KLTN-Từ Minh Thảo - Sâm cau

LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Nguyễn Thị Thùy Linh (Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội) T.S Nguyễn Thị Phương (Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) người thầy hướng dẫn, bảo em, ln góp ý giúp đỡ em, đưa ý kiến quý báu để hồn thiện khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Dược liệu PGS.T.S Phương Thiện Thương nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận hạn Em xin chân thành cảm ơn cán bộ, nhân viên khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt anh Nguyễn Đình Quân chị Hoàng Thị Tuyết – người theo sát, hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài Sau cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu này! Hà Nội, ngày 11 tháng năm 2017 Sinh viên Từ Minh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sâm cau 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan chất orcinol-O-β-D-glucosid 10 1.2.1 Cấu trúc hóa học tính chất 10 1.2.2 Tác dụng dược lý 11 1.2.3 Các phương pháp định tính, định lượng OG 12 1.3 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng 13 1.3.1 Tổng quan sắc ký lớp mỏng 13 1.3.2 Tổng quan sắc ký lỏng hiệu cao 14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 19 2.2.2 Định lượng OG HPLC 19 2.2.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG mẫu sâm cau thực 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp xử lý sơ mẫu thử 20 2.3.2 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 20 2.3.3 Định lượng OG HPLC 21 2.3.4 Ứng dụng phương pháp để xác định OG mẫu thực 26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Định tính OG TLC 27 3.1.1 Khảo sát thuốc thử phát vết 27 3.1.2 Khảo sát hệ dung môi pha động: 29 3.2 Định lượng OG HPLC 30 3.2.1 Lựa chọn bước sóng phân tích: 30 3.2.2 Khảo sát thành phần pha động 31 3.2.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33 3.2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 36 3.3 Ứng dụng phương pháp để xác định OG mẫu thực 42 3.3.1 Định tính OG sắc ký lớp mỏng 43 3.3.2 Định lượng OG sắc ký lỏng hiệu cao 44 3.4 Bàn luận 46 3.4.1 Tính cấp thiết việc tiêu chuẩn hóa dược liệu sâm cau Việt Nam 46 3.4.2 Xây dựng phương pháp định tính 46 3.4.3 Quy trình xử lý mẫu định lượng 47 3.4.4 Phương pháp định lượng 48 3.4.5 Kết phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh tên khoa học Tên tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội nhà Hóa Chemists phân tích DAD Diod Array Detector Detector mảng diod DMSO Dimethyl sulfoxide EtOH Ethanol Ethanol High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao AOAC HPLC Khối lượng/ khối lượng kl/ kl LOD Limid of Detection Giới hạn phát LOQ Limid of Qualification Giới hạn định lượng MeOH Methanol Methanol MS Mass Spectrometry Phổ khối OG Orcinol glucoside Orcinol glucosid OM Orcinol monohydrate Orcinol monohydrat RSD Relative Standard Deviation S/N Signal/Noise STT Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/nhiễu đường Số thứ tự TFA Trifluoroacetic acid Acid trifluoroacetic TLC Thin layer chromatography Sắc ký mỏng UV-VIS Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại - khả kiến v/v Volume/volume Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các cực đại hấp thụ 31 Bảng 3.2 Hàm lượng OG thay đổi phương pháp thời gian chiết 35 Bảng 3.3 Khảo sát số lần chiết 35 Bảng 3.4 Khảo sát tính phù hợp hệ thống 38 Bảng 3.5 Quan hệ nồng độ diện tích pic OG 40 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ lặp lại 41 Bảng 3.7 Kết độ thu hồi 42 Bảng 3.8 Kết định lượng OG số mẫu thân rễ sâm cau thực 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Phần mặt đất thân rễ sâm cau Hình 3.1 Sắc ký đồ trước phun thuốc thử 27 Hình 3.2 Khảo sát định tính nhóm thuốc thử 28 Hình 3.3 Khảo sát hệ dung mơi TLC, quan sát ánh sáng thường 29 Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV dung dịch OG MeOH 30 Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha dộng 32 Hình 3.6 Khảo sát dung mơi chiết 34 Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu 36 Hình 3.8 Khảo sát tính chọn lọc phương pháp 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOQ, LOD 39 Hình 3.10 Đường chuẩn OG 40 Hình 3.11 Sắc ký đồ định tính OG mẫu thân rễ sâm cau thực 43 Hình 3.12 Sắc ký đồ phân tích mẫu thực 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm cau có tên khoa học Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae); phận dùng làm thuốc thân rễ Sâm cau vị thuốc quý, nghiên cứu cơng bố nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe như: chống loãng xương; bảo vệ, chống độc cho gan; tăng cường chức sinh lý; điều hịa miễn dịch; chống oxy hóa; kháng khuẩn; chống tăng đường huyết… Nhóm chất có hoạt tính sinh học loài C.orchioides hợp chất phenolic glycosid saponin Orcinol-O-β-D-glucosid thuộc nhóm hợp chất phenolic glycosid, có hàm lượng cao dược liệu sâm cau Chất chứng minh có tác dụng chống suy nhược, giảm căng thẳng chống oxy hóa, từ góp phần không nhỏ vào tác dụng điều trị dược liệu Hiện Việt Nam chưa có phương pháp để định tính nhanh hoạt chất dược liệu sâm cau xác định hàm lượng chúng, nên việc đánh giá chất lượng dược liệu sâm cau thị trường cịn gặp nhiều khó khăn, chất lượng dược liệu chưa đảm bảo Việc phát triển phương pháp phân tích hoạt chất nói chung orcinol-O-β-D-glucosid nói riêng dược liệu sâm cau vô cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tế, khóa luận “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định tính định lượng orcinolO-β-D-glucosid thân rễ sâm cau” thực với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định tính nhanh định lượng orcinol-O-β-Dglucosid thân rễ sâm cau - Áp dụng phương pháp phân tích mẫu thân rễ sâm cau thực CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sâm cau 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố Tên khoa học: Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae Tên gọi khác: Ngải cau, tiên mao, cỏ nốc lan Họ Tỏi voi lùn Cây thảo, sống lâu năm cao 30 cm Thân rễ hình trụ dài, dạng củ to ngón tay út, có rễ bên nhỏ Lá mọc tụ hợp thành túm từ thân rễ, xếp nếp cau, hình mũi mác hẹp, dài 20 – 30 cm, rộng 2,5 – 3cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần màu, gân song song, bẹ to dài, cuống dài khoảng 10 cm Hoa màu vàng, mọc thành cụm – 5, không cuống trục ngắn, nằm bẹ Quả nang, thuôn dài 12 – 15 mm, hạt – phình đầu [1], [6], [7] Bộ phận dùng: Thân rễ Phân bố: Việt Nam: Hà Nội (Chùa Hương, Ba Vì), Ninh Bình, Đà Nẵng, Kon Tum, Lâm Đồng, Bà Rịa – Vũng Tàu Cịn có nơi khác giới như: Ấn Độ, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Nhật Bản, Thái Lan, Philippines, Malaysia, Indonexia, Papua New Guinea [7] Hình 1.1 Phần mặt đất thân rễ sâm cau 1.1.2 Thành phần hóa học Các kết nghiên cứu giới công bố cho biết thành phần hóa học có tác dụng dược lý dược liệu sâm cau bao gồm: Hợp chất phenolic glycosid, hợp chất aliphatic hydroxy-keton, saponin, flavonoid, alcaloid Ngoài hợp chất trên, thân rễ chứa thành phần hóa học khác glycosid, steroid, polysaccharid, đường tự glucose, mannose, xylose; acid glucuronic; nhựa; tanin; chất béo; chất nhầy [28] Ở Việt Nam, nghiên cứu dược liệu sâm cau, cụ thể thành phần hóa học thân rễ sâm cau cịn Trong nghiên cứu tác giả Nguyễn Bích Ngọc (2015) loài sâm cau thu hái Kon Tum, Tây Nguyên, kết định tính cho thấy thân rễ sâm cau chứa hợp chất phenolic, saponin, alcaloid, phytosterol, đường khử tự do, chất béo [2] 1.1.2.1 Hợp chất phenolic glycosid Năm 1983, Michinor Kubo cộng phân lập từ thân rễ sâm cau phenolic glucosid đặt tên curculigoside A (1) [15] Năm 2006, hai hợp chất cũ curculigoside A (1) curculigoside B (2), Josep Valls cộng phân lập hai benzylbenzoat curculigoside C (3) curculigoside D (4) [41] Hợp chất R1 R2 R3 Tài liệu Curculigosid A (1) OCH3 H OH [2], [28], [50] Curculigosid B (2) OH H OH [28], [50] Curculigosid C (3) OCH3 OH OH [17] Curculigosid D (4) OCH3 OH H [41], [50] ... flavonoid thân rễ sâm cau [40] Cấu trúc hóa học chúng là: R= α-L-Xyl-( 4-1 )-? ?-D-Glc 5,7-dimethoxmyricetin-3-O-α-L- 3',4',5'-trimthoxy-6,7-methylene xylopyranosyl-( 4-1 )-? ?-D- dioxyflavone (27) glucopyranoside... orcinol glucosid orcinol-1-O-(6’-O-acetyl )-? ?-D-glucopyranosid Trong orcinol1-O-(6’-O-acetyl )-? ?-D-glucopyranosid (15) hợp chất thời điểm công bố [2] Hợp chất khác: Acid 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic... 3-( 2-methoxypropyl )-4 -methylnonacosan-2-on (17) [31] 4-acetyl-2-methoxy-5-methyltriacontan (18) [29] 27-hydroxytriacontan-6-on (19) [32] 23-hydroxytriacontan-2-on (20) [32] 5 21-hydroxytetracontan-20-on (21) [31] Acid 4-methylheptadecanoic