a) Hóa chất và dụng cụ Dụng cụ và thiết bị Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ. Phễu đổ gel Bình hút chân không. Flow Adapor 1,5 cm. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích : 53 ml [thể tích = chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14]. Bình đựng dung dịch đệm. Ống nghiệm: 50 cái.
Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch
Hình 3.2 Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ
Hóa chất
Gel Bio-Gel P-100, hãng Bio-Rad : là các hạt polyacrylamide tạo lỗ, đƣợc điều chế bằng quá trình đồng polymer hóa acrylamide và N, N’-methylene-bis- acrylamide. Các gel này rất ƣa nƣớc và không mang điện tích, giúp việc lọc các hợp chất nhạy cảm qua gel đạt hiệu quả. Đặc tính của Bio-Gel P-100 : dạng hạt mịn, kích thƣớc hạt 45 – 90 m, khả năng ngậm nƣớc : 12ml/1g gel khô, phạm vi phân tách : 5000-100000 daltons.
Đệm phosphate 0,1M; pH7 : khử bọt khí trƣớc khi dùng.
Chuẩn bị gel
Cân 5 g gel Bio-gel P-100 khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH = 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH = 7 nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 = 106 ml dung dịch đệm.
Sau khi quá trình hydrate xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào một bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5-10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình, không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hƣ gel.
Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định. Gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn.
Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột.
Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột đƣợc nạp đầy gel.
Khi cột đã đƣợc nạp đầy gel, mở khóa đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khóa đầu ra của cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp nền chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy.
Đóng đầu ra của cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua flow adaptor.
Chuẩn bị mẫu
Dịch hòa tan tủa sau khi tủa protein với nồng độ muối và tỷ lệ cồn tối ƣu ở thí nghiệm 2 đƣợc chạy qua sắc ký lọc gel.
Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không có các hạt rắn), hòa tan hoàn toàn trong dung dịch đệm.
Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) sẽ làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột .
Dịch ra khỏi cột đƣợc đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm bằng detector trong hệ sắc ký và đƣợc thể hiện độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP Data View trên máy tính. Dịch đƣợc thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml..
Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease
Dựa trên sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ đuợc phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford và hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano sau tinh sạch nhƣ thí nghiệm 2
c) Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel.
Hiệu suất về hoạt tính enzyme = Trong đó :
HT enzyme 1 : Hoạt tính enzyme protease trƣớc tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme trƣớc tinh sạch.
HT enzyme 2 : Hoạt tính enzyme protease sau tinh sạch (UI/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch.)
HTR của enzyme protease sau tinh sạch =
Độ tinh sạch của enzyme = Trong đó :
HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng enzyme trƣớc mỗi lần tinh sạch.
HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng enzyme tƣơng ứng sau mỗi lần tinh sạch.
Độ tinh sạch của protease sau sắc ký = Trong đó : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
HTR enzyme 1 : Hoạt tính riêng của enzyme protease trƣớc tinh sạch HTR enzyme 2 : Hoạt tính riêng của enzyme protease sau tinh sạch.
HT enzyme 2 HT enzym 1 HT enzyme 2 Hàm lƣợng protein sau tinh sạch HTR enzyme 2 HTR enzyme1 HTR enzyme 2 HTR enzyme 1
3.3.1.7 Thí nghiệm 5 : Xác định trọng lƣợng phân tử enzyme protease bằng phƣơng pháp điện di SDS - PAGE
a) Thiết bị và dụng cụ
Bộ điện di đứng
Bộ nguồn chạy điện di Biorad. Pipetteman Đầu típ Eppendorf Dụng cụ làm gel (tấm kính, lƣợc, kẹp...) Hóa chất N,N,N’,N’-tetramethylennediamide(C6H16N2 – TEMED) Dung dịch Acrylamide/Bisacrylamide 40% (29:1)93,3%C) -Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH)
Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-rad), gồm các protein chuẩn có kích thƣớc xác định sau :
Myosin : 200000 daltons.
-galactosidase : 116250 daltons Phosphorylase b : 97400 daltons
Bonvine serum albumin : 66200 daltons Ovalbumin : 45000 daltons
Carbonic anhydrase : 31000 daltons Soybean trypsin inhibitor : 21500 daltons Lysozyme : 14400 daltons
Aprotinin : 6500 dalons Sodium dodecyl sunfate (SDS) Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8] Coomasie Brilliant Blue G-250 (Bio-rad) Cồn tuyệt đối (99,50)
Tris (hydroxymethyl) aminomethane Acid acetic Bromophenol blue Glycerol (C3H8O3) Glycine (C2H5O2N) Acid Clohydric (HCl)
Sodium dodecyl sunfate (SDS) 10% : cân 10g SDS, cho 100 ml nƣớc cất vào khuấy cho tới khi tan hết.
Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1,5M; pH8,8- 0,4% SDS : cân 36,3g Tris pha trong 100 ml nƣớc cất, thêm dần HCl 6N và khuấy dung dịch trên cho tới khi pH kế chỉ 8,8. Hút 8 ml dung dịch SDS 10% cho vào. Thêm nƣớc cất cho đủ 200 ml, lắc đều giữ ở 40
C
Ammoniumpersulfate 10% (chỉ pha trƣớc khi dùng) : cân 0,1g cho vào một eppendorf 1000 l, thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch đệm điện di Tris-glycine pH 8,3 : pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144g Glycine, 10g SDS hòa trong 1000 ml nƣớc cất.
