Bảng 4.17 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng muối. Asp.oryzae Asp.kawasaki Hoạt tính riêng (UI/mg) Dịch thô 0,93 0,63 Dịch tủa muối 3,94 2,68 Dịch sau sắc ký 6,43 5,83 4.7.2 Tủa protease bằng cồn
Bảng 4.18 : So sánh hoạt tính riêng protease qua các quá trình tinh sạch khi tủa protease bằng cồn.
Asp.oryzae Asp.kawasaki
Hoạt tính riêng Dịch thô 0,93 0,63
Đồ thị 4.10 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protein bằng muối
0 1 2 3 4 5 6 7 Asp.oryzae Asp.kawasaki Dịch enzyme thô Dịch tủa muối Dịch sau sắc ký
(UI/mg) Dịch tủa cồn 3,24 2,13
Dịch sau sắc ký 5,9 5,27
Nhận xét :
Qua hai đồ thị 4.10 và 4.11 cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn hay muối hoạt tính riêng của protease từ hai chủng nấm mốc qua các bƣớc tinh sạch đều tăng dần. Sau quá trình tủa, hoạt tính protease tăng lên do đã loại bớt đƣợc một số protein tạp. Tuy nhiên, enzyme vẫn hoàn toàn chƣa sạch do trong đó vẫn còn chứa một số protein lạ khác. Các protein lạ này sẽ bị loại bỏ qua quá trình sắc ký. Do đó, hoạt tính riêng của protease sau khi qua sắc ký cao nhất.
Từ hai đồ thị trên, chúng ta cũng thấy đƣợc hoạt tính protease của Aspergillus
kawasaki không cao bằng hoạt tính protease từ Aspergillus oryzae. Nhƣ vậy, nếu đƣa
vào sản xuất, chủng Asp.kawasaki vẫn không thể là nguồn vi sinh vật thay thế
Asp.oryzae để thu nhận enzyme protease.
4.8 Kết quả phân tách hệ enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di trên gel SDS – PAGE. SDS – PAGE.
Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki. Đồng thời, dịch enzyme thu đƣợc từ các peak sau khi chạy sắc
Đồ thị 4.11 : Đồ thị so sánh hoạt tính riêng protease qua các bƣớc tinh sạch khi tủa protease bằng cồn.
0 2 4 6 8 Asp.oryzae Asp.kawasaki Dịch enzyme thô Dịch tủa cồn Dịch sau sắc ký
ký của mẫu tủa bằng cồn của cả hai chủng cũng đƣợc chạy điện di đồng thời với dịch chiết enzyme thô.
Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 2.2.3
Kết quả điện di nhƣ hình 4.5.
Hình 4.5 : Kết quả chạy điện di của các dịch enzyme protease
Thứ tự cho mẫu vào các giếng : Giếng 1 : Thang protein chuẩn
Giếng 2 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae
Giếng 3 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus oryzae. Giếng 4 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus oryzae. Giếng 5 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 3 của Aspergillus oryzae. Giếng 6 : Dịch chiết enzyme thô của Aspergillus kawasaki.
Giếng 7 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 1 của Aspergillus kawasaki. Kdal 200 116,25 1 2 97,4 66,2 45 31 21,5 14,4 3 4 5 6 7 8
Giếng 8 : Dịch enzyme thu đƣợc từ peak 2 của Aspergillus kawasaki.
Từ kết quả điện di, tính giá trị Rf của từng protein trong thang chuẩn. Từ đó xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính giữa giá trị Rf và lg trọng lƣợng phân tử của các protein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.19 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của những protein trong thang.
Rf Trọng lƣợng phân tử (daltons) Lg(trọng lƣợng phân tử)
0,0317 200.000 5,301 0,1111 116.250 5,065 0,2539 974.000 4,988 0,3174 662.000 4,820 0,5555 45.000 4,653 0,7460 31.000 4,491 0,9206 21.500 4,332 0,9682 14.400 4,158
Đồ thị 4.12 : Sự tƣơng quan giữa Lg của trọng lƣợng phân tử và giá trị Rf.
Phƣơng trình hồi quy tuyến tính thu đƣợc từ đồ thị 4.12 nhƣ sau : Y = - 1,0576X + 5,2426
Trong đó : Y = lg(trọng lƣợng phân tử protein)
X = Rf : Tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân tách.
y = -1.0576x + 5.2426 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf L g (t rọ n g lư ợ n g p h â n t ử )
Từ phƣơng trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lƣợng phân tử của protein :
Trọng lƣợng phân tử protein = 10Y
Từ hình 4.5 cho thấy : Đối với Aspergillus oryzae:
Giếng 2 xuất hiện bốn vạch, là bốn loại protein có trong dịch chiết enzyme thô.
Giếng 3 và 4 không xuất hiện vạch protein, kết quả này là do hàm lƣợng protein trong peak 1 và 2 thấp nên không hiện vạch trên điện di đồ.
Giếng 5 xuất hiện 2 vạch. Vì hoạt tính của peak 3 cao nhất nên có thể dự đoán hai vạch này chính là hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra. Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.20.
