KLTN-Hồ Ngọc Hoạt

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ NGỌC HOẠT Mã sinh viên: 1201236 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THIẾT LẬP SCHISANDRIN LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ NGỌC LINH (SCHISANDRA SPHENANTHERA REHDER & E.H WILSON) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ NGỌC HOẠT 1201236 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THIẾT LẬP SCHISANDRIN LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU PHỤC VỤ KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU NGŨ VỊ TỬ NGỌC LINH (SCHISANDRA SPHENANTHERA REHDER & E.H WILSON) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà PGS.TS Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: VIỆN DƯỢC LIỆU HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Dược Liệu với hướng dẫn PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà PGS.TS Phương Thiện Thương Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phương Thiện Thương PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà định hướng nghiên cứu, hướng dẫn góp ý giúp em hồn thành khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Dược Liệu cán bộ, anh chị khoa Hóa phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược Liệu tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ em học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Hồ Ngọc Hoạt MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .6 DANH MỤC CÁC BẢNG .7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .8 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung họ Ngũ vị (Schisandraceae) 1.2 Tổng quan chi Schisanda 1.2.1 Giới thiệu chi Schisandra .2 1.2.2 Một số loài thuộc chi Schisandra Việt Nam 1.3 Tổng quan Ngũ vị tử Ngọc Linh 1.3.1 Đặc điểm thực vật 1.3.2 Phân bố 1.3.3 Một số kết nghiên cứu thành phần hóa học Ngũ vị tử Ngọc Linh 1.3.4 Các hợp chất lignan 1.3.5 Tác dụng dược lý .9 1.4 Tổng quan schisandrin 10 1.4.1 Công thức cấu tạo 10 1.4.2 Tính chất hóa lý schisandrin 11 1.4.3 Tác dụng sinh học 11 1.4.4 Một số nghiên cứu định tính, định lượng schisandin Ngũ vị tử 13 1.5 Tổng quan phương pháp xác định cấu trúc schisandrin 14 1.6 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng 15 1.6.1 Vài nét phương pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính 15 1.6.2 Vài nét phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Phương tiện nghiên cứu .20 2.2.1 Thiết bị .20 2.2.2 Dụng cụ 21 2.2.3 Hóa chất 21 2.3 Nội dung nghiên cứu .21 2.3.1 Phân lập chất schisandrin từ Ngũ vị tử Ngọc Linh 21 2.3.2 Định tính schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh TLC 21 2.3.3 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh HPLC 21 2.3.4 Thẩm định phương pháp phân tích schisandrin HPLC 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu .22 2.4.1 Phương pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử .22 2.4.2 Phân lập schisandrin từ Ngũ vị tử Ngọc Linh 22 2.4.3 Phương pháp định tính schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh TLC 24 2.4.4 Xây dựng quy trình định lượng schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh phương pháp HPLC 24 2.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích schisandrin HPLC 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN .27 3.1 Phân lập schisandrin 27 3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Ngũ vị tử Ngọc Linh 27 3.1.2 Phân lập schisandrin phương pháp sắc ký cột 27 3.1.3 Xác định cấu trúc hóa học NVT1 .30 3.2 Xây dựng phương pháp định tính schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh phương pháp TLC .32 3.3 Xây dựng quy trình định tính, định lượng schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh phương pháp HPLC 34 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 34 3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 36 3.4 Thẩm định phương pháp .40 3.4.1 Tính chọn lọc 40 3.4.2 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 41 3.4.3 Xây dựng đường chuẩn xác định khoảng tuyến tính 42 3.4.4 Thẩm định độ lặp lại .43 3.4.5 Thẩm định độ thu hồi .44 3.5 Kết định lượng schisandrin mẫu dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh 45 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC .53 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt AS: Hệ số đối xứng pic 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) DĐHK: Dược Điển Hồng Kông EtOAC: Ethyl acetat EtOH: Ethanol H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) LOD: Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lương (Linmit of Quantitation) MeOH: Methanol MS: Mass spectroscopy RS: Độ phân giải SKĐ: Sắc ký đồ ss: schisandrin TLC: Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Công thức cấu tạo số chất