KLTN-DSĐH-Huyền sâm

LỜI CẢM ƠN Khóa luận hồn thành Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu hướng dẫn PGS.TS Phương Thiện Thương PGS TS Vũ Văn Điền Lời xin bày tỏ lịng kính trọng lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Phương Thiện Thương PGS TS Vũ Văn Điền người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình, ln góp ý, giúp đỡ động viên tôi, đưa ý kiến q báu để hồn thiện khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Dược liệu tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành khóa luận hạn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt anh Nguyễn Đình Qn người ln theo sát, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất thầy trường Đại học Đại Nam nói chung khoa Dược nói riêng dạy dỗ, truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt năm học tập rèn luyện trường để chuẩn bị sẵn sàng phục vụ cho việc làm khóa luận Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên, giúp đỡ động viên lúc khó khăn, bận rộn, ln tạo nguồn động lực giúp cố gắng phấn đấu suốt thời gian học tập nghiên cứu hồn thành khóa luận Mặc dù cố gắng để hoàn thành đề tài, song cịn thiếu sót hạn chế Tơi mong nhận ý kiến đóng góp, phê bình Q thầy bạn đọc Tơi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hằng i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Huyền Sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl) 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.3 Phân bố 1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.5 Thành phần hóa học 1.1.6 Tác dụng, công dụng 1.2.Tổng quan harpagid harpagosid 10 1.2.1.Đặc điểm tính chất 10 1.2.2.Tác dụng sinh học 11 1.2.3.Các phương pháp định lượng harpagid harpagosid 12 1.3.Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) [1], [2] 18 1.3.1 Nguyên tắc hoạt động sơ đồ cấu tạo chung 18 1.3.2.Một số thông số đặc trưng trình sắc ký 19 1.3.3.Các phương pháp định lượng HPLC 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 22 2.2.1 Chất chuẩn 22 2.2.2 Hóa chất 22 2.2.3 Thiết bị 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Quy trình xử lý mẫu 23 2.3.2 Thẩm định phương pháp 25 2.3.3 Áp dụng số mẫu dược liệu Huyền sâm 28 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 28 Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Thẩm định phương pháp định lượng HPLC 29 3.1.1 Độ chọn lọc phương pháp 29 ii 3.1.2 Độ thích hợp hệ thống 30 3.1.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 31 3.1.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.1.5 Độ lặp lại 33 3.3.6 Độ 34 3.2 Áp dụng phương pháp định lượng harpagid harpagosid mẫu Huyền sâm 35 Chương BÀN LUẬN 36 4.1 Về đối tượng nghiên cứu 36 4.2 Về phương pháp định lượng 36 4.3 Về kết định lượng harpagid harpagosid mẫu dược liệu Huyền sâm 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học ACN Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Hiệp hội nhà hóa phân Communities tích thống CCl4 Carbon tetraclorua CE Capillary electrophoresis COX - Cyclooxygenase - DĐHK Dược điển Hồng Kông DĐVN Dược điển Việt Nam HPLC HPLC - DAD Tiếng Việt High performance liquid chromatography Điện di mao quản Sắc ký lỏng hiệu cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography diode array detector ghép nối detector diod Nồng độ ức chế 50% đối IC50 Inhibitory Concentration IL Interleukin iNOS Inducible nitric oxide synthase Tổng hợp nitric oxide IκB Inhibitor of nuclear factor – kappa B Chất ức chế κB JNK c-Jun N-terminal kinase Lộ trình Janus kinase Liquid chromatography tandem mass Sắc ký lỏng ghép khối phổ spectrometry lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng LPS Lipopolysaccharid LC-MS/MS iv tượng thử Lộ trình tín hiệu protein MAPK Mitogen – activated protein kinase mARN Messenger acid ribonucleic ARN thông tin NF-κB Nuclear Factor – kappa B Yếu tố nhân κB NO Nitric oxide PGE2 Prostaglandin E2 TLTK kinase hoạt hóa phân bào Tài liệu tham khảo TNF-α Tumor Necrosis Factor α Yếu tố hoại tử khối u alpha R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi ROS Reactive oxygen species Gốc tự oxy hóa RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.Thành phần hóa học Huyền sâm Bảng CTCT số iridoid glycoside Huyền sâm Bảng 3.Một số phương pháp định lượng harpagid harpagosid Huyền sâm 13 Bảng Các mẫu dược liệu Huyền sâm nghiên cứu 22 Bảng Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp 30 Bảng Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích píc chất 31 Bảng 3 Kết xác định LOD LOQ phương pháp 33 Bảng Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp 33 Bảng Kết thẩm định độ phương pháp 34 Bảng Kết hàm lượng harpagid harpagosid số mẫu Huyền sâm 35 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Hình ảnh Huyền sâm Hình Hình ảnh dược liệu Huyền sâm Hình Cơng thức cấu tạo harpagid 10 Hình Công thức cấu tạo harpagosid 10 Hình Phản ứng thủy phân harpagid harpagosid với β-glucosidase 11 Hình Sơ đồ khối máy sắc kí lỏng hiệu cao 18 Hình Hình ảnh dược liệu Huyền sâm……………………………………… 22 Hình Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp 29 Hình So sánh phổ mẫu thử Huyền sâm mẫu chuẩn 30 Hình 3 Đường chuẩn harpagid harpagosid 32 vii ĐẶT VẤN ĐỀ Rễ Huyền sâm (Radix Scrophulariae) thảo dược quý có nguồn gốc từ Trung Quốc di thực vào Việt Nam năm 1960 Huyền sâm dùng vị thuốc làm mạnh tim, giảm sốt, chống viêm điều trị chứng sốt nóng, khát nước, phát ban, miệng lưỡi lở loét, viêm họng, viêm amidan, táo bón, mẩn ngứa, ho khan, mụn nhọt [8], [11], chống ung thư [38], [40], điều trị tăng huyết áp, lao phổi [15]… Các nghiên cứu nước cho thấy rễ Huyền Sâm có chứa iridoid glycosid phenylpropanoid glycosid đại diện harpagid, harpagosid, ningpogenin, angorosid C số thành phần khác phytosterol, flavonoid, acid béo, saponin, đường,….[11], [40] Trong harpagid harpagosid thành phần quan trọng Dược điển Việt Nam (DĐVN) V sử dụng làm tiêu chí đánh giá chất lượng dược liệu Huyền sâm Với nhiều công dụng quý, ngày huyền sâm sử dụng phổ biến Việt Nam Nguồn dược liệu phần trồng Việt Nam, phần lại nhập từ Trung Quốc Do chênh lệch vĩ độ, khác biệt điều kiện tự nhiên khí hậu, thổ nhưỡng mà hàm lượng hoạt chất Huyền sâm vùng khác Trước đây, công tác kiểm tra chất lượng dược liệu Huyền sâm Việt Nam thường thực theo DĐVN IV nhiên tiêu quy định dừng lại mức định tính, chưa có tiêu định lượng để đánh giá hàm lượng hoạt chất nên kết thu chưa phản ánh xác chất lượng dược liệu Huyền sâm Hiện nay, DĐVN V quy định phương pháp phân tích định lượng hoạt chất dược liệu Huyền sâm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tuy nhiên nước ta chưa có nghiên cứu tiến hành để khảo sát hàm lượng hoạt chất Huyền sâm trồng vùng khác Việt Nam Nhằm mục đích tìm hiểu sâu hàm lượng harpagid harpagosid số mẫu dược liệu Huyền sâm trồng địa phương khác nhau, từ góp phần vào việc chọn giống có chất lượng tốt để phát triển nguồn dược liệu quý giá Từ lý trên, thực đề tài “Khảo sát hàm lượng harpagid harpagosid số mẫu dược liệu Huyền sâm Radix Scrophulariae trồng số vùng Việt Nam” với mục tiêu sau: 1 Thẩm định phương pháp định lượng harpagid harpagosid dược liệu Huyền sâm phương pháp HPLC Áp dụng phương pháp HPLC để định lượng harpagid harpagosid số mẫu dược liệu Huyền sâm trồng số vùng Việt Nam Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Huyền Sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl) 1.1.1 Vị trí phân loại Huyền sâm có tên khoa học: Scrophularia ningpoensis Hemsl Scrophularia buergeriana Miq [4], [7] Theo phân loại thực vật học Huyền sâm thuộc Giới: Thực vật; Ngành: Ngọc Lan – Magnoliophyta; Lớp: Ngọc Lan – Magnoliopsida; Bộ: Hoa mõm chó – Scrophulariales; Họ: Hoa mõm chó – Scrophulariaceae; Chi: Scrophularia [3] Huyền sâm cịn có tên gọi khác nguyên sâm, hắc sâm, ô nguyên sâm, giác sâm, quảng huyền sâm [8], [11] 1.1.2 Đặc điểm thực vật Huyền sâm loài thân thảo, sống nhiều năm, cao 1,5 – 2m Rễ củ hình trụ, dài – 12cm, bên thường phân nhánh, vỏ màu vàng xám, sau chế biến vỏ màu nâu nhạt bên màu đen, mềm dẻo Thân thẳng, hình vng, có rãnh dọc, non có lơng tơ, sau nhẵn có lơng tuyến Lá mọc đối, hình trứng hay hình mác, dài – 20cm, rộng 3,5 – 12cm, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có rang cưa nhỏ, mặt màu lục sẫm, mặt nhạt có lơng nhỏ rải rác Cuống dài – 4cm (hình 1.1) Cụm hoa mọc thân kẽ đầu cành thành chùy to gồm nhiều xim tán; hoa màu vàng nâu tím đỏ Ống tràng hoa hình chén, cành hình mơi, chia làm thùy, đài có hàn liền, mép mỏng, mặt ngồi có lơng tuyến, tràng hình chén có mơi dài mơi dưới; nhị có dài, ngắn thối hóa gần hình trịn Quả nang, hình trứng, dài – 9cm, có đài tồn hạt nhiều, màu đen Mùa hoa quả: tháng – 10 [8], [11] Hình 1 Hình ảnh Huyền sâm