Dịch thu nhận đƣợc vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô, vì trong đó còn chứa nƣớc, các chất hòa tan khác từ khối môi trƣờng nuôi cấy. Dung dịch enzyme thô thƣờng chứa một lƣợng enzyme không nhiều, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi những vật chất này.
Để làm đƣợc điều đó ngƣời ta phải tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây kết tủa. Tủa là phƣơng pháp cô đặc enzyme hữu dụng và là bƣớc ban đầu trong tinh sạch enzyme. Bằng cách này ngƣời ta loại đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme.
Nguyên tắc :
Enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi.
Ở phân tử enzyme, các gốc ƣa nƣớc và kỵ nƣớc thƣờng nằm trên bề mặt. Chúng quyết định mức độ hòa tan của enzyme ở những loại dung môi khác nhau. Trong đó, các nhóm kỵ nƣớc có xu hƣớng nằm trong lòng phân tử protein, một phần không nhỏ nhóm này nằm trên bề mặt protein và có khả năng tiếp xúc với dung môi, các nhóm này sẽ cùng với nhóm tích điện và các nhóm lƣỡng cực khác có vai trò quyết định đến tính chất enzyme.
Độ hòa tan của enzyme đƣợc coi là kết quả của tƣơng tác lƣỡng cực của chất hòa tan với nƣớc và tƣơng tác ion của chúng với muối có trong dung dịch tạo thành màng nƣớc bao quanh phân tử protein gọi là lớp vỏ hydrate. Nếu loại bỏ các tƣơng tác này, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau để tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch, thƣờng gọi là tủa protein.
Sau khi protein bị kết tủa, nếu loại bỏ các yếu tố gây kết tủa, protein lại có thể ở dạng tan (dung dịch keo) bền nhƣ trƣớc thì đƣợc gọi là kết tủa thuận nghịch, hoặc mất khả năng này gọi là kết tủa không thuận nghịch.
Những phản ứng kết tủa thuận nghịch protein a) Kết tủa bằng muối
Khi cho thêm muối (amonium sulfate) vào dung dịch protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hƣớng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại.
Khi cho một lƣợng muối đủ lớn vào thì protein sẽ bắt đầu tủa. Nếu quá trình này thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính. Sau đó thu protein bằng cách ly tâm và hòa tan vào dung dịch đệm có nồng độ muối thấp.
Phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng để tách chiết protein hòa tan. Nó cũng đƣợc sử dụng để thu phân đoạn các protein khác nhau trong hỗn hợp, vì các phân tử protein lớn có khuynh hƣớng kết tủa trƣớc, các phân tử nhỏ hơn vẫn còn nằm trong dung dịch. Vì thế chúng ta có thể tìm ra điều kiện mà có thể thu protein ta đang nghiên cứu nhiều nhất trong hỗn hợp nhiều protein nhờ phân tích các đoạn ở nồng độ muối khác nhau.
Nhƣ vậy với quá trình này ta có thể thu đƣợc protein mong muốn một cách tinh sạch hơn.
b) Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (nhƣ nƣớc, dimethylsulfoxid) có thể ổn định các tƣơng tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngƣợc lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (acetone, ethanol) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trƣờng. Do đó độ hòa tan của các phân tử protein giảm và xảy ra sự kết tủa do làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trƣờng. Điều này có đƣợc bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nƣớc (nhƣ acetone) vào dung dịch chứa protein.
Sự kết tủa bằng acetone hoặc ethanol 960
có nhiều thuận lợi do tƣơng đối rẻ, có sẵn dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzyme. Do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phƣơng pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
Có thể xảy ra hiện tƣợng biến tính không thuận nghịch khi kết tủa bằng dung môi hữu cơ. Nguyên nhân là do, khi hằng số điện môi giảm, phân tử protein có thể tự tháo gỡ và trở thành dạng không hoạt động, trong khi đó các gốc kỵ nƣớc lại tiếp xúc
với dung môi. Hiện tƣợng này xảy ra khi tiến hành tủa ở nhiệt độ phòng. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lƣu ý đến nhiệt độ, ta bắt buộc phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme.
Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt dung môi hữu cơ thƣờng mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Ngƣời ta thƣờng tiến hành kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme đƣợc xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme.
