơ thể ở trạng thái sinh lý và bệnh lý

2.1.2 Định nghĩa về enzyme

Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có hoạt tính xúc tác sinh học, do tế bào sống tiết ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác (Nguyễn Tiến Thắng, 2004)

Các enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho các quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, có trật tự, theo những chiều hướng xác định Pavlôv đã nói : “Hoạt động đầu tiên của enzyme là biểu hiện đầu tiên của hoạt động sống Không có sự sống nào lại không có quá trình enzyme” Điều này càng làm sáng tỏ định nghĩa của Anghen : “Sự sống, đó là phương thức tồn tại của thể protein” (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982)

Enzyme có trong mọi tế bào, mọi mô của mọi sinh vật nhưng mỗi loại mô, mỗi loại tế bào thường có những hệ thống enzyme đặc biệt Các enzyme không chỉ tham gia xúc tác các phản ứng sinh học trong cơ thể sống mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (in vitro) (Nguyễn Hữu Chấn, 1984)

Enzyme có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất thấp và nhiệt độ bình thường của cơ thể Trong khi đó các chất xúc tác hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Hơn nữa, các enzyme có khả năng chọn lựa cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982)

Các loại enzyme trong cơ thể được tổng hợp, hoạt động một cách rất hài hòa để sao cho các chất ban đầu được chuyển hóa đến sản phẩm cuối cùng thành một mắt

xích hoàn chỉnh Sự trục trặc nào đó ở một trong toàn bộ mắt xích này sẽ làm rối loạn

cho cả hệ thống Trong khi đó điều khiển tổng hợp và hoạt động của enzyme lại do gen Mỗi một gen chịu trách nhiệm điều khiển tổng hợp một enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh học có thể tóm tắt như sau :

 Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

 Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất cao

 Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

 Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

 Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme được tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme

 Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay các nhà khoa học đã tìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại (Nguyễn Đức Lượng,

2002)

2.1.3 Phân loại enzyme

Khi số lượng enzyme được phát hiện còn ít, người ta đặt tên enzyme theo ý thích từng người tìm ra nó Dần dần theo thời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày càng nhiều nên cần có một hệ thống phân loại theo quy ước quốc tế Enzyme được phân loại theo tính chất của nó, được xếp vào từng nhóm nhỏ tương ứng với các enzyme có bản chất tương tự nhau, làm cho việc tìm hiểu và nghiên cứu trở nên dễ dàng hơn

Theo quy ước quốc tế, tên gọi của enzyme thường được đặt theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia Theo đó, tên enzyme thường có hai phần Phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân các phản ứng Tuy nhiên, có nhiều enzyme theo thói quen vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống như trypsine, pepsine

Năm 1930, Hiệp Hội Hóa Sinh Quốc Tế (IOB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và được đánh số thứ tự từ một đến sáu Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp Mỗi lớp lại chia làm nhiều tổ, mỗi tổ có nhiều nhóm Chính vì thế theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thường có bốn số : số thứ tự một chỉ lớp, số thứ tự hai chỉ tổ, số thứ ba chỉ nhóm, số thứ tư chỉ enzyme Tên của các lớp, tổ và nhóm như sau :

I Oxydoreductase a Dehydrogenase b Oxydase

c Oxygenase d Peroxydase II Transferase

a Acyltransferase b Glucosyltransferase c Aminotransferase d Phosphotransferase III Hydrolase

a Peptide hydrolase b Lipase

IV Liase

a Pyruvate decarboxylase b Fumarate hydrolase V Isomerase

Tốc độ phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như nồng độ enzyme, bản chất và nồng độ của các chất phản ứng (cơ chất), nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa enzyme (Lê Ngọc Tú và ctv, 1982)

2.1.4.2 Các yếu tố ảnh huởng đến vận tốc phản ứng enzyme a) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc bậc nhất vào nồng độ enzyme Đường biểu diễn có dạng như ở hình 2.1

Km : Hằng số Michalis, là nồng độ cơ chất ứng với vận tốc bằng 1/2 vận tốc vmax Hình 2.2 : Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất

c) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme và tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu

Nếu đưa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đó enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính

V

[E] V = k[E]

Ngược lại, ở nhiệt độ 00C, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính enzyme sẽ tăng dần đến mức tối ưu

Khi khảo sát vận tốc ban đầu của phản ứng theo nhiệt độ (in vitro), người ta thấy xuất hiện hai kỳ (pha) riêng biệt tương ứng với hai hiện tượng khác nhau :

 Ở nhiệt độ thấp (từ 0 – 400C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lượng cho phản ứng

 Ở nhiệt độ cao sau đó (tùy thuộc vào từng enzyme, ở vào khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein Đa số enzyme bị mất hoạt tính ở 80 – 1000

C

Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trường

d) Ảnh hưởng của pH

Sự thay đổi pH gây nên :

 Sự biến đổi ion hóa của các nhóm chức năng trên chuỗi polypeptid của enzyme, do đó làm thay đổi điện tích cần thiết cho sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất và sự duy trì cấu hình ba chiều nguyên thủy của chuỗi polypeptid của enzyme

 Sự thay đổi mức độ ion hóa của cơ chất, điều này cho phép hoặc ngăn cản sự tạo thành enzyme – cơ chất trong trường hợp phản ứng đòi hỏi cơ chất phải ở dưới dạng ion

Như vậy, hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường Đó là vì pH môi trường có ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức chất enzyme – cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của enzyme

Người ta có thể xác định một giới hạn pH tối ưu cho hoạt động của một enzyme Ngoài pH tối ưu, vận tốc phản ứng giảm đi nhanh chóng Điều này cho thấy tầm quan trọng của môi trường phản ứng trong quá trình nghiên cứu các phản ứng enzyme in vitro

Mỗi một enzyme có một pH tối ưu khác nhau, có thể rất acid (từ 1,5 -2), hoặc rất kiềm (9,5 – 10) pH tối ưu của đa số các enzyme vào khoảng chung quanh giá trị trung tính (6 – 8) Tuy nhiên pH tối ưu của một enzyme cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như bản chất và nồng độ cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ

2.1.5 Nguồn thu nhận và vai trò của enzyme trong đời sống 2.1.5.1 Nguồn thu nhận

Enzyme được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : động vật (pepsin từ dạ dày, trypsin từ tụy tạng…), từ thực vật (amylase từ thóc nảy mầm, bromelin từ thơm…) Tuy nhiên không thể dùng hai nguồn này làm nguyên liệu để sản xuất với quy mô công nghiệp lớn các chế phẩm enzyme nhằm thỏa mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Như vậy trong các nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn…) là dồi dào và đầy hứa hẹn Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa các enzyme từ động vật và thực vật :

 Vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với một lượng lớn và có thể mở rộng để sản xuất tới phạm vi cần thiết, đồng thời việc thu chế phẩm cũng dễ dàng và có thể thỏa mãn trong một mức độ lớn nhu cầu của các ngành công nghiệp khác nhau

 Hệ enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú Do đó vi sinh vật có thể đồng hóa bất kỳ chất nào trong thiên nhiên Trong khi đó có nhiều chất mà thực vật và động vật không thể đồng hóa được

 Enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất

 Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quá trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, thao tác thuận lợi, hiệu suất thu hồi cao

 Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật dễ kiếm và rẻ tiền Đa số vi sinh vật cho enzyme thường có khả năng phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền như các phụ phế liệu, phế phẩm của các nghành sản xuất

 Ưu việt lớn của sự thu enzym từ vi sinh vật là có khả năng tăng cường sinh tổng hợp các enzym nhờ chọn giống khi tạo được những biến chủng có hoạt lực cao Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động môi trường, có khả năng thích ứng với nguồn dinh dưỡng Vì vậy, khi thay đổi điều kiện sống của vi sinh vật hoặc tác động lên chúng bằng các tác nhân khác nhau có thể thay đổi dễ dàng hệ enzym cũng như hoạt tính của chúng và tăng tối đa sự sinh tổng hợp các enzym trong vi sinh vật nuôi

cấy Điều đó cho phép ta có thể tạo được những enzym theo ý muốn, dễ dàng thu nhận được enzym có độ thuần khiết cao

2.1.5.2 Vai trò

Cùng với những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lí thuyết về enzym, các nghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả cao Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong hoá phân tích để định tính, định lượng các chất trong nông nghiệp, y học, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp nhẹ như công nghiệp dệt, công nghiệp da

 Trong y học có thể sử dụng enzym tinh chế để chữa bệnh, sản xuất các sinh tố và các chất kháng sinh

 Sử dụng chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nông nghiệp sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạt trước khi gieo

 Trong công nghiệp thực phẩm, chế phẩm enzym được sử dụng khá rộng rãi trong nhiều ngành chế biến khác nhau : chế biến thịt, cá, sữa, công nghiệp sản xuất bánh mì và các thứ bánh kẹo khác Sử dụng chế phẩm enzym thường làm tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể tái tạo hương vị của các loại rau quả tươi sau khi chế biến Ngày nay, người ta cũng đã đạt được nhiều kết quả trong việc sử dụng một số enzyme trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác

2.2 Khái quát chung về enzyme protease 2.2.1 Định nghĩa enzyme protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton

Hình 2.3 : Công thức cấu tạo enzyme protease

2.2.2 Lược sử phát triển các enzyme protease 2.2.2.1 Protease từ động vật

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả

Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt

Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này

Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy Đây là protease đầu tiên thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác

Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách được trypsine với amylase tụy tạng Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein

Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin) Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng

Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp tục nghiên cứu Vì vậy Wurtz được xem như là người đầu tiên tách chiết thành công protease từ thực vật (1879) Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có

chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận được một chế phẩm enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain

2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật

Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế

Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protesae Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease

2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease

Các enzyme protesae như đã nói ở trên được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau

 Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị

 Renin chỉ có ở ngăn thứ tư ở dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage

2.2.3.2 Từ thực vật

Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây như thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả

Ví dụ:

 Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh

 Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh

 Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả

2.2.3.3 Từ vi sinh vật

Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dược

Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ưu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản như sau :

 Protease serine

 Protease kim loại (metallo protease)

 Protease acid

 Protease tiol

2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease

Các protease nói chung cũng như protease vi sinh vật nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

 Trong sản xuất nước chấm : Nước mắm, tương, chao,…

 Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hương vị thịt sau khi chế biến,…

 Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,…

 Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ

 Trong hương mỹ phẩm : Người ta trộn một lượng nhỏ protease vào kem

xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ

+ Protease được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch

+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…

+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng

+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị tiêu hóa kém…

 Trong nông nghiệp : Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm

 Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu như phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý

2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae

2.3.1.1 Phân loại

Giới : Fungi

Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae

Giống : Aspergillus

Loài : Aspergillus oryzae

2.3.1.2 Đặc điểm

 Hình thái

Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển

rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi

Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên

môi trường CBS – MEA2%

 Điều kiện phát triển :

Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử : 45% Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58% Độ ẩm không khí : 85 -95%

pH môi trường : 5,5 - 6,5 Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C

2.4 Thu nhận enzyme protease từ phương pháp nuôi cấy bề mặt

Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng như các enzyme khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy : phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu Phương pháp bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc, phương pháp bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX Lượng

enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi cấy chìm Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng rất chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa + Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+ Enzym mới bắt đầu được hình thành

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt

 Giai đoạn 2 Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường

+ Môi trường được kết lại khá chặt + Độ ẩm môi trường giảm dần

+ Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi

+ Các loại enzym được hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ được tạo ra nhiều hơn

+ Lượng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất

 Giai đoạn 3 Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:

+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

+ Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C Trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzym sẽ giảm Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết

Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme Chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường) Người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh

2.5 Tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử enzyme protease

Quá trình tinh sạch enzyme được tóm tắt như sau : Chế phẩm enzyme

bằng sắc ký lọc gel

Kiểm tra độ tinh sạch,

xác định trọng lượng

phân tử

2.5.1 Trích ly enzyme

Toàn bộ khối lượng chế phẩm enzyme thô đã sấy được đem đi nghiền nhỏ Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào

Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nước nên sau khi nghiền mịn, người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone) Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan Nước thường dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C (Lương Đức Phẩm, 1998)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly :

 Tỷ lệ nước trích

Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nước để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nước trên chế phẩm khác nhau sẽ trích được lượng enzyme khác nhau Lượng nước dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lượng chế phẩm nấm mốc

 Thời gian trích

Enzyme thủy phân dễ tan trong nước, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích được nhiều enzyme hơn nhưng làm tăng lượng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút

 Nhiệt độ trích

Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhưng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C

