2.2.2.1 Protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa đƣợc nghiên cứu sớm hơn cả.
Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học ngƣời Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện đƣợc rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.
Năm 1836, Schwam đã quan sát đƣợc hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau ngƣời ta mới tách đƣợc enzyme này.
Năm 1857, Corvisart tách đƣợc trypsine từ dịch tụy. Đây là protease đầu tiên thu nhận đƣợc ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác.
Năm 1862, Danilevxki dùng phƣơng pháp hấp phụ trên colondion đã tách đƣợc trypsine với amylase tụy tạng. Phƣơng pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein.
Năm 1872, Hommarsten đã tách đƣợc chế phẩm chymotrypsine (renin). Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu. Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu. Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận đƣợc có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng.
2.2.2.2 Các protease từ thực vật
So với các protease từ động vật, các protease từ thực vật đƣợc phát hiện muộn hơn.
Năm 1874, Group – Besanez công bố đã nhận đƣợc protease từ hạt của một loại đậu. Họ cũng nhận thấy dịch chiết từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein. Ý kiến này dựa trên cơ sở thực nghiệm là sau khi cho dịch chiết từ các nguyên liệu trên tác dụng với fibrin, nuớc lọc của hỗn hợp cho phản ứng màu Biure.
Bằng chứng này không thật sự vững chắc nên Group – Besanez không tiếp tục nghiên cứu. Vì vậy Wurtz đƣợc xem nhƣ là ngƣời đầu tiên tách chiết thành công protease từ thực vật (1879). Ông nêu lên rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có
chứa protease, khi dùng cồn để kết tủa sẽ thu nhận đƣợc một chế phẩm enzyme không tinh khiết (100g/1 cây) gọi là papain.
2.2.2.3 Protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới đƣợc chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện đƣợc khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt đƣợc trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế.
Trong thời gian gần đây ngƣời ta cũng đã có những phƣơng pháp thích hợp để nhận chế phẩm không tan của protesae. Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease.
2.2.3 Nguồn thu nhận enzyme protease
Các enzyme protesae nhƣ đã nói ở trên đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau.
2.2.3.1 Từ động vật
Protesae động vật thƣờng có ở tụy tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày…
Pancreatin gồm : Trysin, chymotrypsin và một enzyme khác có ở tụy tạng, chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tụy.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị. Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ ở dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage.
2.2.3.2 Từ thực vật
Enzyme protease từ thực vật có ở các thanh phần khác nhau của cây nhƣ thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả .
Ví dụ:
Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh
Bromelin có trong thân cây thơm xanh và quả thơm xanh. Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả.
2.2.3.3 Từ vi sinh vật
Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dƣợc.
Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy các protease của vi sinh vật có nguồn gốc khác nhau thì cũng có những tính chất khác nhau về nhiều mặt. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động tối ƣu,…Hartley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau :
Protease serine
Protease kim loại (metallo protease) Protease acid
Protease tiol
2.2.4 Ứng dụng của enzyme protease
Các protease nói chung cũng nhƣ protease vi sinh vật nói riêng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,…
Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,…
Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,… Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ.
Trong hƣơng mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.
Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải.
Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.
+ Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch…
+ Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng.
+ Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…
Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.
Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý.
2.3 Protease thu nhận từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae.2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 2.3.1 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
2.3.1.1 Phân loại Giới : Fungi Giới : Fungi Ngành : Ascomycota Ngành phụ : Pezizomycota Lớp : Ascomycetes Bộ : Plectascales Họ : Aspergillaceae Giống : Aspergillus
Loài : Aspergillus oryzae
2.3.1.2 Đặc điểm
Hình thái
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi nấm phát triển rất mạnh (chiều ngang 5 – 7 m), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Hình 2.4 Nấm mốc Aspergillus oryzae qua kính hiển vi
Hình 2.5 Khuẩn lạc của nấm mốc Aspergillus oryzae sau bảy ngày nuôi cấy trên môi trƣờng CBS – MEA2%.
Điều kiện phát triển :
Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành bào tử : 45%. Độ ẩm môi trƣờng tối ƣu cho sự hình thành enzyme : 55 - 58%. Độ ẩm không khí : 85 -95%.
pH môi trƣờng : 5,5 - 6,5. Nhiệt độ nuôi cấy : 27 - 300C.
2.4 Thu nhận enzyme protease từ phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt.
Để thu nhận chế phẩm protease từ vi sinh vật cũng nhƣ các enzyme khác có thể dùng hai phƣơng pháp nuôi cấy : phƣơng pháp bề mặt và phƣơng pháp bề sâu. Phƣơng pháp bề mặt thƣờng dùng để nuôi cấy nấm mốc, phƣơng pháp bề sâu thƣờng dùng đối với vi khuẩn.