Dung dịch nạp mẫu 2X (2X treatment buffer) có thành phần nhƣ sau : 2,5 ml dung dịch đệm Tris-Cl 0,5M; pH 6,8; 4 ml 10%SDS; 2 ml Glycerol; 2 mg Bromophenol Blue; 0,2 ml mercaptoethanol; thêm nƣớc đủ 10 ml.
Dung dịch nhuộm gel : chuẩn bị 250 ml dung dịch nhuộm gel chứa 0,625g Coomasie Blue G 250;112,5 ml ethanol tuyệt đối; 112,5 ml nƣớc cất và 25 ml acid acetic; lắc đều; giữ trong chai màu tối.
Dung dịch giải nhuộm : 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nƣớc cất.
b) Phƣơng pháp
Đổ gel
Gel phân tách (separating gel)
Cho các thành phần sau theo thứ tự, vào becher 50 ml sạch : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 2,5 ml
Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 2,5 ml Nƣớc cất : 4,445 ml
Ammoniumpersulfate 10% : 50 l Tổng thể tích : 10 ml
Sau khi cho Ammoniumpersulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho mức dung dịch gel cao hơn 7 cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó nhẹ nhàng đặt một lớp nƣớc cất lên trên lớp gel để mặt gel đƣợc phẳng. Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút).
Gel gom (Stacking gel):
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch khác : 40% Acrylamide/Bis (29:1) : 0,5 ml Tris – HCl 1,5M pH8,8 – 4,4% SDS : 1 ml Nƣớc cất : 2,476 ml TEMED : 4 l Ammoniumpersulfate 10% : 20 l Tổng thể tích : 4 ml (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi gel phân tách đã trùng ngƣng hoàn toàn, đổ hết nƣớc bên trên. Tiến hành đổ lớp gel gom bằng cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đƣa lƣợc vào khuôn để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau khi gel trùng ngƣng, tháo lƣợc, lắp đĩa gel vào bộ phận điện di cho dung dịch điện di vào buồng điện di.
Chuẩn bị mẫu và chạy điện di Xử lý mẫu
Tiến hành chạy điện di dịch chiết enzyme thô của Aspergillus oryzae và
Aspergillus kawasaki đồng thời với peak đƣợc dự đoán là protease mà ta quan tâm của
cả hai chủng khi tủa protein bằng cồn.
Hút 30 l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) và 30 l dung dịch mẫu protein vào một eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thủy 5 – 10 phút. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1-5 giây.
Chú ý nồng độ protein trong mẫu vừa đủ sao cho hàm lƣợng protein trong một giếng không vƣợt quá 20 – 40 g và hàm lƣợng protein/band không vƣợt quá 0,1
Đối với thang chuẩn protein (Biorad) hút 2 l vào eppendorf 1 ml chứa 8 l nƣớc cất và 10 l dung dịch nạp mẫu.
Tiến hành chạy điện di
Dùng pipetteman 10 l nạp mẫu vào các giếng (20 l/giếng) Tiến hành chạy điện di ổn định dòng : 100V.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trƣớc (2-4 giờ) trong một giờ. Sau đó tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
Xác định trọng lƣợng phân tử của protein
Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.
Tính giá trị Rf :
Rf =
Vẽ biểu đồ lg của các giá trị trọng lƣợng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng.
Trọng lƣợng phân tử của các protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị.
3.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel. Khoảng cách di chuyển của protein Khoảng cách di chuyển của vạch màu
PHẦN 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của dịch chiết enzyme thô
Chiết enzyme từ 100g chế phẩm enzyme thô bằng nƣớc cất. Dịch chiết thu đƣợc đem xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease theo thí nghiệm 1 ở mục 3.3.1.1. Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính protease trong 100g chế phẩm thành hàm lƣợng và hoạt tính trên một gam chế phẩm. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1
Bảng 4.1 : Hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein của dịch chiết enzyme thô của hai chủng Asp.oryzae và Asp.kawasaki
Hoạt tính protease (UI/g CP) Hàm lƣợng protein (mg/g CP) HTR(UI/mg) Asp.oryzae 29,01 31,20 0,93 Asp. kawasaki 12,85 20,40 0,63
Đồ thị 4.1 Đồ thị so sánh hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme protease trong dịch chiết enzyme thô giữa hai chủng nấm mốc Asp.oryzae và Asp.kawasaki
Nhận xét : Từ đồ thị 4.1 cho thấy hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của
Asp.oryzae cao hơn Asp.kawasaki.
4.2 Nồng độ muối tối ƣu cho việc tủa protease
0 5 10 15 20 25 30 35 Asp.oryzae Asp.kawasaki Hàm lƣợng (mg/g CP) Hoạt tính (UI/g CP) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiết enzyme từ chế phẩm enzyme thô theo mô tả ở thí nghiệm 1, dịch chiết đƣợc tủa với muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ 50, 55, 60, 65, 70, 75% độ bão hòa. Sử dụng 50 ml dịch chiết enzyme thô cho mỗi nồng độ. Ly tâm để thu tủa. Sau đó cặn tủa thu đƣợc hòa tan vào 15 ml dung dịch đệm phosphate pH = 7. Xác định tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease (ở nhiệt độ 370C, pH = 7) trong 15 ml dịch hòa tan tủa này. Ở nồng độ nào cho hoạt tính enzyme cao nhất thì đó là nồng độ tối ƣu cho việc tủa enzyme protease.
4.2.1 Kết quả đối với chủng Asp.oryzae
Bảng 4.2 Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.
Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR (UI/mg) 50 271,67 106,12 2,56 55 385,98 129,96 2,97 60 495,85 159,95 3,1 65 805,91 204,56 3,94 70 702,29 208,4 3,37 75 625,2 216,09 2,89
Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối
Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 35,33 13,8 2,56 55 50,19 16,9 2,97 60 64,48 20,8 3,1 65 104,80 26,6 3,94
70 91,33 27,1 3,37
75 81,3 28,0 2,89
Đồ thị 4.2 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.oryzae khi tủa protease bằng muối.
Nhận xét :
Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy :
Về hàm lƣợng : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 75% độ bão hòa thu đƣợc hàm lƣợng protein tủa là nhiều nhất. Nồng độ muối (NH4)2SO4 càng tăng thì hàm lƣợng protein tủa đƣợc càng nhiều. Điều này có đƣợc là do khi nồng độ muối càng cao, các phân tử muối phân ly thành các ion càng nhiều. Chính các ion này bắt lấy các phân tử nƣớc khỏi protein càng nhiều, do đó các protein có điều kiện tiếp xúc nhau và sa lắng.
Về hoạt tính : Sử dụng muối (NH4)2SO4 ở nồng độ 65% độ bão hòa cho hoạt tính enzyme protease cao nhất.
Hoạt tính riêng của enzyme ở nồng độ muối 65% độ bão hòa cao nhất. Nhƣ vậy, nồng độ muối tủa đƣợc nhiều protein nhất không phải là nồng độ tối ƣu để thu nhận enzyme protease. Bởi vì, ở các nồng độ muối khác nhau sẽ tủa đƣợc các protein khác nhau. Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc nhiều nhất nhƣng chứa nhiều protein tạp, không phải là enzyme protease. Ngƣợc lại, ở nồng độ muối 65% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc không cao nhất nhƣng hoạt tính protease mạnh nhất . Điều này chứng tỏ ở nồng độ muối 65% độ bão hòa tủa
0 5 10 15 20 25 30 50 55 60 65 70 75
Nồng độ muối amonium sunfat bão hòa (% độ bão hòa) H àm l ư ợ ng prot e in (m g/ g C P ) 0 20 40 60 80 100 120 Ho ạt t ính prot e a s e ( U I/ g C P ) Hàm lƣợng protein Hoạt tính protease
đƣợc nhiều protease nhất. Từ đây có thể kết luận, nồng độ muối (NH4)2SO4 65% độ bão hòa là tối ƣu để tủa enzyme protease vì vừa cho hoạt tính protease cao, vừa tiết kiệm lƣợng muối sử dụng.
4.2.2 Kết quả đối với chủng Asp.kawasaki
Bảng 4.4 : Tổng hàm lƣợng protein và tổng hoạt tính enzyme protease trong 15 ml dịch hòa tan tủa của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối
Nồng độ (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Tổng hoạt tính (UI) Tổng hàm lƣợng (mg) HTR(UI/mg) 50 96,89 53,83 1,80 55 148,18 72,29 2,05 60 197,04 89,97 2,19 65 276,84 103,05 2,68 70 232,47 106,1 2,19 75 202,01 109,2 1,85
Để dễ so sánh, chúng tôi quy đổi hoạt tính enzyme protease và hàm lƣợng protein có trong 15 ml dịch hòa tan tủa ở các nồng độ thành hàm lƣợng và hoạt tính trong 1g chế phẩm enzyme thô. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5
Bảng 4.5 : Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease có trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối
Nồng độ muối (NH4)2SO4 (% độ bão hòa) Hoạt tính (UI/g CP) Hàm lƣợng (mg/g CP) HTR (UI/mg) 50 12,6 7 1,8 55 19,27 9,4 2,05 60 25,62 11,7 2,19 65 36 13,4 2,68 70 30,2 13,8 2,19 75 26,27 14,2 1,85
Đồ thị 4.3 Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease trong 1g chế phẩm enzyme thô của Asp.kawasaki khi tủa protease bằng muối.
Nhận xét :
Tƣơng tự với chủng Asp.oryzae, đối với chủng Asp.kawasaki :
Ở nồng độ muối 75% độ bão hòa, hàm lƣợng protein tủa đƣợc là nhiều nhất. Nồng độ muối 65% độ bão hòa chính là nồng độ tối ƣu để tủa enzyme protease.
4.3 Tỷ lệ cồn tối ƣu cho việc tủa protease
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});