Bảng 4.20 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 3 của Asp.oryzae
Thứ tự vạch X = Rf Y Trọng lƣợng phân tử của protease (Daltons)
Vạch 1 0,6031 4,6046 40.242
Vạch 2 0,7619 4,4368 27.340
Đối với Aspergillus kawasaki:
Trong hai peak thu đƣợc của Asp.kawasaki sau khi chạy sắc ký, peak 2 có hoạt tính protease và hàm lƣợng protein cao nhất và cho hai vạch trên điện di đồ, peak 1 cho hoạt tính protease thấp và không xuất hiện vạch trên điện di đồ. Từ đó có thể dự đoán hai vạch của peak 2 chính là hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra. Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử của hai loại protease đƣợc tính toán dựa vào kết quả điện di và phƣơng trình hồi quy tuyến tính. Kết quả nhƣ bảng 4.21.
Bảng 4.21 Giá trị Rf và trọng lƣợng phân tử protease ở peak 2 của Asp.kawasaki.
Thứ tự vạch X = Rf Y Trọng lƣợng phân tử của
Vạch 1 0,5873 4,3192 41.828
Vạch 2 0,873 4,3192 20.859
PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1 Kết Luận
Từ những kết quả thu đƣợc qua các thí nghiệm, chúng tôi rút ra những kết luận sau :
5.1.1 Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease.
Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease. Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 470C và pH = 7. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 960, hoạt tính riêng của protease tăng lên :
+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng lên 6,43 UI/mg.
+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,93 UI/mg tăng lên 5,9 UI/mg.
Sau khi qua sắc ký :
+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 66,49% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,91 lần so với chế phẩm enzyme thô.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 34,67% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 6,34 lần so với chế phẩm enzyme thô.
Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.oryzae sinh ra lần lƣợt là 40.242 và 27.340 daltons.
5.1.2 Chủng nấm mốc Aspergillus kawasaki
Nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease.
Tỷ lệ dịch trích enzyme : cồn = 1 : 4 là tỷ lệ tối ƣu để tủa enzyme protease. Điều kiện tối ƣu cho hoạt động của protease : Protease hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 470C và pH7.
Sau khi tủa protease bằng muối (NH4)2SO4 và cồn 960, hoạt tính riêng của protease tăng lên :
+ Khi tủa muối : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng lên 5,83 UI/mg.
+ Khi tủa cồn : Hoạt tính riêng của dịch chiết enzyme thô từ 0,63 UI/mg tăng lên 5,27 UI/mg.
Sau khi qua sắc ký :
+ Khi tủa protease bằng muối : tỷ lệ % hoạt tính sau khi lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 62,7% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 9,25 lần so với chế phẩm enzyme thô.
+ Khi tủa protease bằng cồn : Tỷ lệ % hoạt tính sau lọc gel so với chế phẩm thô ban đầu là 43,1% ; độ tinh sạch của enzyme sau khi qua lọc gel tăng 8,37 lần so với chế phẩm enzyme thô.
Trọng lƣợng phân tử của hai loại protease do Asp.kawasaki sinh ra lần lƣợt là 41.828 và 20.859 daltons.
5.1.3 So sánh hai chủng Aspergillus oryzae và Aspergillus kawasaki
Protease của cả hai chủng đều hoạt động tốt nhất ở pH7 và nhiệt độ 470C. Protease thu đƣợc từ Aspergillus oryzae có hoạt tính cao hơn protease từ
Aspergillus kawasaki.
5.2 Đề nghị
Khảo sát thêm các phƣơng pháp tủa protein khác nhƣ lắng tủa đẳng điện, lắng tủa bằng các chất đa điện phân.
Tiến hành chạy sắc ký với các loại gel khác Biogel P-100 nhằm tìm ra loại gel tốt nhất để phân tách protease cho kết quả tinh sạch hơn.
Tinh sạch tiếp tục protease bằng sắc ký trao đổi ion sau khi qua sắc ký lọc gel. Thực hiện western blot để kiểm tra vạch protease sau khi chạy điện di. Từ đó hoàn thiện quy trình tinh sạch protease.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Hữu Chấn, 1984. Enzyme và xúc tác sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật.
2. Phạm Thị Ánh Hồng, 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại học Qốc Gia TP.HCM.
3. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại
học Quốc Gia TP.HCM. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ enzyme. Nhà xuất bản Đại học Quốc
gia TP.HCM.
5. Nguyễn Văn Mùi, 2001. Thực hành hóa sinh học. Nhà xuất bản Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
6. Lƣơng Đức Phẩm, 1998 . Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp 7. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982.
Enzyme vi sinh vật. Nhà xuất bản Khoa học Kĩ thuật.
8. Viện Sinh Học Nhiệt Đới, 1994 . Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại
Việt Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
9. Nguyễn Tiến Thắng, 2004. Giáo trình Công nghệ enzyme.Tủ sách trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM.
10.Nguyễn Tiến Thắng, 2003. Một số kỹ thuật phòng thí nghiệm sinh học. Tủ
sách Viện Sinh Học Nhiệt Đới.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
11.Amersham Biociences, 2004. Gel Filtration – Principle and Methods.
PHỤ LỤC