KLTN-DSĐH-DTX

i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với giúp đỡ tận tình thầy giáo, em hồn thành khóa luận Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Tống Thị Thanh Vượng tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến cho em suốt trình thực đề tài viết khóa luận Em xin bày tỏ lịng biết ơn tới lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia, PGS TS Lê Thị Hồng Hảo tạo điều kiện giúp em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn TS Trần Cao Sơn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực khóa luận Em gửi lời cảm ơn tới anh chị, người làm việc Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cho em hồn thành khóa luận Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên em, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng tránh thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy cô bạn sinh viên Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Vũ Ngọc Khánh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố sinh học biển 1.2 Độc tố sinh học biển thủy sản 1.3 Khái quát chung độc tố nhóm Okadaic acid (OA) 1.3.1 Nguồn gốc tích tụ độc tố 1.3.2 Tính chất 1.3.3 Độc tính 1.3.4 Cơ chế gây độc 1.3.5 Triệu chứng ngộ độc 1.3.6 Tình hình ngộ độc 1.4 Các phương pháp xác định độc tố gây tiêu chảy 1.4.1 Thử nghiệm sinh học 1.4.2 Thử nghiệm sinh hóa 1.4.3 Thử nghiệm hóa học 1.5 Tổng quan tóm lược sắc ký lỏng khối phổ 13 1.6 Tóm lược phương pháp làm chiết pha rắn .16 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.2 Nguyên vật liệu-trang thiết bị 18 2.2.1 Nguyên vật liệu 18 2.2.2 Dụng cụ 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 iii 2.3.1 Khảo sát phương pháp 19 2.3.2 Thẩm định phương pháp .19 2.3.3 Ứng dụng phương pháp 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp phân tích độc tố nhóm OA .20 2.4.2 Quy trình thẩm định phương pháp 21 2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Khảo sát phương pháp phân tích DSP 24 3.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ 24 3.1.2 Điều kiện sắc ký lỏng 27 3.1.3 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 28 3.2 Thẩm định phương pháp 34 3.2.1 Tính đặc hiệu 34 3.2.2 Xác định khoảng tuyến tính 36 3.2.3 Độ lặp lại độ thu hồi 38 3.2.4 Giới hạn phát giới hạn định lượng 39 3.2.5 Bàn luận 40 3.3 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng anh Tiếng việt AOAC Association of Official Hiệu hội cộng đồng phân tích Analytical Communites thức Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa hóa học áp suất ionization khí Amnesic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây trí APCI ASP nhớ CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lượng va chạm CI Chemical ionization Ion hóa hóa học CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây tiêu chảy DTX1 Dinophysistoxin - DTX2 Dinophysistoxin - EI Electron impact Ion hóa va chạm điện tử ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử GC Gas Chromatography Sắc ký khí ghép khối phổ GS Ion Source Gas Khí nguồn ion HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IP Identification point Điểm nhận dạng IS Ionspray Voltage Thế phun ion LC-MS/MS Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần mass spectrometry v LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ MU Mouse unit Đơn vị chuột NSP Neurotoxic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây độc thần kinh PSP Paralytic Shellfish Poisoning Ngộ độc nhuyễn thể gây liệt R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi S/N Signal to noise ratio Tỉ số tín hiệu nhiễu SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độc tính tương đương số độc tố DSP Bảng 1.2 Liều gây ngộ độc cấp tính độc tố DSP sau tiêm vào phúc mạc Bảng 1.3 Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp LC-MS để xác định độc tố DSP 10 Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn in hóa ESI 24 Bảng 3.2 Kết bắn phá ion mẹ 24 Bảng 3.3 Năng lượng bắn phá ion độc tố nhóm DSP 26 Bảng 3.4 Chương trình gradient 27 Bảng 3.5 Khảo sát qui trình chiết mẫu 30 Bảng 3.6 Khảo sát cột SPE .31 Bảng 3.7 Khảo sát thể tích rửa giải .32 Bảng 3.8 Ion mẹ ion độc tố gây tiêu chảy nhóm OA 34 Bảng 3.9 Sự phụ thuộc diện tích pic nồng độ độc tố gây tiêu chảy nhóm OA 36 Bảng 3.10 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định OA nhuyễn thể 38 Bảng 3.11 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX1 nhuyễn thể 38 Bảng 3.12 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp xác định DTX2 nhuyễn thể 39 Bảng 3.13 LOD LOQ độc tố DSP .39 Bảng 3.14 Kết phân tích độc tố DSP số mẫu thực 41 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Tảo độc chuỗi thức ăn Hình 1.2 Cấu trúc hóa học độc tố DSP Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo nguyên lý hoạt động thiết bị khối phổ 134 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa hoạt động hệ ESI-MS/MS 14 Hình 1.5 Bộ phân tích tứ cực chập ba 15 Hình 2.1 Mơ hình thực nghiệm .20 Hình 3.1 Phổ khối ion mẹ OA DTX2 25 Hình 3.2 Phổ khối ion mẹ DTX1 .25 Hình 3.3 Phổ khối ion OA DTX2 26 Hình 3.4 Phổ khối ion DTX1 26 Hình 3.5 Sắc đồ ion tổng 28 Hình 3.6 Khảo sát qui trình chiết mẫu 29 Hình 3.7 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng qui trình chiết .30 Hình 3.8 Đồ thị khảo sát ảnh hưởng cột chiết pha rắn SPE .31 Hình 3.9 Đồ thị khảo sát thể tích dung mơi chiết .32 Hình 3.10 Qui trình xử lý mẫu tối ưu 34 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu trắng 35 Hình 3.12 Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL mẫu trắng thêm chuẩn OA DTX2 35 Hình 3.13 Sắc đồ mẫu chuẩn 100 ng/mL mẫu trắng thêm chuẩn DTX1 .35 Hình 3.14 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ OA .37 Hình 3.15 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ DTX1 37 Hình 3.16 Đường hồi qui tuyến tính diện tích pic nồng độ DTX2 38 Hình 3.17 LOD OA DTX2 40 Hình 3.18 LOD DTX1 40 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo ước tính Tổ chức nông lương (FAO) nửa xuất thủy sản giới bắt nguồn từ nước phát triển 80% nhập thuộc nước phát triển Các sản phẩm từ thủy sản nguồn thu ngoại tệ quan trọng nước phát triển, có Việt Nam Một thị trường nhập lớn ngành thủy sản Việt Nam Liên minh Châu Âu (EU) Theo quy định Ủy ban liên minh Châu Âu, yêu cầu để nước khối EU xuất thủy sản vào EU phải thực chương trình giám sát dư lượng độc hại thủy sản nuôi (bao gồm nhuyễn thể hai mảnh vỏ) Đồng thời, thủy sản phải phân tích tiêu theo qui định EU trước xuất với đòi hỏi nghiêm ngặt kỹ thuật phân tích Hai nội dung liên quan đến kỹ thuật đóng vai trị việc thực chương trình định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả sinh độc tố) phân tích độc tố sinh học biển, độc tố gây tiêu chảy nhóm gây độc phổ biến