Nghiên cứu nhân giống một số dòng tếch (tectona grandis linn) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp H Tây 2007 Bộ giáo dục đào tạo Bộ nông nghiệp PTNT Trường đại học lâm nghiệp Nguyễn thị thuỳ Dương Nghiên cứu nhân giống số dòng tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Chuyên ngành: Lâm học Mà số: 60.62.60 Luận văn thạc sĩ khoa học Lâm nghiệp Người hướng dẫn: T.S Hà huy thịnh H Tây 2007 Lời nói đầu Nâng cao chất lượng đào tạo nghiên cứu khoa học mục tiêu quan trọng việc đào tạo cao học Trường đại học Lâm nghiệp Để hoàn thành chương trình đào tạo Cao học Lâm nghiệp khoá học 2005- 2007, đồng ý Khoa sau đại học - Trường Đại học Lâm nghiệp, thực đề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Được trí Ban lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô - Trung tâm nghiên cứu giống rừng Để đạt kết học tập hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả đà nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Trường đại học Lâm nghiệp, đặc biệt Khoa sau đại học, tất thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng Cho phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến thầy, cô giáo, đặc biệt T.S Hà Huy Thịnh Th.S Đoàn Thị Mai, toàn thể cán công nhân viên trung tâm đà tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn Trong luận văn tránh khỏi khiếm khuyết, mong bảo bổ sung ý kiến nhà khoa học, bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Tây, Ngày 25/09/2007 Tác giả Đặt vấn đề Theo định thủ tướng phủ (QĐ số 17/2006/NĐ-TTg), đến năm 2020 phải tạo giống trồng, vật nuôi có suất cao, chất lượng hiệu kinh tế cao phục vụ tốt nhu cầu chuyển đổi cấu kinh tế lĩnh vực Nông nghiệp Phát triển nông thôn Một nhiệm vụ ngành Lâm nghiệp phát triển vi nhân giống đáp ứng đủ nhu cầu giống Lâm nghiệp vào năm 2015 [16] Tếch loài sinh trưởng nhanh có biên độ sinh thái rộng gỗ Tếch sử dụng phổ biến xây dựng làm đồ gỗ gia dụng có khả chống mối mọt, chịu nước lâu ngày, mặt gỗ có độ bóng cao Trong công nghiệp chế biến gỗ: Tếch loài có chất lượng gỗ mịn bóc tách thành mỏng Do gỗ Tếch có tỷ trọng nhẹ, bị hà bám, chịu va đập ngâm nước mặn nên dùng công nghiệp đóng tàu Mặt khác, nhu cầu thương mại gỗ Tếch ngày tăng thay số loài gỗ quý khác[42] Cây Tếch trồng thăm dò nước ta vào khoảng năm 30 kỷ 20 Lúc đầu, Tếch trồng thử công viên đường phố nhiều tỉnh như: Hà Giang, Tuyên Quang, Sơn La, Lai Châu, Hà Nội, Đắc Lắc, Đồng Nai, Tây Ninh, Sài Gòn Cũng thời gian riêng Lộc Ninh, Tỉnh Bình Phước đà gây trồng Tếch thành khu rừng nhỏ Vào năm 60, với nguồn giống thu hái từ Lộc Ninh đà trồng thành công khu rừng Tếch 200 Định Quán, tỉnh Đồng Nai khu rừng Tếch Eak Mat, tỉnh Đắc Lắc Sau năm 1975, Tếch trồng mở rộng nhiều lâm trường tỉnh miền Đông Nam Bộ Tây Nguyên như: Đồng Nai, Bình Phước, Tây Ninh, Đắc Lắc, Gia Lai, Kom TumNhưng chưa có giống cải thiện nên chất lượng rừng không cao, suất rừng trồng Tếch nước ta thấp (9 12m3/ năm) [17] Hiện nay, diƯn tÝch rõng TÕch trång míi cđa c¸c n­íc giới năm tăng nhanh, nhiều Indonesia khoảng 1.760 nghìn ha, ấn Độ khoảng 2.450 nghìn ha, Myanmar 139 nghìn ha, Malaysia khoảng nghìn ha, Thái Lan 836 nghìn [29] Việt Nam, diện tích trồng Tếch đạt 1.500 ha, rÊt Ýt so víi c¸c n­íc khu vùc nhiều nguyên nhân khác mà thiếu giống cải thiện nguyên nhân quan trọng Chính công tác chọn tạo nhân giống số dòng tếch có suất cao vấn đề cần thiết Hiện nay, giống sản xuất từ hạt sử dụng phổ biến không đáp ứng nhu cầu trồng rừng rừng giống chuyên canh, hạt giống thu hái xô bồ nên phẩm chất hạt Hơn cách nhân giống gây tượng phân ly tính trạng thụ phấn tự làm cho trồng không đồng dẫn đến suất rừng biến động Một khó khăn suất hạt thÊp (1 rõng 15 ti chØ cho kho¶ng 50 kg hạt) Không thế, hạt Tếch tự nhiên có khả nảy mầm thấp, vườn ươm tỷ lệ nảy mầm không cao, đạt khoảng 5-10% [28] [42] Để khắc phục nhược điểm giải pháp nhân giống sinh dưỡng ngày quan tâm Tuy nhiên loài Tếch phương pháp nhân giống vô tính hom gặp nhiều khó khăn tỷ lệ rễ không cao đạt khoảng 24-30% [3] Chính lý nên giải pháp nhân giống sinh dưỡng nuôi cấy mô tế bào quan tâm nghiên cứu Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, gọi nhân giống in vitro, phương pháp sản xuất từ chồi vượt mẹ cách nuôi cấy chúng ống nghiệm, điều kiện vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát điều kiện hoàn cảnh đồng Nuôi cấy mô tế bào nhân nhanh với số lượng lớn khoảng thời gian ngắn, tiến hành điều kiện phòng thí nghiệm nên hoàn toàn chủ động sản xuất Ngoài ra, kỹ thuật giúp tạo giống mới, tạo nguồn bệnh, tạo có độ đồng cao trì đặc tính tốt mẹ Từ lý đề tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch phương pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.1.1 Khái niệm Nhân giống nuôi cấy mô tế bào thực vật hay gọi vi nhân giống phương pháp sản xuất hàng loạt từ chồi non (cơ quan, mô tế bào) cách nuôi cấy chúng ống nghiệm điều kiện vô trùng tuyệt môi trường thích hợp kiểm soát Thuật ngữ nuôi cấy mô tế bào thực vật hay nuôi cấy in vitro phạm trù khái niệm tất loại nuôi cấy mô tế bào điều kiện vô trùng, bao gồm: Nuôi cấy cây: nuôi cấy thực vật Nuôi cấy phận đà tách khỏi thực thể thực vật: nuôi cấy quan Nuôi cấy phôi thành thục hay chưa thành thục đà tách khỏi thể thực vật: nuôi cấy phôi Nuôi cấy mô bắt nguồn từ quan thực vật: nuôi cấy m« hay nu«i cÊy m« sĐo  Nu«i cÊy tÕ bào đơn lẻ hay cụm tế bào nhỏ môi trường lỏng Nuôi cấy tế bào thực vật sau đà tách bỏ vỏ tế bào, gọi nuôi cấy tế bào trần (protoplast) [14] 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào * Tính toàn (totipotence) Năm 1902 lần nhà thực vật học người Đức Haberlandt đà đưa quan niệm: Mỗi tế bào (đà biệt hoá) lấy từ thể thực vật có khả tiềm tàng để phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ đà biệt hoá chứa toàn thông tin di truyền (ADN) cần thiết thể đó, gặp điều kiện thích hợp tế bào có khả phát triển thành thể hoàn chỉnh, tính toàn tế bào thực vật Tính toàn tế bào sở lý luận nuôi cấy mô tế bào Cho đến nay, người đà hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ * Sự phân hoá phản phân hoá tế bào Cơ thể thùc vËt tr­ëng thµnh lµ mét chØnh thĨ thèng nhÊt bao gồm nhiều quan chức khác nhau, có nhiều loại tế bào khác thực chức cụ thể khác Tuy nhiên, tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự phân hoá tế bào chuyển hoá tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá đảm nhận chức khác thể Quá trình phân hoá biểu thị sau: Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dÃn Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá Sơ đồ 1.1: Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Quá trình gồm có giai đoạn - Sự phân chia tế bào: Quá trình phân chia tế bào xảy mô phân sinh làm cho số lượng tế bào tăng lên cách đáng kể - Sự dÃn tế bào: Tế bào dÃn chiều ngang chiều dọc làm tăng kích thước quan nói riêng toàn thể nói chung Sau hai giai đoạn với trình biệt hoá tế bào phân hoá thành mô có chức riêng biệt, đảm nhận vai trò khác thể sống Tuy nhiên, tế bào phân hoá thành mô chức chúng không hoàn toàn khả phân chia Trong điều kiện định tế bào lại trở thành dạng tế bào phôi sinh tiếp tục trình phân chia cho tế bào có khả tái sinh thành hoàn chỉnh Đây trình phản phân hoá tế bào Về chất phân hoá phản phân hoá trình điều hoà hoạt hoá gen Tại thời điểm trình phát triển cá thể, có số gen bị ức chế hoạt hoá trở lại để tạo tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều xảy theo chương trình đà mà hoá cấu trúc phân tử ADN tế bào Mặt khác, tế bào nằm khối mô thể, thường bị ức chế tế bào xung quanh Khi tế bào tách riêng ra, gặp điều kiện thuận lợi gen hoạt hoá, trình diễn biến theo chương trình đà định sẵn gen 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuẩn bị Mục đích giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo nguồn mẫu để phục vụ cho bước Giai đoạn coi bước hoá vật liệu để nuôi cấy Cây giống đưa khỏi nơi phân bố tự nhiên ®Ĩ chóng thÝch øng víi m«i tr­êng míi, ®ång thêi giảm bớt khả nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy chủ động công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết làm trẻ hoá vật liệu giống 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động Mục đích giai đoạn tạo chồi từ mô nuôi cấy Khi đà có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Người ta th­êng dïng mét sè ho¸ chÊt nh­ HgCl2, Ca(Ocl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mô nuôi cÊy cã thĨ lµ bÊt kú bé phËn nµo cđa (thân, rễ, lá, hoa quả) theo Bhatt mô lấy từ phần non có khả nuôi cấy thành công cao mô lấy từ phận trưởng thành khác [29] Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro Ngoài ra, lựa chọn mô nuôi cấy cần ý tuổi sinh lý mô thấp độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công Các mô lấy thời kỳ sinh trưởng mạnh mùa sinh trưởng cho khả tái sinh tốt (Anolesnon 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu nuôi cấy bổ sung than hoạt tính Polyvinylpyrroline (PVP) vào môi trường [8] Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lƯ m« nhiƠm thÊp, tû lƯ sèng cao, m« tån sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chọn phận nuôi cấy, lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc nêu Giai đoạn thường kéo dài tuần 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh Một ưu điểm phương pháp nhân giống in vitro so với phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, coi giai đoạn then chốt toàn trình nhân giống Hệ số nhân giai đoạn biến động từ đến 50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường phương pháp nhân Để tạo hệ số nhân cao cần lựa chọn môi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn vai trò chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) quan trọng để sản sinh lượng tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều Cytokinin kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường 25 27oC 10 16 chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 1000 3000lux Yêu cầu giai đoạn tạo số lượng tối đa thời gian ngắn đảm bảo sức sống chất di truyền 1.2.4 Tạo hoàn chỉnh (cho rễ) Đây giai đoạn chuẩn bị cho chuyển hệ thống vô trùng đạt kích thước định, chồi chuyển từ môi trường giai đoạn sang môi trường tạo rễ Thường sau tuần chồi xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ giảm lượng Cytokinin tăng lượng Auxin để tạo ®iỊu kiƯn thn lỵi cho sù rƠ cđa chåi Người ta thường dùng chất NAA (Axit -naphtyl axetic), IBA (Axit β-indol butyric) vµ IAA (Axit β-indol axetic) nồng độ 1mg/lít đến mg/lít để tạo rễ cho hầu hết loài trồng Giai đoạn thường kéo dài từ tuần lễ, sau chuyển sang môi trường Auxin để rễ phát triển giai đoạn nhạy cảm với ẩm độ bệnh tật hoạt động rễ phát sinh yếu, chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng 1.2.5 Đưa môi trường tự nhiên Đây giai đoạn chuyển dần từ ống nghiệm nhà kính trời Cây mô chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng nên phải tập cho quen dần với môi trường tự nhiên, tránh thay đổi đột ngột làm sốc bị chết Khi đà cứng cáp đạt tiêu chuẩn định chiều cao, số số rễ đưa giá thể Giá thể tiếp nhận in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước bệnh Phải giữ ẩm cho đưa từ bình nuôi ra, cần trì độ ẩm 50% để không nước làm giàn che để tránh ánh sáng mạnh Sau tuần đưa mô sinh trưởng ổn định, chăm sóc mô tương tự chế độ chăm sóc hom từ hạt 67 Bảng 3.9: Kết vào mẫu số dòng Tếch (90 mẫu/dòng) Dòng Tû lƯ nhiƠm (%) TL chÕt (%) TL bËt chåi (%) ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 TB F SigF 77,78 80 78,89 78,89 77,78 80 78,89 77,78 76,67 76,67 80,00 0,612 0,996 11,11 6,67 10 11,11 13,33 10 8,89 8,89 11,11 8,89 10,00 0,821 0,611 11,11 13,33 11,11 10,00 8,89 10,00 12,22 13,33 12,22 14,44 11,67 0,415 0,912 Cũng giống kết vào mẫu ë thÝ nghiƯm 1, tû lƯ nhiƠm ë TÕch rÊt cao (trên 76,67%) Tỷ lệ bật chồi dòng biến động khoảng 8,89%14,44% trung bình 11,67% gần tương đương với thí nghiệm 1(13,70%) Các dòng VN cho tỷ lệ bật chồi cao nhất, lớn mức trung bình (12,22%14,44%) tiếp đến dòng MD ID cho tỷ lệ bật chồi 11,11%-13,33%, dòng Tếch cđa Th¸i Lan cho tû lƯ bËt chåi thÊp nhÊt (8,89%-10%) Mặc dù có sai khác song kết phân tích phương sai tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ bật chồi tỷ lệ chết dòng Tếch khác có xác suất F tính lớn 0,05 tỷ lệ bật chồi dòng Tếch có nguồn gốc khác sai khác rõ rệt Như vậy, dòng Tếch có phản ứng với công thức khử trùng hay sử dụng loại hoá chất khử trùng cho tất dòng Tếch khác Tóm lại, công thức khử trùng thích hợp cho tất dòng Tếch HgCl2 0,05% thời gian 10 phút 68 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Thí nghiệm nhân chồi sử dụng môi trường MS cải tiến có bổ sung BAP 0,7mg/l NAA 0,5mg/l Mỗi thí nghiệm tiến hành với 50 chồi lặp lại lần, kết tổng hợp phụ biểu 10, bảng 3.11 hình 3.9 đây: Bảng 4.10: Kết nhân chồi số dòng Tếch Dòng Hệ số nhân (lần) Chiều dài chåi (cm) Sè l¸ TB/chåi (l¸) X Sd X Sd X Sd ID 1,89 0,05 4,63 0,34 6,80 1,00 MD1 2,01 0,05 5,12 0,34 7,23 1,20 MD4 1,65 0,39 4,61 0,36 6,78 0,94 TL1 1,58 0,36 4,61 0,33 6,73 0,96 TL2 1,64 0,35 4,59 0,31 7,13 1,27 TL5 1,66 0,30 4,53 0,35 6,75 0,97 VN18 1,88 0,24 4,62 0,35 6,79 1,00 VN21 2,05 0,11 5,23 0,31 7,17 1,25 VN22 1,87 0,10 5,05 0,32 7,14 1,27 VN9 2,04 0,06 4,95 0,32 7,09 1,25 TB 1,83 0,20 4,59 0,33 6,96 1,11 F 24,24 0,340 1,008 SigF 0,000 0,961 0,433 69 LÇn 2.50 2.00 1.89 2.05 2.01 1.88 2.04 1.87 1.65 1.58 1.64 1.66 1.50 Hệ số nhân (lần) 1.00 0.50 Dòng 0.00 ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 Hình 3.9: Biểu đồ hệ số nhân chồi số dòng Tếch Kết cho thấy dòng trội Tếch có nguồn gốc khác cho kết nhân chồi không giống Hệ số nhân chồi biến động khoảng 1,58-2,05 lần, trung bình 1,83 lần Tốt dòng Tếch Việt Nam hệ số nhân chồi đạt 1,87-2,05 lần, tiếp đến dòng ID MD (1,65-2,01lần) cuối dòng TL hệ số nhân chồi thấp giá trị trung bình (1,58-1,66lần) Kết phân tích phương sai cho thấy xác suất F tính hệ số nhân nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác có sai khác rõ rệt Cùng nuôi cấy loại môi trường hệ số nhân chồi dòng Tếch có nguồn gốc khác không gièng Qua tiªu chn Duncan cho thÊy hƯ sè nhân dòng VN21, VN9 MD1 (2,05lần, 2,04lần 2,01lần) tốt tiếp đến dòng ID, VN18 VN22 (1,89lần, 1,88lần 1,87lần) cuối dòng TL5, MD4, TL2 TL1 (hệ số nhân thấp 1,66lần) Xác suất F tính chiều dài chồi số trung bình/chồi dòng Tếch lớn 0,05 có nghĩa sai khác dòng Tếch có nguồn gốc khác Chiều dài chồi tất 70 dòng lớn 4,53 cm số lá/chồi lớn 6,73lá/chồi, chồi đều, khoẻ đẹp, xanh tốt Trong thí nghiệm nhân chồi dòng Tếch ViƯt Nam cã hƯ sè nh©n chåi tèt nhÊt tiÕp đến dòng Malaysia Indoneisa, cuối dòng Tếch Thái Lan Chất lượng chồi tất dòng Tếch thí nghiệm tốt nuôi cấy môi trường dinh dưỡng thích hợp nên chồi lên khoẻ, đẹp, cứng cáp, xanh tốt Như vậy, phản ứng dòng Tếch môi trường nhân chồi không giống nhau, hệ số nhân dòng có sai khác rõ rệt song chất lượng chồi tất dòng tốt nên sử dụng môi trường để nhân giống cho dòng trội Tếch Tuy nhiên, cần tiếp tục nghiên cứu để xác định môi trường nhân chồi thích hợp cho dòng trội Tếch để nâng cao hệ sè nh©n chåi VN9 VN21 MD1 VN22 VN18 ID MD4 TL5 TL1 ảnh 6: ảnh nhân chồi số dòng Tếch TL2 71 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác Chồi đạt tiêu chuẩn 10 dòng Tếch có nguồn gốc khác xử lý thuốc kích thích rễ IBA 1,0% cấy vào cát Mỗi thí nghiệm tiến hành với 50 mẫu lặp lại lần Kết tổng hợp phụ biểu 12, bảng 3.11 hình 3.10 đây: Bảng 3.11: Kết rễ số dßng TÕch Dßng Tû lƯ rƠ (%) Sè rƠ TB/chåi ChiỊu dµi (rƠ) TB/rƠ (cm) ChØ sè rƠ X Sd X Sd X Sd X Sd ID 89.91 1.57 2.30 0.22 2.27 0.17 4.97 0.83 MD1 92.32 7.46 2.14 0.27 2.02 0.23 4.56 1.00 MD4 96.33 0.96 2.35 0.47 2.01 0.32 4.62 0.66 TL1 91.67 3.46 1.95 0.45 1.91 0.25 4.04 1.01 TL2 85.93* 2.49 1.96 0.45 1.70 0.18 3.85 0.98 TL5 84.33* 2.54 1.71* 0.36 1.85 0.22 3.14 0.60 VN18 92.55 4.65 2.38 0.19 2.04 0.24 4.55 1.11 VN21 98.98 0.09 2.16 0.38 2.09 0.23 4.19 1.03 VN22 97.98 0.86 2.11 0.42 2.15 0.30 4.41 1.22 VN9 97.78 0.89 2.50 0.35 2.19 0.34 5.47 1.18 TB 92.78 2.50 2.16 0.36 2.02 0.25 4.38 0.96 F 72,141 12,415 13,213 12,621 SigF 0,000 0,000 0,000 0,000 (* Sai kh¸c rõ rệt với tất dòng lại) 72 % 100.00 98.98 96.33 95.00 90.00 92.32 97.98 97.78 92.55 91.67 89.91 85.93 85.00 84.33 TL re 80.00 Dßng 75.00 ID MD1 MD4 TL1 TL2 TL5 VN18 VN21 VN22 VN9 Hình 3.10: Biểu đồ tỷ lệ rễ số dòng Tếch Cũng giống kết thí nghiệm 7, dòng trội Tếch cho tỷ lệ rễ cao, biến động khoảng 84,33%-98,98% trung bình 92,78% Các dòng Tếch khác có phản ứng không giống với loại chất kích thích rễ Các dòng VN có tỷ lệ rễ cao (92,55%-98,98%) tiếp đến dòng MD (92,32-96,33%) cuối dòng ID TL (84,33%-91,67%) Kết phân tích phương sai cho thấy xác suất F tính tỷ lệ rễ nhỏ 0,05 nên dòng Tếch khác có sai khác rõ rệt Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy dòng VN9, VN22, VN21 MD4 có tỷ lệ sống cao (trên 96,33%) tiếp đến dòng VN18, MD1, TL1 (91,6692,54%) cuối dòng ID, TL2 TL5 tỷ lệ rễ nhỏ 90% 73 Cũng tương tự kết thí nghiệm số rễ TB/chồi dòng Tếch không cao, biến động khoảng 1,71-2,38rễ/chồi, trung bình 2,16rễ/chồi Trong 10 dòng thí nghiệm dòng TL có số rễ trung bình/chồi thấp (nhỏ 2rễ/chồi) dòng lại số rễ trung bình/chồi lớn 2rễ/chồi Kết phân tích phương sai cho F tÝnh = 12,415 cã møc ý nghÜa nhá h¬n 0,05 điều chứng tỏ có khác số rễ TB/chồi dòng Qua tiêu chuẩn Duncan cho thấy số rễ TB/chồi chia thành nhóm nhóm sai khác rõ ràng Dùng tiêu chuẩn Bonferroni để so sánh cặp với cho thấy dòng TL5 sai khác với tất dòng Giữa dòng lại sai khác không rõ rệt Như vậy, phản ứng dòng trội Tếch có nguồn gốc khác với loại chất kích thích rễ kh«ng gièng Song, tû lƯ rƠ cđa tÊt dòng thí nghiệm cao (trên 84,33%), số rễ tương đối cao (trên 3,14) nªn cã thĨ sư dơng thc kÝch thÝch rƠ IBA 1,0% để rễ cho Tếch Song, cần tiếp tục nghiên cứu thí nghiệm rễ cho dòng trội để tìm loại hoá chất nồng độ xử lý thích hợp Nhìn chung, từ giai đoạn vào mẫu đến nhân chồi rễ dòng Tếch Việt Nam cho kết tốt tiếp đến dòng có nguồn gốc từ Inđonêsia Malaysia cuối dòng Tếch Thái Lan Kết giải thích sau: Quá trình nhân giống in vitro chịu ảnh hưởng nhiều nhân tố khác môi trường nuôi cấy (các loại chất khoáng đa lượng, vi lượng, Vitamin ), điều kiện nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm,), nhân tố di truyền, thời gian cấy chuyển ảnh hưởng qua lại nhân tố Trong đó, nhân tố di truyền có ảnh hưởng lớn đến khả nhân giống sinh trưởng phát triển sau Hơn nữa, từ dẫn giống vườn ươm dòng Việt Nam đà sinh trưởng phát triển tốt thích nghi với điều kiện khí hậu địa phương Các 74 dòng Tếch dẫn giống từ Thái Lan, Indonesia Malaysia nằm khu vực Đông Nam điều kiện khí hậu thời tiết có khác biệt nên từ giai đoạn đầu đà sinh trưởng phát triển dòng Tếch Việt Nam Mặc dù môi trường nuôi cấy tất dòng Tếch đồng yếu tố di truyền sức sống ban đầu có ảnh hưởng đến tỷ lệ bật chồi, hệ số nhân tỷ lệ rễ nên dòng Tếch khác cho kết không giống từ giai đoạn vào mẫu, nhân chồi đến rễ Tóm lại, phương pháp nhân giống in vitro thích hợp Tếch Các kết thí nghiệm áp dụng rộng rÃi cho nhiều dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 75 Chương Kết luận, tồn kiến nghị 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu bước đầu nhân giống in vitro số dòng Tếch, đề tài đà đến mét sè kÕt ln sau: C¸c chÊt khư trïng khác có ảnh hưởng tới khả bật chồi mẫu cấy không giống Cùng loại hoá chất sử dụng nồng độ thời gian khác cho kết vào mẫu khác Khư trïng mÉu b»ng HgCl2 0,05% kho¶ng thêi gian 10 phút thích hợp nhất, tỷ lệ nhiễm Ýt vµ tû lƯ bËt chåi cao Thêi gian lấy mẫu cấy ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mÉu nhiƠm vµ tû lƯ mÉu bËt chåi Thêi gian vào mẫu phù hợp với loài Tếch mùa Xuân mùa Hè (từ tháng đến tháng 7) Tỷ lệ mẫu bật chồi vào mùa Xuân (15%) mùa Hè (13,89%) cao so với mùa Thu (6,67%) mùa Đông (3,33%) Môi trường có tác dụng tốt nhân chồi MS WMP cải tiến Môi trường MS cải tiến cho hệ số nhân chồi (1,73lần) chất lượng chồi tốt (5,09 cm/chồi 6,33 lá/chồi) Môi trường WMP cho hệ số nhân chồi cao (2,10lần) chất lượng chồi (4,45 cm/chồi 5,75lá/chồi) môi trường MS cải tiến Môi trường MS cải tiến bổ sung BAP Kinetin có ảnh hưởng rõ rệt đến hệ số nhân sinh trưởng chồi Môi trường thích hợp môi trường có bổ sung thêm 0.5mg/l BAP hệ số nhân chồi đạt 1,99 lần, chiều cao bình quân chồi đạt 4,45cm số bình quân 7,57 lá/chồi Môi trường MS cải tiến có bổ sung chất kích thích sinh trưởng BAP NAA nồng độ khác ảnh hưởng rõ rệt đến khả nhân nhanh vµ kÐo dµi chåi cđa chåi TÕch in vitro Môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm 76 0.7mg/l BAP 0,5mg/l NAA thích hợp nhất, hệ số nhân chồi đạt 2,04 lần, chiều cao chồi đạt 4,93 cm số TB/chồi (8,24 lá/chồi) Môi trường MS/2 cã bæ sung mét sè chÊt kÝch thÝch sinh trưởng nồng độ khác cho tỷ lệ rễ khác Môi trường thích hợp m«i tr­êng MS/2 cã bỉ sung 1.5mg/l IBA cho tû lƯ rƠ lµ 89,48%, sè rƠ TB/chåi lµ 2,3 rƠ/chåi, chiỊu dµi TB/rƠ lµ 1,6 cm/rƠ chØ sè rễ 3,7 Phương pháp cho rễ trực tiếp tỏ hiệu rút ngắn thêi gian rƠ ®ång thêi tû lƯ rƠ cao phương pháp rễ ống nghiệm C«ng thøc thÝ nghiƯm tèt nhÊt IBA 1,0% cho tû lệ rễ cao 98,15%, số rễ bình quân chồi 2,4rễ/chồi, chiều dài rễ 1,8cm/rễ chØ sè rƠ lµ 4,3 Tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë v­ên ­¬m phơ thc rÊt nhiều vào mùa vụ rễ Mùa rễ thích hợp cho loài Tếch mùa Xuân mùa Thu tỷ lệ rễ 94,81% 86,37% Các dòng Tếch khác cho kết vào mẫu, nhân chồi rễ khác điều chứng tỏ nhân tố di truyền có ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro Tếch Trong đó, tốt dòng trội có nguồn gốc Việt Nam (VN9, VN18, VN21 VN22) tiếp đến dòng Malaysia (MD1 vµ MD4) vµ Indonesia (ID), cuèi cïng lµ dòng Tếch Thái Lan (TL1, TL2 TL5) 10 Mặc dù kết có khác dòng kết vào mẫu, nhân chồi rễ dòng tương đối tốt nên áp dụng công thức thí nghiệm thích hợp vào nhân giống cho dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 4.2 Tồn Do thời gian hạn chế kinh nghiệm tác giả có hạn nên đề tài nhiều hạn chế - Chưa nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp ánh sáng, nhiệt độ 77 - Các thí nghiệm môi trường dinh dưỡng phối hợp chất điều hoà sinh trưởng chưa nhiều - Chưa tiến hành thí nghiệm giá thể thích hợp cho Tếch 4.3 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu môi trường sinh dưỡng khác với nhiều tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng khác để có môi trường nuôi cấy tối ưu cho Tếch - Tiếp tục nghiên cứu môi trường nhân chồi rễ thích hợp cho dòng trội Tếch - Nghiên cứu nhân giống Tếch loại vật liệu khác phôi hạt, quả, phôi vô tÝnh… - Nghiªn cøu thư nghiƯm thªm vỊ mét sè loại giá thể phù hợp với Tếch mà có hiƯu qu¶ kinh tÕ 78 Mơc lơc Trang Lêi nói đầu Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình, ảnh sơ đồ Đặt vấn đề Chương Tổng quan vấn đề nghiên cứu 1.1 Khái niệm sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vËt 1.1.1 Kh¸i niƯm 1.1.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bµo 1.2 Các giai đoạn trình nhân giống in vitro 1.2.1 Giai đoạn chuÈn bÞ 1.2.2 Giai đoạn cấy khởi động 1.2.3 Giai đoạn nhân nhanh 1.2.4 T¹o hoàn chỉnh (cho rễ) 1.2.5 Đưa môi trường tự nhiên 1.3 Các nhân tố ảnh hưởng tới trình nhân giống in vitro 1.3.1 M«i tr­êng nu«i cÊy 1.3.2 Các chất điều hoà sinh trưởng 10 1.3.3 M«i tr­êng vËt lý 12 1.3.4 VËt liƯu nu«i cÊy 13 1.3.5 Điều kiện vô trùng 13 1.3.6 Buång nu«i cÊy 14 1.4 øng dơng nu«i cÊy m« tế bào thực vật công tác giống rừng 15 1.4.1 Trªn thÕ giíi 15 1.4.2 ë ViÖt nam 17 1.5 Loµi TÕch ( Tectona grandis Linn) 19 1.5.1 Đặc điểm sinh vật học sinh th¸i häc 19 1.5.2 Giá trị kinh tế Tếch 20 1.5.3 Các nghiên cứu Tếch 20 Chương Mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 24 2.1 Mơc tiªu nghiªn cøu 24 2.2 §èi tượng nghiên cứu 24 2.3 Néi dơng nghiªn cøu 24 79 2.4 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4 VËt liƯu nu«i cÊy 24 2.4.2 Địa ®iĨm, ®iỊu kiƯn bè trÝ thÝ nghiƯm 25 2.4.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 27 2.5 Ph­¬ng pháp thống kê sử lí số liệu 32 Chương Kết nghiên cứu thảo luận 36 3.1 Khö trïng mÉu vËt 36 3.1.1 ¶nh h­ëng loại hoá chất đến khử trùng mẫu vật 36 3.1.2 ¶nh h­ëng cđa mïa vụ đến khả tái sinh chồi bất định ban đầu 39 3.2 ảnh hưởng môi trường chất điều hoà sinh trưởng đến nhân chồi Tếch 43 3.2.1 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 43 3.2.2 ảnh hưởng loại chất điều hoà sinh trưởng đến khả tạo chồi phát triÓn chåi TÕch 46 3.3 ¶nh h­ëng cđa chất điều hoà sinh trưởng, mùa vụ phương thøc rƠ cđa chåi TÕch 54 3.3.1 ảnh hưởng NAA IBA đến khả tạo rễ chồi Tếch ống nghiệm 55 3.3.2 ¶nh h­ëng cđa IBA NAA đến khả rễ chồi Tếch ë v­êm ­¬m 58 3.3.4 ảnh hưởng mùa vụ đến trình rễ chồi Tếch nuôi cấy mô 63 3.4 Khả nhân giống nuôi cấy mô cho dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 65 3.4.1 So sánh kết vào mẫu 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 66 3.4.2 So sánh khả nhân chồi 10 dòng trội Tếch có nguån gèc kh¸c 68 4.4.3 So sánh khả rễ 10 dòng trội Tếch có nguồn gốc khác 71 Chương Kết luận, tồn kiến nghị 75 4.1 Kết luËn 75 4.2 Tån t¹i 76 4.3 KiÕn nghÞ 77 Tài liệu tham khảo Phụ lục 80 Danh mục bảng TT Tên bảng Trang 4.1 ảnh hưởng loại hoá chất thời gian khử trùng đến kết vào mẫu 37 4.2 ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban đầu 41 4.3 ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái sinh chồi Tếch (sau tuần) 44 4.4 ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 48 4.5 ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân nhanh kéo dài chồi Tếch 52 4.6 ảnh hưởng IBA NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch 57 4.7 ảnh hưởng IBA NAA đến tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë v­ên ­¬m 60 4.8 ảnh hưởng mùa vụ đến tỷ lệ rễ chồi Tếch vườn ươm Kết vào mẫu số dòng Tếch (90 mẫu/dòng) Kết nhân chồi số dòng Tếch Kết rƠ cđa mét sè dßng TÕch 4.9 4.10 4.11 60 65 69 72 81 Danh mục hình, ảnh sơ đồ TT 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.8 4.9 4.10 Tên Trang Biểu đồ ảnh hưởng mùa vụ đến khả tái sinh chồi ban 41 đầu Biểu đồ ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả tái 44 sinh chồi Tếch Biểu đồ ảnh hưởng BAP Kinetin đến khả nhân 49 nhanh kéo dài chồi Tếch Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp BAP NAA đến khả nhân 52 nhanh kéo dài chồi Tếch ảnh hưởng BAP NAA đến tỷ lệ rễ cđa chåi TÕch in 56 vitro ¶nh h­ëng cđa IBA NAA đến tỷ lệ rễ chồi Tếch 60 vườn ươm Biểu đồ ảnh hưởng mùa vơ ®Õn tû lƯ rƠ cđa chåi TÕch ë 64 vườn ươm Biểu đồ hệ số nhân chồi số dòng Tếch 69 Biểu đồ tỷ lệ rễ số dòng Tếch 72 Danh mục ảnh sơ đồ TT 2.1 3.1 Tên Trang Chồi Tếch sau vào mẫu 30 ngày 39 Chồi Tếch nuôi cấy sau tuần loại môi trường khác 46 Chồi Tếch hai công thức cho kết nhân chồi tốt 51 ảnh so sánh công thức tốt dùng BAP riên rẽ BAP kết hợp với NAA Chồi Tếch rễ trực tiếp vườn ươm sau 25 ngày ảnh nhân chồi số dòng Tếch Quá trình phân hoá phản phân hoá tế bào Các bước nhân giống in vitro 54 62 70 25 ... nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch (Tectona grandis Linn) phương pháp nuôi cấy in vitro Được trí Ban lÃnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống rừng, đề tài thực phòng nghiên cứu nuôi cấy mô... tài Nghiên cứu nhân giống số dòng Tếch phương pháp nuôi cấy in vitro tiến hành Đây nội dung đề tài cấp Nghiên cứu tuyển chọn nhân giống Xoan ta Tếch có suất cao 3 Chương Tổng quan vấn đề nghiên. .. giới đà có số nước nghiên cứu nuôi cấy mô cho Tếch nước ta nghiên cứu nuôi cấy mô cho loài Tếch chưa đầy đủ Chính đề tài tiến hành nghiên cứu số vấn đề nuôi cấy in vitro cho loài Tếch từ giai