Để tăng cường khả năng thu enzyme, chế phẩm được đánh tơi trước khi trích để đạt được kích thước hạt 1 – 5 mm Ngoài ra trong công nghiệp, thường dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ

Sản phẩm enzyme

tinh khiết

trích được nhiều lần Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lượng enzyme trong dịch chiết thu được

2.5.2 Quá trình tủa

Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Dung dịch enzyme thô thường chứa một lượng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này

Để làm được điều đó người ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa Tủa là phương pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bước ban đầu trong tinh sạch enzyme Bằng cách này người ta loại được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme

Độ hòa tan của enzyme được coi là kết quả của tương tác lưỡng cực của chất hòa tan với nước và tương tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nước bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate Nếu loại bỏ các tương tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thường gọi là tủa protein

Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền như trước thì được gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch

 Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối

Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại

Khi cho một lượng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp

Phương pháp này thường được sử dụng để tách chiết protein hòa tan Nó cũng được sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn có khuynh hướng kết tủa trước, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau

Như vậy với quá trình này ta có thể thu được protein mong muốn một cách tinh sạch hơn

b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường Do đó độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước (như acetone) vào dung dịch chứa protein

Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960

có nhiều thuận lợi do tương đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió

Có thể xảy ra hiện tượng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nước lại tiếp xúc

với dung môi Hiện tượng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme

Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ Người ta thường tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme

2.5.3 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp sắc ký

Sắc ký sinh học là phương pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng

Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein

Kích thước Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học

(tính đặc hiệu của ligand)

Sắc ký ái lực (Affinity Chromatography)

Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký

Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đưa vào thị trường sản phẩm thương mại SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác

 Nguyên tắc :

Lọc gel là phương pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký Kỹ thuật này dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :

a) Phân tách nhóm (Group separations)

Các thành phần của một mẫu được phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thước Sự phân tách nhóm được sử dụng để loại các phân tử lớn hay các phân tử tạp chất nhỏ (như đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm

b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution fractionation of biomolecules)

Các thành phần của cùng một mẫu được phân tách theo sự khác biệt về kích thước phân tử của chúng Phân tách với độ phân giải cao có thể được dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lượng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lượng phân tử

 Ưu và nhược điểm của sắc ký lọc gel a) Ưu điểm

Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trường khắc nghiệt

Sự phân tách có thể được thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cường độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm

Kỹ thuật này cho phép thu lại lượng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối

b) Nhược điểm

- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)

- Yêu cầu các cột có kích thước lớn tương đối so với lượng mẫu

- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử, thường khó đạt được sản phẩm tinh khiết hoàn toàn Vì lý do này, sắc ký lọc gel thường được sử dụng với những kỹ thuật khác nhau như sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ

 Một số thông số vật lý của phương pháp

Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lượng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, như vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lượt ra khỏi cột Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000 Da đều không chui vào hạt gel

Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50

Độ ngậm nước (Water Regain-WR) : Là trọng lượng nước mà 1g bột gel khô hút nước Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao quanh hạt Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột

Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trương nở trong nước G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô

Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ Kích thước hạt xác định bằng mesh hoặc đường kính hạt theo m Hạt có kích thước lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho

tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết quả tách thấp Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt Thường người ta chọn hạt gel có kích thước 100-200 mesh, 50-150 m

Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da

Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột

 Phân tách bằng sắc ký lọc gel

Để phân tách, môi trường lọc gel được nhồi trong cột để tạo nền nhồi Môi trường này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này được chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản ứng)

Nền nhồi được cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi được xem như phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, được xem như phase động Cần lưu ý rằng, mẫu được giải hấp một cách đồng nhất (isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách Tuy nhiên, bước rửa giải dùng loại đệm đang chạy thường bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lưu trong cột được dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp

4 Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thước lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột Các phân tử nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dưới đáy cột

5 Các phân tử lớn rời cột trước nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thước của chúng Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lượng dung môi bằng tổng thể tích cột (tương đương với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trường lọc gel

Hình 2.7 : Quá trình lọc gel

2.5.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme protease bằng phương pháp điện di SDS – PAGE

Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng

Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường

Kĩ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS

Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N, N ,N’, N’ - tetramethylenediamine (TEMED)

Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích thước của lỗ gel.Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại

SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol.Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường

Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết