KLTN-DSĐH-AuraminO

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THU HÀ 1101139 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AURAMIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NI BẰNG LC-MS/MS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ THU HÀ 1101139 NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH AURAMIN O TRONG THỨC ĂN CHĂN NI BẰNG LC-MS/MS KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS Trần Cao Sơn ThS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện Kiểm ngiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2016 i LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Cao Sơn, ngƣời giao đề tài tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn ThS Đặng Thị Ngọc Lan định hƣớng cho em trình tìm tài liệu nhƣ góp ý hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn thầy mơn Hóa phân tích Độc chất – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ban lãnh đạo toàn thể cán nhân viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian nghiên cứu để thực đề tài Cuối cùng, với tất lòng biết ơn sâu nặng em xin dành cho gia đình, bạn bè chăm sóc, cổ vũ, động viên em suốt trình học tập nhƣ sống Trong trình thực đề tài, nỗ lực cố gắng nhƣng khơng tránh khỏi nhƣng thiếu sót, em kính mong nhận đƣợc ý kiến bảo phê bình quý thầy cô Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Phạm Thị Thu Hà ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………… i MỤC LỤC …………………………………………………………… ……ii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ………… ……… v DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………… ….vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ………………………… ….vii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Auramine O 1.1.1 Khái quát chung 1.1.2 Cấu trúc, tính chất hóa lý 1.1.3 Độc tính 1.1.4 Các quy định hàm lƣợng Auramine O 1.2 Tổng quan phƣơng pháp xác định Auramine O 1.2.1 Các phƣơng pháp đƣợc thực để xác định Auramine O 1.2.2 Phƣơng pháp LC-MS/MS 1.2.2.1 Sắc kí lỏng (HPLC) 10 1.2.2.2 Khối phổ 11 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 14 2.2 Nguyên vật liệu – trang thiết bị 14 2.2.1 Nguyên vật liệu 14 2.2.1.1 Chất chuẩn 14 2.2.1.2 Hố chất, dung mơi 14 2.2.2 Trang thiết bị 14 2.2.2.1 Thiết bị 15 iii 2.2.2.2 Dụng cụ 15 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.3.1 Khảo sát điều kiện xác định chất màu AuO LC-MS/MS 15 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 16 2.3.3 Thẩm định phƣơng pháp 16 2.3.4 Ứng dụng phƣơng pháp 16 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu 16 2.4.2 Phƣơng pháp thẩm định 18 2.4.2.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 18 2.4.2.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 19 2.4.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 20 2.4.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 21 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1 Tối ƣu hóa điều kiện tách xác định AuO LC-MS/MS 22 3.1.1 Tối ƣu hóa điều kiện khối phổ 22 3.1.1.1 Lựa chọn ion phân tử ion sản phẩm 22 3.1.1.2 Tối ƣu hóa điều kiện MS 22 3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc kí lỏng 23 3.1.2.1 Chọn pha tĩnh 23 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 24 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 25 3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu 25 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 26 3.2.3 Khảo sát cột chiết pha rắn SPE 28 3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải 30 3.3 Thẩm định phƣơng pháp phân tích 31 iv 3.3.1 Tính đặc hiệu, chọn lọc 31 3.3.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 32 3.3.3 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn 33 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 35 3.4 Kết xác định AuO số mẫu TACN 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 Kết luận 38 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AA Amonium acetate Amoni acetat AF Formic acid Acid formic AuO Auramine O AOAC APCI Association of Official Hiệu hội cộng đồng phân Analytical Communities tích thức Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa hóa học ionization áp suất khí CAV Cell Accelerator Voltage CE Collision Energy Năng lƣợng va chạm CV Coefficient of Variation Hệ số biến thiên ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang HPLC LC-MS/MS High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ mass spectrometry lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lƣợng MS Mass spectrometry Khối phổ R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn Thức ăn chăn nuôi TACN TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn ion TLC Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị giới hạn quốc tế Auramin năm 2007 [13] Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định định lượng Auramin O mẫu khác Bảng 1.3 Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích auramin O Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích 18 Bảng 3.1 Các điều kiện phân tích AuO ESI(+)-MS/MS 22 Bảng 3.2 Các thông số tối ưu MS chế độ ion dương 23 Bảng 3.3 Chương trình gradient phân tích Auramine O 24 Bảng 3.4 So sánh loại dung môi chiết đến diện tích pic AuO 27 Bảng 3.5 Khảo sát cột SPE đến độ thu hồi AuO 28 Bảng 3.6 Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải 30 Bảng 3.7 Sự phụ thuộc diện tích píc nồng độ 34 Bảng 3.8 Độ lặp lại thu hồi AuO mẫu TACN 35 Bảng 3.9 Kết xác định hàm lượng AuO số mẫu TACN Hà Nội 36 vii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo auramin O Hình 1.2 Mơ hình hệ thống LC-MS/MS 11 Hình 3.1 Sắc kí đồ dung dịch chuẩn AuO 50 ppb phân tích hệ gradient 25 Hình 3.2 Quy trình xử lý mẫu khảo sát 26 Hình 3.3 Sắc ký đồ AuO sử dụng dung môi chiết khác 27 Hình 3.4 sắc ký đồ so sánh diện tích pic dung môi chiết 28 Hình 3.5 Khảo sát loại cột SPE 29 Hình 3.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 31 Hình 3.7 Sắc đồ pic AuO mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn mẫu trắng 32 Hình 3.8 Sắc đồ AuO LOD 0,2 ppb ( tương đương µg/kg mẫu) 33 Hình 3.9 Sắc đồ AuO LOQ 0,5 ppb ( tương đương 20 µg/kg mẫu) 33 Hình 3.10 Đường chuẩn AuO 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, an toàn vệ sinh thực phẩm vấn đề nhận đƣợc quan tâm ngày lớn xã hội quan quản lý Trong năm trở lại đây, việc sử dụng chất cấm chăn nuôi gia súc, gia cầm gây nhiều xúc vấn đề có nguy tiềm tàng gây ảnh hƣởng tiêu cực đến sức khỏe ngƣời Chính vậy, quan quản lý ngày đƣa yêu cầu giám sát gắt gao Chất auramin O hay cịn gọi chất Vàng Ơ đƣợc dùng phổ biến công nghiệp dệt may, sơn hay tạo màu ve quét tƣờng để nhuộm màu vi khuẩn (ví dụ nhƣ Mycobacterium) [23] Ở Việt Nam, quan chức Bộ NN&PTNN phát đƣợc nhiều sở sản xuất thức ăn chăn nuôi trộn chất màu vào thức ăn cho gà với mong muốn tạo màu vàng bắt mắt cho da chân gà để dễ bán Khi ngƣời tiêu dùng ăn thịt gà hấp thụ ln lƣợng Auramin O tồn dƣ, dẫn tới nguy bất lợi cho sức khỏe gây ung thƣ Chính vậy, từ 11/2015 Bộ NN&PTNN ban hành thông tƣ bổ sung Auramin O vào danh mục chất cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh sử dụng thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Việt Nam [4] Từ yêu cầu quản lý trên, mặt chun mơn cần có phƣơng pháp phân tích đáng tin cậy với độ nhạy phù hợp để kiểm sốt đƣợc lƣợng Auramin O có mẫu thực phẩm cần giám sát Xuất phát từ nhu cầu thực tế đặc tính ƣu việt kỹ thuật LC-MS/MS phân tích, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phƣơng pháp xác định Auramine O thức ăn chăn nuôi LC-MS/MS” với mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phƣơng pháp xác định Auramin O thức ăn chăn nuôi LC-MS/MS