Toan van luan an - Hoang Minh Chau

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HỒNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƢỢC LIỆU HOÀNG MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CHỦ YẾU VÀ ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY HOẠT CHẤT CỦA CÂY DÂY THÌA CANH (GYMNEMA SYLVESTRE (RETZ.) R Br EX SCHULT.) LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC LIỆU - DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 9720206 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án cơng trình khoa học riêng tơi hướng dẫn PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu Các số liệu, kết trình bày Luận án trung thực, khách quan chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Luận án NCS Hoàng Minh Châu LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành Luận án này, nhận nhiều giúp đỡ quý báu tập thể thầy cô giáo, nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Trước hết, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Văn Ơn PGS.TS Nguyễn Thị Bích Thu người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu, hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Dược liệu, thầy cô Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội hỗ trợ nhiều q trình nghiên cứu hàn thành luận án Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: - GS Oh Wen Keun, Khoa Dược, trường ĐH Quốc Gia Seoul, Hàn Quốc - Thạc sỹ Phạm Hà Thanh Tùng, Giáo viên môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, Nghiên cứu sinh Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc - GS.TS Nguyễn Thanh Kỳ, nguyên Hiệu trưởng trường Đại học Dược Hà Nội - PGS.TS Đỗ Thị Hà, phó trưởng khoa Hóa Thực vật, Viện Dược liệu - PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh, trưởng Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội Đã tạo điều kiện giúp đỡ,hướng dẫn đóng góp ý kiến q báu cho tơi hồn thiện Luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thân gia đình, đến người đồng nghiệp công ty Nam Dược ủng hộ, gánh vác công việc tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu NCS Hoàng Minh Châu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN ALP ALAT ASAT ARN AUC COSY DMSO DMEM DTT DTC ĐTĐ EA EDTA : : : : : : : : : : : : : : ESI- MS : EtOH GAPDH : : GACP – WHO : G.albiflorum G alterfolium G.griffithii G hirsutum G inodorum G.latifolium G.sylvestre G.yunnansense G montanum Gla Glc GM GS : : : : : : : : : : : : : Acid deoxyribonucleic Alkaline Phosphatase Chỉ số men gan Chỉ số men gan Acid ribonucleic Diện tích dƣới đƣờng cong (Area under the curve) Phổ Cosy (Correlation Spectroscopy) Dimethyl sulfoxid Dulbecco's Modified Eagle's medium Dithiothreitol Dây thìa canh Gymnema sylvestre Đái tháo đƣờng Ethyl acetat Acid ethylene diamin tetraacetic Phổ khối lƣợng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) Ethanol Glyceraldehyd 3- phosphate dehydrogenase Thực hành trồng trọt, thu hái, chế biến tốt dƣợc liệu theo tiêu chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới Gymnema albiflorum Gymnema alterfolium Gymnema griffithii Gymnema hirsutum Gymnema inodorum Gymnema latifolium Gymnema sylvestre Gymnema yunnansense Gynema montanum Acid glucuronic Glucose Gymnemagenin Gymnema sylvestre GS3 GS4 G3PDH HBA1C HDL HE x 400 HFD : : : : : : : HMBC : HPLC : HRESI MS : HSQC : IR MeCN MeOH NFD : : : : NMR : NOESY NP LDL LOL LOD LOQ OA OVL PBS PTP1B p-NPP RP SD STZ TG TLC : : : : : : : : : : : : : : : : Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase Chỉ số gắn kết đƣờng hemoglobin hồng cầu High density lipoprotein – Lipoprotein tỷ trọng cao Nhuộm Hematoxylin – Eosin, độ phóng đại 400 lần Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity) Sắc ký lỏng hiệu cao ( High- performance liquid chromatography) Phổ khối lƣợng phun mù điện tử phân giải cao (High resolution Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) Phổ tƣơng tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single Quantum Connectivity) Insulin receptor Acetonitril Methanol Chế độ ăn bình thƣờng (Nomal fat diet) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance Spectrometry) Phổ Noesy (Nuclear Overhause Effect Spectroscopy) Pha thƣờng (Normal phase) Low density lipoprotein- Lipoprotein tỷ trọng thấp Giới hạn tuyến tính ( Limit of Linear) Giới hạn phát ( Limit of Detection) Giới hạn định lƣợng ( Limit of Qualification) Acid oleanolic Chồng lấn (Overlap) Phosphate buffered saline Protein tyrosine phosphatases p-nitrophenyl phosphate Pha đảo (Reverse phase) Độ lệch chuẩn (Standard deviation) Streptozocin Triglycerid Sắc ký lớp mỏng TLTK UA Xyl H NMR 2-NBDG 2D-NMR 13 C -NMR : Tài liệu tham khảo : Acid ursolic : Xylose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear : Magnetic Resonance Spectrometry) Glucose fluorescent 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol: 4- yl)Amino)-2-Deoxyglucose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (Two – dimension : Nuclear magnetic resonance Spectrometry) Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 : Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh mục loài thuộc chi Gymnema R Br giới Bảng 1.2 Danh mục loài thuộc chi Gymnema R Br Việt Nam Bảng 1.3 Các hợp chất saponin có khung olean DTC G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học hợp chất alternosid phân lập từ G.alternifolium (Lour.) Merr Bảng 1.5 Cấu trúc hóa học số saponin khung olean Gymnema inodorum (Lour.) Decne Bảng 1.6 Một số hợp chất saponin khung dammaran phân lập từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Bảng 1.7 Tổng hợp số tác dụng sinh học số loài thuộc chi Gymnema R.Br Gymnema R.Br Bảng 1.8 Hàm lƣợng Gymnemagenin mẫu DTC thu theo tháng với cách làm khô khác 10 16 17 19 26 30 Bảng 2.1 Thời gian thu mẫu DTC G.sylvestre R Br ex Schult 33 Bảng 2.2 Chế độ ăn NFD HFD tính 100g thức ăn 40 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR chất 49 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR chất 53 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR chất 57 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR chất 59 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR chất 63 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR chất 6,7 67 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR chất 72 Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ glucose máu chuột sau tuần ăn thức ăn giàu chất béo 77 Bảng 3.9 Vi thể tụy chuột sau tuần uống mẫu 80 Bảng 3.10 Hoạt tính ức chế enzyme PTP1B chất 1-8 86 Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR TCNH, aglycon chất gymnemagenol tham khảo 93 Bảng 3.12 Tính thích hợp của hệ thống 101 Bảng 3.13 Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu chất đối chiếu 101 Bảng 3.14 Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp mẫu thực 102 Bảng 3.15 Kết khảo sát khoảng tuyến tính phƣơng pháp 102 Bảng 3.16 Kết khảo sát tính phƣơng pháp 103 Bảng 3.17 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp 105 Bảng 3.18 Hàm lƣợng gymnemagenol mẫu dịch chiết thuỷ phân DTC theo tháng 105 Bảng 4.1 Danh sách chất phân lập từ Dây thìa canh 111 Bảng 4.2 Sinh khối DTC vùng trồng Nam Định thời điểm thu hoạch 120 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc khung olean hợp chất G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.2 Cấu trúc nhóm hợp chất saponin khung olean Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.3 Cấu trúc hóa học chung alternosid phân lập từ lồi G.alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.4 Cấu trúc nhóm hợp chất alternosid phân lập từ G Alternifolium (Lour.) Merr Hình 1.5 Cấu trúc số hợp chất saponin có khung olean phân lập từ Gymnema inodorum (Lour.) Decne 15 Hình 1.6 Cấu tạo gymnemasid VI gymnemasid VII 18 Hình 1.7 Cấu tạo chung gymnemasid I-V 18 Hình 1.8 Cấu trúc nhóm gymnemasid phân lập từ G sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 1.9 Sự thay đổi hàm lƣợng ginsenosid Rg1, Re Ro rễ nhân sâm theo tuổi thu hái Hình 1.10 Hàm lƣợng gymnemic acid II tại phận Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult Hình 2.1 Lá hoa Dây thìa canh vùng trồng Hải Hậu, Nam Định Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng hạ glucose máu chuột nhắt ĐTĐ typ 16 17 19 30 31 34 41 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất, phân lập chất từ Dây thìa canh 47 Hình 3.2 Cấu trúc hóa học chất 49 Hình 3.3 Các tƣơng tác cộng hƣởng từ hai chiều (2D-NMR) chất 51 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học chất 53 Hình 3.5 Các tƣơng tác HMBC (H C) COSY (H-H) chất 55 Hình 3.6 Cấu trúc hóa học chất 56 Hình 3.7 Các tƣơng tác HMBC (H C) COSY (H-H) chất 56 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học chất 59 ... Magnetic Resonance Spectrometry) Glucose fluorescent 2-( N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol: 4- yl)Amino )-2 -Deoxyglucose Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân chiều (Two – dimension : Nuclear magnetic resonance Spectrometry)... Gymnema hainanense Tsiang Trung Quốc [20] 18 Gymnema hirtum Ridl Malaysia [80] 19 20 Gymnema javanicum Koord Trung Quốc, Ấn độ, Đông Nam Á [79] Java [80] 21 Gymnema khandalense Santapau Maharashtra... LOD LOQ OA OVL PBS PTP1B p-NPP RP SD STZ TG TLC : : : : : : : : : : : : : : : : Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Một phân đoạn chiết xuất Dây thìa canh Glycerol - 3- phosphate dehydrogenase