Trong loài nhuyễn thể, vẹm vỏ xanh (Perna viridis) lồi có nguy nhiễm độc tố tiêu chảy lớn Một số phương pháp ứng dụng để xác định độc tố gây tiêu chảy nhuyễn thể bao gồm phương pháp thử sinh học, phương pháp sinh hóa, phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Trong số đó, phương pháp sắc ký lỏng khối phổ phương pháp đại, có độ nhạy cao, cho phép xác định nhanh xác Do đó, chọn đề tài: "Nghiên cứu phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2 vẹm vỏ xanh" Với mục tiêu sau: Xây dựng phương pháp xác định độc tố Okadaic acid, DTX1, DTX2 vẹm vỏ xanh LC-MS/MS Áp dụng phương pháp để phân tích số mẫu vẹm Việt Nam CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố sinh học biển Với khoảng 5000 loài thực vật phù du biết nay, điều kiện sinh sống đặc biệt, có khoảng 300 lồi có tốc độ sinh trưởng lớn tạo thành đám tảo với mật độ dày đặc, gọi tượng nở hoa (blooms) Hiện tượng nở hoa có lợi cho việc ni trồng thủy sản môi trường sinh học biển Tuy nhiên số 300 lồi thực vật phù du kể trên, có 40 loài thuộc lớp dinoflagellate diatom loài sinh độc tố biển [15] Chính phong phú loài tảo độc làm cho mật độ chúng nước biển lên đến từ vài nghìn đến vài triệu tế bào lít nước Các độc tố biển tích tụ nhiều loài sinh vật biển cá, cua, nhuyễn thể hai mảnh vỏ (sị, vẹm, trai) (Hình 1.1) Trong nhuyễn thể, độc tố tích tụ chủ yếu tuyến tiêu hóa khơng gây độc cho chúng Khi người động vật tiêu thụ lượng định nhuyễn thể chứa độc tố gây ngộ độc với triệu chứng đa dạng Trên toàn giới, năm có khoảng 60000 trường hợp ngộ độc nhiễm độc tố loài tảo sản xuất Độc tố nhuyễn thể gây hủy hoại môi trường tự nhiên có tác động tiêu cực đến kinh tế, du lịch cơng nghiệp chế biển hải sản Hình 1.1 Tảo độc chuỗi thức ăn 1.2 Độc tố sinh học biển thủy sản Dựa vào cấu trúc hóa học độc tố biển mà người ta chia chúng thành nhóm: thân nước thân dầu Các độc tố gây triệu chứng trí nhớ (ASP), độc tố gây liệt (PSP) độc tố nhóm thân nước, có phân tử khối 500 Da Độc tố gây độc thần kinh (NSP) gây tiêu chảy (DSP), độc tố AZP độc tố khác PTXs, YTXs thuộc nhóm thân dầu, với phân tử khối 600 Da (có thể lên đến 2000 Da) Độc tố sinh học biển nhuyễn thể có nguồn gốc từ sinh vật phù du Thông qua đường thức ăn nhuyễn thể, độc tố tích tụ chuyển hóa thể nhuyễn thể Tất loài nhuyễn thể (động vật thân mềm ăn thức ăn phương thức màng lọc) có nguy bị nhiễm độc tố Tuy nhiên, chúng thường thấy số lồi sau: PSP thường có vẹm, nghêu, sị, điệp; DSP thường có vẹm, trai, điệp; ASP thường có vẹm; NSP thường có trai, vẹm [10] 1.3 Khái quát chung độc tố nhóm Okadaic acid (OA) Độc tố nhóm OA thành phần độc tố tiêu chảy (DSP), gồm có chất: Okadaic acid, Dinophysistoxin-1 (DTX1), Dinophysistoxin-2 (DTX2) Ngồi cịn có Yessotoxin (YTXs) Pectenotoxin (PTXs) thuộc nhóm độc tố DSP, thường xuất nhóm OA trường hợp ngộ độc nhiên chúng không gây tiêu chảy Do đó, số người cho nên loại bỏ nhóm chất khỏi nhóm độc tố gây tiêu chảy 1.3.1 Nguồn gốc tích tụ độc tố Độc tố nhóm OA sản xuất giống tảo Dinophysis, giống tảo điều kiện môi trường thuận lợi phát triển nhanh gây tượng nở hoa Chúng hay bắt gặp vùng biển nhiệt đới ơn đới, ven biển ngồi khơi Ở Việt Nam, chúng hay bắt gặp vùng biển Thừa Thiên - Huế, biển Bà Lụa tỉnh Kiên Giang [4] Có lồi tảo thuộc giống Dinophysis xác nhận sản sinh độc tố nhóm OA, bao gồm: D fortii (Nhật Bản), D acuminata (châu Âu), D acuta, D norvegica