phân lập Ngũ vị tử Ngọc Linh………………………………………………………………………………… Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) NVT1 schizandrin theo 13 C-NMR (125 MHz) chất tài liệu tham khảo……………………………………………… Bảng 3.2: Kết khảo sát chương trình gradient………………………………… Bảng 3.3: Các thơng số khảo sát chương trình gradient…………………………… Bảng 3.4: Kết khảo sát dung môi chiết………………………………………… Bảng 3.5: Kết khảo sát nồng độ dung môi……………………………………… Bảng 3.6: Kết khảo sát số lần chiết…………………………………………… Bảng 3.7: Kết khảo sát khoảng tuyến tính……………………………………… Bảng 3.8: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp…………………………… Bảng 3.9: Kết khảo sát độ thu hồi……………………………………… DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Ngũ vị tử Ngọc Linh……………………………………………………… Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo schisandrin………………………………………… Hình 1.3: cấu trúc nhóm dibenzocyclooctadiene…………………………………… Hình 2.1: Quả Ngũ vị tử Ngọc Linh………………………………………………… Hình 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao Ngũ vị tử Ngọc Linh…………………… Hình 3.2: Sắc ký đồ mỏng pha thường schisandrin (1) với phân đoạn………………………………………………………………………………… Hình 3.3: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập schisandrin cao dichloromethan từ Ngũ vị tử Ngọc Linh…………………………………………………………… Hình 3.4: Cơng thức cấu tạo schisandin………………………………………… Hình 3.5: Sắc ký đồ hệ dung mơi……………………………………………… Hình 3.6: Sắc ký đồ chương trình gradient………………………………………… Hình 3.7: Biểu đồ phụ thuộc hàm lượng ss vào dung mơi chiết…………… Hình 3.8: Tóm tắt quy trình xử lý mẫu……………………………………………… Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thêm chuẩn………………… Hình 3.10: Sắc ký đồ mẫu chuẩn schisandrin nồng độ 0,098 µg/ml……………… Hình 3.11: Đường chuẩn phương trình hồi quy tuyến tính schisandrin……… ĐẶT VẤN ĐỀ Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Rehder et Wils.) loài Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera) tìm thấy vào năm 2007 vùng núi Ngọc Linh, Kon Tum Quả dùng y học với nhiều tác dụng như: Chống co giật, thuốc bổ an thần, chữa phế hư, ho tức ngực, di tinh Nhiều nghiên cứu gần cho thấy Ngũ vị tử Ngọc Linh có tác dụng điều trị viêm gan siêu vi mạn [26], [31] Quả ngũ vị tử Ngọc Linh nghiên cứu xác định thành phần hóa học có nhiều hợp chất lignin (schisandrin, gomisin, schisandrin A, schisantherin), hợp chất terpenoid (β-sitosterol, henridilacton, ) tinh dầu dễ bay Một số nghiên cứu gần nước ta phân lập schisandrin tử Ngũ vị tử Ngọc Linh, hoạt chất có nhiều tác dụng như: chống oxy hóa, điều trị viêm gan, hen xuyễn, chống viêm, chống đơng máu Tuy nhiên, schisandrin có hàm lượng thấp loài Ngũ vị tử nam (Schisandra sphenanthera) lại thành phần lồi Ngũ vị tử bắc (Schisandra sinensis) phân bố chủ yếu Trung Quốc Điều gợi ý cho thực nghiên cứu để xác định hàm lượng schisandrin loài Ngũ vị tử Ngọc Linh để tạo nên sở khoa học góp phần đưa Ngũ vị tử Ngọc Linh vào thay Ngũ vị tử bắc nhập từ Trung Quốc Vì tiến hành đề tài “Nghiên cứu sơ thiết lập schisandrin làm chất đối chiếu phụ vụ kiểm nghiệm dược liệu Ngũ vị tử Ngọc Linh (Schisandra sphenanthera Reader & E.H Wilson)” với mục tiêu sau đây: Phân lập schisandrin từ Ngũ vị tử Ngọc Linh làm chất đối chiếu Xây dựng phương pháp định tính schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng schisandrin Ngũ vị tử Ngọc Linh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung họ Ngũ vị (Schisandraceae) Họ Schisandraceae gồm có chi, chi Ngũ vị tử (Schisandra) chi Na rừng (Kadsura) với tổng cộng khoảng 39 lồi Được tìm thấy chủ yếu Đơng Đơng Nam Á, lồi Schisandra đặc biệt tìm thấy đơng nam Hoa Kỳ dãy núi Madre Mexico Người ta tìm thấy Trung Quốc có khoảng 27 lồi thuộc chi có 16 lồi đặc hữu [19], [34] Đặc điểm chung hình thái học họ Schisandraceae: Cây thân leo, hóa gỗ, đơn tính, khác gốc Lá mọc xen kẽ mọc chùm vòng cành Hoa mọc lách cuối cành, thường đơn độc mọc thành cặp cụm lên đến Bộ nhị khác nhau, có 4-80 nhị, rời chặt chẽ, đơi tập hợp thành khối gần hình cầu Nhụy hoa có 12-300 nỗn, nỗn gập đơi Quả tập hợp noãn rời, vỏ nạc Hạt thường 1-5, có nhiều hơn, hạt dẹt có nhiều nội nhũ [5], [19], [34] 1.2 Tổng quan chi Schisanda 1.2.1 Giới thiệu chi Schisandra Đặc điểm hình thái học chi Schisandra: Cây thân leo, hóa gỗ, khơng có lơng, đơn tính khác gốc Lá hình elip hình trứng rán, thường mọc xen kẽ Hoa mọc lách nách, thường mọc đơn độc Bộ nhị từ 4-60 nhị, rời rạc tập hợp thành khối cầu Nhụy hoa có 12-120 nỗn, đầu nhụy hình dùi Quả tụ tập lại với đế hoa thành chùm, chín cho màu đỏ gặp chín cho màu đen Hạt thường hoặc 3, nhẵn nhăn nheo [19], [34] Phân bố: Chi Schisandra gồm 23 lồi phân bố chủ yếu Đơng Á Đơng Nam Á, loài đặc biệt Bắc Mỹ, Trung Quốc phát khoảng 19 lồi (12 lồi đặc hữu) [19], [34] Phân bố số loài giới: