Sắc ký sinh học là phƣơng pháp nhẹ nhàng để tinh sạch các phân tử sinh học, đặc biệt là protein mà vẫn duy trì hoạt tính của chúng. Các kỹ thuật sắc ký tinh sạch protein dựa vào các đặc tính vật lý của chúng.
Bảng 2.1 : Các kỹ thuật sắc ký dựa vào đặc tính vật lý của protein
Đặc tính Kỹ thuật
Điện tích Sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) Sự phân cực o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography)
o Sắc ký giấy.
o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography) o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC)
Kích thƣớc Sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học
(tính đặc hiệu của ligand)
Hình 2.6 : Nguyên tắc phân tách trong quá trình tinh sạch bằng sắc ký
Hơn 40 năm qua kể từ khi việc đƣa vào thị trƣờng sản phẩm thƣơng mại SephadexTM, kỹ thuật sắc ký lọc gel đã đóng một vai trò quan trọng trong việc tinh sạch enzyme, polysaccharide, nucleic acid, protein và các đại phân tử sinh học khác.
Nguyên tắc :
Lọc gel là phƣơng pháp đơn giản nhất trong tất cả các loại sắc ký. Kỹ thuật này dùng để tách những phân tử có kích thƣớc, trọng lƣợng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thƣớc đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và đƣợc giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. Kỹ thuật này có thể áp dụng theo hai cách :
a) Phân tách nhóm (Group separations)
Các thành phần của một mẫu đƣợc phân tách thành hai nhóm chính theo phạm vi kích thƣớc. Sự phân tách nhóm đƣợc sử dụng để loại các phân tử lớn hay các phân tử tạp chất nhỏ (nhƣ đỏ phenol khỏi dịch nuôi cấy) hoặc để loại muối hoặc trao đổi đệm.
b) Phân đoạn các phân tử sinh học với độ phân giải cao (High resolution fractionation of biomolecules)
Các thành phần của cùng một mẫu đƣợc phân tách theo sự khác biệt về kích thƣớc phân tử của chúng. Phân tách với độ phân giải cao có thể đƣợc dùng để cô lập một hoặc nhiều thành phần, để phân tách các monomer ra khỏi khối hỗn hợp, để xác định trọng lƣợng phân tử hoặc để phân tích sự phân bố theo trọng lƣợng phân tử.
Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel a) Ƣu điểm
Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt.
Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm.
Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối.
b) Nhƣợc điểm
- Chậm (tốc độ thấp = thời gian dài)
- Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu.
- Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ.
Một số thông số vật lý của phƣơng pháp
Giới hạn tách (Exclusion Limit-EL) : Là khối lƣợng phân tử (MW) nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ bị thổi cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ G-50 có giới hạn tách 30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn 30.000 Da đều không chui vào hạt gel.
Phạm vi tách (Fraction Range-FR) : Thí dụ Sephadex G-50 có giới hạn tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ đƣợc phân tách dễ dàng bởi Sephadex G-50.
Độ ngậm nƣớc (Water Regain-WR) : Là trọng lƣợng nƣớc mà 1g bột gel khô hút nƣớc. Thí dụ G-50 có WR là 5 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích cột.
Thể tích nền : Là thể tích cuối cùng mà 1g bột gel khô hấp thụ khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô.
Hạt gel : hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m) cho
tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100-200 mesh, 50-150 m. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thể tích trống : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Da.
Thể tích thổi : Là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột. Phân tách bằng sắc ký lọc gel
Để phân tách, môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột để tạo nền nhồi. Môi trƣờng này là một chất nền có lỗ ở dạng hạt hình cầu, loại hạt này đƣợc chọn vì tính ổn định về vật lý và hóa học của chúng, và tính trơ (thiếu các đặc tính hấp phụ và phản ứng).
Nền nhồi đƣợc cân bằng bằng dung dịch đệm, dung dịch này làm đầy các lỗ của chất nền và khoảng không giữa các hạt. Chất lỏng bên trong các lỗ đôi khi đƣợc xem nhƣ phase tĩnh và chất lỏng này ở trạng thái cân bằng với chất lỏng bên ngoài các hạt, đƣợc xem nhƣ phase động. Cần lƣu ý rằng, mẫu đƣợc giải hấp một cách đồng nhất (isocraticlly), nghĩa là không cần sử dụng các loại đệm khác nhau trong quá trình phân tách. Tuy nhiên, bƣớc rửa giải dùng loại đệm đang chạy thƣờng bao gồm ở thời điểm kết thúc của quá trình phân tách, làm cho việc loại bỏ bất kỳ loại phân tử nào còn lƣu trong cột đƣợc dễ dàng hơn và để chuẩn bị cột cho lần chạy kế tiếp.
Quá trình lọc gel
1. Các hạt hình cầu của môi trƣờng lọc gel đƣợc nhồi trong cột. 2. Mẫu đƣợc nạp vào cột.
3. Dung dịch đệm (phase động) và mẫu di chuyển qua cột. Các phân tử khuếch tán trong và ngoài các lỗ của chất nền (cũng đƣợc miêu tả nhƣ quá trình phân đoạn mẫu giữa phase động và phase tĩnh). Các phân tử nhỏ hơn di chuyển vào sâu trong chất nền hơn và do đó lƣu lại trong cột lâu hơn.
4. Khi dung dịch đệm di chuyển liên tục qua cột, các phân tử lớn hơn kích thƣớc lỗ gel không thể khuyếch tán vào trong các lỗ và di chuyển qua cột. Các phân tử nhỏ hơn khuyếch tán vào trong lỗ gel và bị trì hoãn trong quá trình di chuyển xuống dƣới đáy cột.
5. Các phân tử lớn rời cột trƣớc nhất sau đó là các phân tử nhỏ hơn theo trình tự kích thƣớc của chúng. Quá trình phân tách hoàn toàn xảy ra khi một lƣợng dung môi bằng tổng thể tích cột (tƣơng đƣơng với thể tích nền nhồi) di chuyển qua môi trƣờng lọc gel.