Phƣơng pháp nuôi cấy bề mặt là phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Lƣợng
enzyme đƣợc tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thƣờng cao hơn rất nhiều so với phƣơng pháp nuôi cấy chìm. Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thƣờng là những nguyên liệu có nguồn gốc thực vật nhƣ cám mì, cám gạo, gạo, ngô…Khi nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận protease, ngƣời ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành nhƣ những cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trƣờng bán rắn khi nuôi bằng phƣơng pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:
+ Nhiệt độ tăng rất chậm.
+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa. + Thành phần dinh dƣỡng bắt đầu có sự thay đổi.
+ Khối môi trƣờng còn rời rạc.
+ Enzym mới bắt đầu đƣợc hình thành.
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt. Tuyệt đối không đƣợc đƣa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2. Giai đoạn này kéo dài khoảng 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:
+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh. Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trƣờng, trong lòng môi trƣờng.
+ Môi trƣờng đƣợc kết lại khá chặt. + Độ ẩm môi trƣờng giảm dần.
+ Nhiệt độ môi trƣờng sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45o
C.
+ Các chất dinh dƣỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi.
+ Các loại enzym đƣợc hình thành và enzym nào có cơ chất cảm ứng trội hơn sẽ đƣợc tạo ra nhiều hơn.
+ Lƣợng oxy trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải đƣợc thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29- 30oC là tốt nhất.
Giai đoạn 3. Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-20 giờ. Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản nhƣ sau:
+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dƣỡng sẽ chậm lại.
+ Nhiệt độ của khối môi trƣờng giảm, do đó làm giảm lƣợng không khí môi trƣờng xuống còn 20-25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ nuôi duy trì ở 300C. Trong giai đoạn này, bào tử đƣợc hình thành nhiều do đó lƣợng enzym sẽ giảm. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận đƣợc chế phẩm enzyme. Chế phẩm này đƣợc gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trƣờng và nƣớc có trong môi trƣờng). Ngƣời ta thƣờng sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô không mất hoạt tính nhanh.
2.5 Tinh sạch và xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease
Quá trình tinh sạch enzyme đƣợc tóm tắt nhƣ sau : Chế phẩm enzyme thô Trích ly Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Tinh chế kết tủa bằng sắc ký lọc gel
Kiểm tra độ tinh sạch, xác định trọng lƣợng
2.5.1 Trích ly enzyme
Toàn bộ khối lƣợng chế phẩm enzyme thô đã sấy đƣợc đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme ngoại bào và cả enzyme nội bào chƣa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào.
Các loại enzyme thủy phân hòa tan trong nƣớc nên sau khi nghiền mịn, ngƣời ta dùng nƣớc, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, acetone). Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nƣớc trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ đƣợc dùng rộng rãi trong sản xuất. Theo phƣơng pháp khuếch tán bằng nƣớc có thể chiết đƣợc lƣợng enzyme trên 90 – 95% và trong nƣớc chiết không chứa các tạp chất không tan. Nƣớc thƣờng dùng khuyếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. (Lƣơng Đức Phẩm, 1998)
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly : Tỷ lệ nƣớc trích
Chế phẩm đã sấy khô cần nhiều nƣớc để trích ly enzyme hơn chế phẩm ẩm, tỷ lệ nƣớc trên chế phẩm khác nhau sẽ trích đƣợc lƣợng enzyme khác nhau. Lƣợng nƣớc dùng để trích ly gấp từ 2 – 3,5 lần so với lƣợng chế phẩm nấm mốc.
Thời gian trích
Enzyme thủy phân dễ tan trong nƣớc, thời gian trích ly càng lâu càng có khả năng trích đƣợc nhiều enzyme hơn nhƣng làm tăng lƣợng tạp chất trong dịch chiết và giảm hoạt tính riêng của enzyme. Thời gian trích ly thích hợp khoảng 30 – 40 phút.
Nhiệt độ trích
Nhiệt độ trích ly càng tăng thì vận tốc trích ly càng tăng nhƣng làm giảm hoạt tính enzyme nên kéo theo giảm hoạt tính riêng của dịch enzyme. Nhiệt độ trích ly tối thích là 20 – 300C.
Để tăng cƣờng khả năng thu enzyme, chế phẩm đƣợc đánh tơi trƣớc khi trích để đạt đƣợc kích thƣớc hạt 1 – 5 mm. Ngoài ra trong công nghiệp, thƣờng dùng hệ thống trích ly liên tục gồm nhiều thùng chứa chế phẩm nấm mốc, trong mỗi thùng sẽ
Sản phẩm enzyme tinh khiết
trích đƣợc nhiều lần. Cách làm này giúp tăng hiệu suất thu enzyme, tăng chất khô và hàm lƣợng enzyme trong dịch chiết thu đƣợc.
2.5.2 Quá trình tủa
Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt. Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau. Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thƣờng gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính.