Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên. LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ HỒNG THỊ BÍCH Nghiªn cøu sư dơng kết hợp enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên Chuyờn ngnh: Húa học hợp chất tự nhiên Mã số: 62.44.01.17 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HỐ HỌC HÀ NỘI - 2017 Cơng trình hồn thành Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê Mai Hương PGS TS Nguyễn Quyết Chiến Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi ’, ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ô nhiễm môi trường sức khỏe người tiêu dùng dẫn đến nhu cầu cấp thiết tìm phương pháp thu nhận sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên theo hướng “Xanh” nhằm tăng suất, giảm thời gian, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu giảm ô nhiễm môi trường Nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam vô phong phú với hệ thực vật đặc trưng nguồn sinh vật biển đa dạng, phải kể đến Quế (nguồn dược liệu) cá ngừ (nguồn lợi thủy sản) mặt hàng có giá trị kinh tế, giá trị sử dụng giá trị xuất đầy tiềm Sản phẩm dầu từ quế cá ngừ ngày trọng chúng có giá trị cao Tuy nhiên cơng nghiệp, q trình sản xuất hai loại dầu sử dụng phương pháp truyền thống (cất nước, ép nhiệt) chưa phát huy hết hiệu chiết xuất, gây lãng phí nguồn nguyên liệu Ngày nay, tiến công nghệ sinh học, cơng nghệ enzyme có khả sản xuất lượng lớn enzyme có hoạt lực cao, phổ chất rộng cơng nghệ “XANH” ứng dụng enzyme hỗ trợ trình chiết xuất hợp chất thiên nhiên (enzyme assisted extract- EAE) nhằm tăng hiệu suất, thay dung môi hữu vấn đề cấp thiết Nhằm mục đích phát triển hướng nghiên cứu mới- phân lập làm giàu HCTN enzyme hỗ trợ, lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên” Mục đích Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ enzyme vào trình chiết xuất làm giàu sản phẩm tinh dầu (từ cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassia) axit béo n-3PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ nhằm làm tăng hiệu phát triển hướng nghiên cứu “XANH” khai thác SPTN Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chưng cất tinh dầu từ phận khác quế Cinnamomum cassia: tác động việc xử lý nguyên liệu với enzyme đánh giá qua hiệu suất, thời gian chưng cất, chất lượng sản phẩm tinh dầu (thành phần hóa học, hoạt tính sinh học) - Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp LaccaseHtec2 chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna - Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares: tác động enzyme lên trình đánh giá qua thành phần axit béo n-3 PUFA Những đóng góp luận án Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ enzyme hỗ trợ trình chưng cất tinh dầu từ cảnh quế, vỏ quế C cassia gỗ gió bầu A crassna Sự kết hợp enzyme laccase từ G lucidum enzyme Cellic Htec2 cho trình thủy phân hiệu sử dụng riêng rẽ Kết làm gia tăng hiệu suất, nâng cao chất lượng tinh dầu, giảm thời gian chưng cất Lần đầu tiên, ứng dụng công nghệ hỗ trợ trình phân lập dầu làm giàu axit béo n-3 PUFA từ phụ phẩm đầu cá ngừ hệ enzyme kép Bromelain Lipase CRL Kết phân lập cho hiệu suất 70% so với phương án dung mơi song q trình tạo sản phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng thời giảm thiểu dung mơi hóa chất nhiễm mơi trường Bố cục luận văn: Luận án gồm có 153 trang (khơng kể phụ lục), gồm 55 hình, 32 bảng Nội dung luận án trình bày gồm chương (ngồi Mở đầu-2 trang, kết luận- trang kiến nghị-1 trang); chương bao gồm: Tổng quan tài liệu -38 trang, Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu -11 trang, Thực nghiệm -11 trang Kết thảo luận -63 trang PHẦN - TỔNG QUAN Trong phần này, tổng hợp tài liệu, chia làm mục 1.1 Tổng quan giới thiệu ứng dụng cơng nghệ enzyme giải pháp “hóa học xanh” chiết xuất làm giàu hợp chất thiên nhiên 1.2 Các enzyme sử dụng công nghệ EAE để trích ly dầu làm giàu axit béo n-3 PUFA 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ enzyme chiết xuất làm giàu hợp chất thiên nhiên nước 1.4 Giới thiệu nguyên liệu sản xuất tinh dầu quế 1.5 Giới thiệu nguyên liệu phụ phẩm cá ngừ sản xuất n-3 PUFA PHẦN - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu - Cành quế, vỏ quế Cinnamomum cassiathu xã Tân Đồng, huyện Trấn Yên, tỉnh Yên Bái - Phụ phẩm đầu cá ngừ:08 mẫu đầu cá ngừ (đã bỏ mắt mang) 08 lồi cá ngừ thu Nha Trang- Khánh Hịa Tuy HòaPhú Yên - Enzyme sử dụng nghiên cứu + Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-Đan Mạch) hỗn hợp đa enzyme bao gồm cellulase xylanase + Enzyme laccase enzyme thô thu từ canh trường nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum (được cung cấp Viện Di truyền nông nghiệp) + Nhóm enzyme protease từ vi sinh vật sử dụng hai enzyme Protamex Alcalase (Novozyme- Đan Mạch) + Nhóm enzyme Protease từ thực vật sử dụng hai enzyme Bromelain Papain, enzyme nước, cung cấp công ty Biogreen + Enzyme Lipase CRL (Novozyme- Đan Mạch) sản xuất từ trình lên men nấm men Candida rugosa 2.3 Phương pháp nghiên cứu: phần NCS trình bày phương pháp xác định - Các phương pháp phân tích hóa sinh + Ngun liệu thực vật: phân tích hàm ẩm, cellulose, hemicellulose, lignin, hàm lượng tinh dầu, + Nguyên liệu sinh vật biển: xác định hàm lượng nước, hàm lượng protein, hàm lượng tro, hàm lượng lipid, số axit, số xà phòng hóa, - Phương pháp phân tích thành phần hợp chất GC-MS + Phương pháp xác định thành phần hàm lượng tinh dầu + Phương pháp xác định thành phần, hàm lượng axit béo - Phương pháp xác định sản phẩm trình thủy phân + Phương pháp định lượng đường khử DNS (Miler, 1959) + Phương pháp định lượng protein- axitamin (Bradford, 1976) - Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme + Xác định hoạt độ enzyme Cellulase (Wood, 1987) + Xác định hoạt độ enzyme Xylanse (Bailey, 1992) + Xác định hoạt độ enzyme Laccase (Dinh, 2012) - Các phương pháp thủy phân + Phương pháp thủy phân với dung môi nước (áp dụng cho enzyme cellulase, hemicellulase, protease ) + Phương pháp thủy phân hệ dung môi hai pha (áp dụng cho enzyme lipase) theo (Fernádez Lorente G cs.;2011) - Phương pháp xác định điều kiện tối ưu cho trình thủy phân + Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân + Xử lý số liệu thực nghiệm phương pháp bình phương tối thiểu + Tối ưu hóa q trình thủy phân bằng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm - Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học + Phương pháp xác định hoạt tính kháng VSV kiểm định (Vander Bergher & Vlietlinck, 1991) + Phương pháp xác định khả gây độc tế bào (cytotoxicity) (Likhitayawuid, 1991) triển khai Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) + Phương pháp xác định hoạt tính kháng viêm: thơng qua khả ức chế sản sinh NO tế bào macrophage RAW 264.7 (Lee et al., (2009)) + Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóatrên hệ DPPH theo phương pháp P Yuvaraj et al., (2013) PHẦN - THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chưng cất tinh dầu từ phận khác quế Cinnamomum cassia 3.2 Nghiên cứu thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna 3.3 Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chưng cất tinh dầu từ phận khác quế Cinnamomum cassia 4.1.1 Kết phân tích chất tinh dầu cành lá, vỏ quế C cassia Hàm lượng chất cành vỏ quế C cassia Kết phân tích cho thấy mẫu cành, mẫu vỏ quế mang đặc trưng nhóm thân gỗ với thành phần chủ yếu lignocellulose, chiếm 60% khối lượng nguyên liệu Hàm lượng thành phần cấu trúc gồm cellulose, hemicellulose lignin xác định mẫu cành, có giá trị tương ứng 24,74%; 25,50% 16,28%; mẫu vỏ quế 20,36%, 14,02% 25,78% Hàm lượng thành phần hóa học tinh dầu từ cành lá, vỏ quế C cassia Hàm lượng tinh dầu cành quế, vỏ quế thu chưng cất nước tương ứn 0,69 ± 0,02%, 2,87 ± 0,04% tinh dầu (tính theo ngun liệu khơ gió) Thành phần hóa học tinh dầu cành quế vỏ quế xác định GC-MS Bảng 4.2: Bảng 4.2 Kết phân tích thành phần hóa học tinh dầu cành tinh dầu vỏ quế C cassia Chất Nhóm hidrocarbon Nhóm HC chứa oxy Tổng Phenylpropannoid trans- Cinnamaldehyde Tổng Sesquiterpenoid Sesquiterpen hidrocarbon Sesquiterpen chứa oxy % TD cành, 3,87 95,54 88,73 67,74 2,42 1,99 0,43 % TD vỏ 38,26 60,85 58,83 53,99 40,38 35,87 4,51 Một số thành phần tinh dầu quế C cassia thu thập Văn Yên, Yên Bái (hình 4.1a 4.1b) Benzenepropanal (C9H10O) trans-Cinnamaldehyde (C9H8O) Cinnamyl alcohol (C9H10O) Coumarin (C9H6O2) cis-Cinnamaldehyde (C9H8O) o-Methoxy cinamaldehyde Hình 4.1a Một số thành phần thuộc nhóm phenylpropanoid Copaene (C15H24) Muurolene (C15H24) Calamenene (C15H22) Cadinene (C15H24) Caryophyllene oxide ( C15H24O) Bisabolol (C15H26O) Bisabolene ( C15H24) Nerolidol (C15H26O) Hình 4.1b Một số thành phần sesquiterpen sesquiterpenoid Kết GC- MS phân tích thành phần hóa học tinh dầu cành quế vỏ quế C cassia cho thấy: - Khoảng 28 hợp chất tìm thấy tinh dầu cành quế C cassia, trans-cinnamaldehyde hợp chất (69,74%), theo sau Cinnamyl acetate (17,2%), Benzofuran (5,9%), Benzaldehyde (1,62%), Benzenepropanal (1,59%) Ngoài ra, số thành phần khác xác định với hàm lượng nhỏ 1,00% - Khoảng 38 hợp chất phát tinh dầu vỏ quế C cassia, trans- cinnamaldehyde hợp chất (53,99%), theo sau Copaene (13,86%), Cadinene (7,69%), Benzenpropanal (2,39%) Ngoài ra, số thành phần khác xác định với hàm lượng nhỏ 1,00% - Phenylpropanoid nhóm hợp chất chủ yếu tinh dầu cành quế vỏ quế C cassia thu từ Văn Yên, Yên Bái, trans-cinnamaldehyde thành phần Tổng hợp chất hydrocarbon, hợp chất chứa oxy, phenylpropanoid sesquiterpenoid có khác rõ rệt nguyên liệu cành quế vỏ quế 11 So sánh kết phân tích GC-MS phương án xử lý cho thấy, trình tiền xử lý cành quế enzyme không làm thay đổi chất tinh dầu vỏ quế, mẫu tinh dầu có thành phần cinnamaldehyde có số lượng thành phần quan trọng khác Nhóm phenylpropanoid (C6- C3) nhóm chất phương án xử lý, trans-cinnamaldehyde thành phần có hàm lượng đạt từ 68,49% đến 86,83% Tinh dầu thu cách xử lý nguyên liệu với enzyme Laccase HTec2 riêng rẽ không gây biến động lớn thành phần hóa học, việc xử lý nguyên liệu với hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 làm thay đổi rõ rệt thành phần % số chất quan trọng tinh dầu Cụ thể sau: - Làm giàu số chất mong muốn tinh dầu quế C cassia như: hàm lượngcinnamaldehyde tăng từ 69,74% lên 85,60%, o-methoxy-cinnamaldehyde từ 0% lên 0,23% - Làm giảm hàm lượng số chất khác, đặc biệt cinnamyl acetat giảm từ 17,2% xuống 1,34%, cinnamyl alcohol giảm từ 0,57% xuống 0,29% Sự tăng giảm cinnamaldehyde cinnamyl acetat có mối liên hệ mật thiết với Tác động việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hoạt tính sinh học tinh dầu cành quế - Kết xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Mẫu tinh dầu có sử dụng enzyme hỗ trợ (Tinh dầu EAD) khơng có sai khác hoạt tính kháng khuẩn so với mẫu chiết thông thường Các mẫu tinh dầu quế khơng có hoạt tính kháng P.aeruginosa F oxysporum., có hoạt tính kháng S aureus với 12 MIC = 100 μg/ml, A niger với MIC = 200 μg/ml E coli, B subtilis, S cerevisiae, C albicans MIC = 400 μg/ml Trong số vi sinh vật kiểm định, tinh dầu có hoạt tính kháng khuẩn cao S aureus với MIC 100 µg/ml - Kết xác định hoạt tính gây độc tế bào Hai mẫu tinh dầuđều có hoạt tính gây độc tế bào với nồng độ thử nghiệm ban đầu (40 g/ml) Ở nồng độ thử nghiệm tiếp theo, tinh dầu HD biểu hoạt tính gây độc tế bào với 02 dòng tế bào ung thư gan ung thư biểu mô liên kết (Hep-G2 RD) với giá trị IC50 29,25 6,01 g/ml, tinh dầu EAD biểu hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư (Hep-G2, LU-1 RD) với giá trị IC50 12,89, 25,95 2,34 g/ml Đặc biệt, EAD có hoạt tính mạnh dịng ung thư biểu mô phổi với giá trị IC50 2,34(g/ml) - Kết xác định hoạt tính kháng viêm Cả hai mẫu tinh dầu thể hoạt tính ức chế đại thực bào sản sinh NO khoảng nồng độ từ 6,25 đến 100 μg/ml (P < 0.05 với LPS đối chứng âm), tinh dầu EAD có biểu hoạt tính kháng viêm mạnh tinh dầu HD - Kết xác định hoạt tính chống oxi hóa Hai mẫu tinh dầu thử nghiệm chưa thể khả trung hòa gốc tự DPPH nồng độ nghiên cứu 4.1.3 Tác động việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên trình chưng cất tinh dầu từ vỏ quế C cassia Tác động việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên hiệu suất thu hồi tinh dầu mức độ thủy phân chất vỏ quế 13 Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan mức độ thủy phân tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế Kết cho thấy mối tương quan rõ rệt mức độ thủy phân thành tế bào tỷ lệ gia tăng tinh dầu vỏ quế C cassia Lần lượt từ phương án 01 đến 04, hàm lượng đường khử gia tăng từ lên đến 38,34 µg/ml, cịn hàm lượng lignin giảm từ 25,78 xuống 20,34% Phương án 04, kết hợp enzyme Laccase Htec2 cho hiệu thủy phân cao với hàm lượng đường khử 38,34 µg/ml tỷ lệ gia tăng hiệu suất tinh dầu đạt 14,57% Tác động việc xử lý nguyên liệu với enzyme lên thời gian chưng cất tinh dầu vỏ quế Hình 4.6 Ảnh hưởng thời gian cất đến hiệu suất thu tinh dầu vỏ quế 14 Cũng tương tự cành quế, kết khảo sát vỏ quế cho thấy hệ enzyme Laccase + Htec2 có vai trị tích cực việc giảm thời gian chưng cất tinh dầu quế Tại thời điểm khác trình chưng cất: 2h, 3h, 4h lượng tinh dầu thu từ mẫu vỏ quế xử lý enzyme cao so với không xử lý enzyme Sau 6h chưng cất, lượng tinh dầu đạt cực đại (3,28%) sau 8h mẫu khơng xử lý enzyme đạt cực đại (2,87%) Kết đánh giá tác động hệ enzyme lên thành phần hóa học tinh dầu vỏ quế Bảng 4.9 Thành phần hóa học tinh dầu vỏ quế thu từ nguyên liệu xử lý với hệ enzyme khác Không enzyme Laccase Htec2 Laccase +Htec2 Nhóm hidrocarbon 38,26 26,52 26,29 27,26 Nhóm HC chứa oxy 60,85 71,47 70,35 72,02 Tổng Phenyl propanoid 58,83 65,97 65,73 70,98 trans-cinnamaldehyde 53,99 59,22 58,36 67,6 Tổng sesquiterpen 39,29 30,98 29,85 27,44 Sesquiterpen hidrocarbon 35,87 24,64 24,28 25,08 Sesquiterpen chứa oxy 3,42 6,34 5,57 2,36 Chất So sánh thành phần GC-MS phương án xử lý cho thấy trình tiền xử lý vỏ quế enzyme không làm thay đổi chất tinh dầu quế, mẫu nghiên cứu có thành phần cinnamic aldehyde có số lượng thành phần quan trọng khác, có biến động tỷ lệ nhóm hidrocarbon hợp chất chứa oxy, tỷ lệ phenylpropanoid sesquiterpen Đặc biệt, q trình (Laccase + Htec2)- EAD có gia tăng hàm lượng chất chínhcinnamic aldehyde tăng từ 54,63% % lên 68,37% 15 4.1.4 Kết tìm điều kiện tối ưu cho trình ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 chưng cất tinh dầu từ cành quế Qua phân tích yếu tố ảnh hưởng, chọn yếu tố ảnh hưởng gồm: pH, nhiệt độ T, thời gian t, tỷ lệ enzyme laccase/cơ chất, tỷ lệ enzyme Htec2/cơ chất Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0 để xử lý số liệu ta nhận kết phương trình hồi qui: = 79,73 + 0,48 x1 + 0,56x2 + 1,66 x3 + 2,19 x4 + 0,44 x1x5 0,44 x2x3 - 0,44 x2x4 - 0,69 x3x4 - 1,98 x12 - 1,84 x22 - 1,83 x32 - 1,26 x42 -1,29 x52 Bằng phần mềm tiến hành xem xét mô tả ảnh hưởng cặp tương tác, mơ tả dạng paraboloid tức có điểm cực trị Hình 4.9 Mặt đáp ứng vùng tối ưu cặp yếu tố Như vậy, điều kiện tối ưu cho trình thủy phân cành quế hệ enzyme Laccase + Htec2 pH 5,2, nhiệt độ 440C, Laccases/S = 0,42ml/g, Htec2/S= 1,15%, thời gian 5h30 phút Đề xuất quy trình cơng nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 chưng cất tinh dầu từ cành quế C cassia (hình 4.10) 16 Cành quế Xay, nghiền Tiền xử lý H2O/24h Ủ Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S 1,15%, nhiệt độ 440C, pH 5.2, thời gian 5h30’, tốc độ 200 rpm, Thủy phân Chưng cất tinh dầu Tinh dầu+ Nước Bã nguyên liệu Na2SO4 Tinh dầu Cassia Phân bón Hình 4.10 Sơ đồ quy trình cơng nghệ ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec chưng cất tinh dầu từ cành quế C cassia 4.2 Kết thăm dò ứng dụng hệ enzyme kết hợp Laccase-Htec2 chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna Kết phân tích thành phần chất bột gỗ gió bầu A crassna Kết xác định thành phần kiến tạo nên khung cấu trúc gỗ gió bầu cho thấy gỗ gió bầu mang đặc trưng nguyên liệu chứa lignocellulose bao gồm cellulose 34,75%, hemicellulose 15,27% lignin 29,10% 17 Kết thăm dò tác động hệ enzyme Laccase - Htec2 lên hàm lượng thành phần tinh dầu trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna Dựa kết thu nghiên cứu ứng dụng enzyme chưng cất tinh dầu quế, chọn hệ enzyme LaccaseHtec2 để áp dụng cho việc chưng cất tinh dầu trầm hương Kết sau ngày chưng cất, mẫu đối chứng (mẫu khơng có enzyme) cho 0,024% tinh dầu (tính theo khối lượng mẫu khơ gió), mẫu nghiên cứu (mẫu có enzyme) cho 0,032% tinh dầu, tỷ lệ gia tăng tinh dầu Thành phần hóa học mẫu tinh dầu xác định phương pháp GC-MS Một số thành phần đặc trưng tinh dầu trầm hương Hình 4.11 Một số thành phần đặc trưng tinh dầu trầm hương - Hàm lượng thành phần có giá trị, mang mùi trầm hương đặc trưng (Hình 4.11b) tăng lên rõ rệt, cụ thể cisdihydroagarofuran (0,11%, đối chứng 0%), α-agarofuran (0,17%, đối chứng 0%), agarospirol (0,72%, đối chứng 0,23%), hinesol (0,56%, đối chứng 0,16%), valerianol (2,59%, đối chứng 0,89%), neopetasone (0,76%, đối chứng 0,11%), tổng terpen hydrocarbon (3,70%, đối chứng 0%), tổng terpen chứa oxy (24,76%, đối chứng 8,78%) 18 - Các axit béo dẫn xuất chúng thành phần không mong muốn tinh dầu trầm hương Trong mẫu nghiên cứu, hàm lượng chúng cịn 22,89%, hẳn so với đối chứng 59,85% - Tổng số chất chưa xác định (unknown) kết phân tích tinh dầu trầm hương cao, cần có nghiên cứu hóa học để làm rõ 4.3 Kết nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares 4.3.1 Kết nghiên cứu chất thành phần axit béo số loại đầu cá ngừ Việt Nam Kết nghiên cứu chất Hàm lượng protein mẫu đầu cá ngừ dao động khoảng 17 - 20%, tương ứng với 40 - 50% protein tính theo lượng chất khơ Hàm lượng lipid mẫu dao động khoảng 4,5 14,8%, cao nhóm cá ngừ đại dương có kích thước lớn (500 2.000 mm) cá ngừ vây vàng (14,8%), cá ngừ mắt to (14,2%) Kết phân tích thành phần axit béo Bảng 4.13 Thành phần axit béo mẫu lipid thu từ đầu số loài cá ngừ Việt Nam Ngừ Ngừ chù Ngừ chấm Ngừ vằn Ngừ bò Sọc dưa Vây vàng Mắt to Tổng SFA 33,44 39,59 39,04 33,76 35,45 38,59 22,74 37,43 Tổng MUFA 35,05 24,78 25,97 29,65 24,21 22,63 28,86 19,33 Tổng PUFA 31,49 35,63 34,77 36,34 39,94 38,28 48,36 40,5 n-3PUFA 25,35 26,86 24,28 29,4 32,89 30,18 37,82 34,84 EPA+DHA+DPA 25,35 26,55 24,28 28,27 31,79 29,83 39,15 34,84 Hệ số đánh giá 114,08 136,99 133,54 217,30 343,98 263,12 559,74 494,73 Axit béo (% / lipid tổng) * Qua hệ số đánh giá cho thấy 03 lồi cá ngừ có triển vọng việc sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất dầu cá chất lượng cao giàu n-3 19 PUFA: cá ngừ bò, cángừ vây vàng cá ngừ mắt to có hệ số đánh giá cao tương ứng 343,98;559,74và 494,73; cao cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares lựa chọn cho nghiên cứu 4.3.2 Kết nghiên cứu ứng dụng enzyme chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T albarcares Tác động việc xử lý enzyme lên hiệu suất phân lập lipid mức độ thủy phân nguyên liệu Bảng 4.14 Sản phẩm trình phân lập lipid Sản phẩm Lipid (%) Protein hòa tan (%) Ép nhiệt 3,22 ± 0,34 Dạng thô Blight& Dyer 14,80 ± 0,28 Loại bỏ Protamex 9,19 ± 0,14 3,71 ± 0,14 Alcalase 7,84 ± 0,33 3,63 ± 0,26 Bromelain 10,23 ± 0,42 4,12 ± 0,15 Papain 6,71 ± 0,43 3,14 ± 0,34 Kết đánh giá phương pháp sử dụng enzyme Bảng 4.14: - So với phương pháp truyền thống (ép nhiệt), phương pháp thủy phân enzyme protease cải thiện đáng kể trình tách dầu từ 3,22% lên 6,71 - 10,23% (tăng - lần), đồng thời thu sản phẩm protein hòa tan giàu axit amin tự có giá trị dinh dưỡng cao sử dụng phương pháp ép nhiệt - So sánh với phương pháp sử dụng dung môi (phương pháp Blight & Dyer), phương pháp thủy phân enzyme protease có hiệu suất phân lập khoảng 45-70%, phụ thuộc vào loại enzyme Tuy nhiên, phương pháp enzyme tận thu triệt để nguồn nguyên liệu protein có giá trị cao phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ, protein bị loại bỏ trình chiết lipid Đặc biệt, mặt cảm quan, dầu cá thu phương pháp thủy Phương pháp 20 phân enzyme có màu sắc (màu vàng sáng) đẹp so với phương pháp chiết xuất dung môi (màu vàng nâu) khơng có dư lượng dung mơi hữu - So sánh loại enzyme protease sử dụng nghiên cứu, enzyme Bromelain cho hiệu suất phân lập cao enzyme lại Thành phần axit béo lipid tách từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacare phương pháp Thành phần axit béo lipid tổng chiết phương pháp khác xác định GC-MS (Bảng 4.15) Bảng 4.15 Thành phần axit béo phương pháp khác Axit béo Tổng SFA Tổng MUFA Tổng PUFA n-3PUFA EPA+DHA+DPA Hệ số đánh giá Ép nhiệt 51,35 35,84 12,80 10,82 10,82 24,06 B&D Protamex Alcalase Bromelain Papain 22,69 28,96 48,35 40,98 39,22 606,5 33,54 33,01 32,20 27,15 25,51 247,61 40,39 26,48 32,10 21,86 21,86 137,06 36,56 21,77 40,11 31,42 30,20 294,72 47,19 21,93 30,88 19,56 19,56 105,23 Kết phân tích nêu Bảng 4.15 cho thấy: So với phương pháp chiết xuất truyền thống (ép nhiệt), phương pháp tách dầu enzyme làm tăng chất lượng dầu cho tỷ lệ axit béo không no đa nối đôi n-3 PUFA cao gấp - lần (đạt 20 - 30%), phương pháp ép nhiệt đạt 12,82% Có thể thấy rằng, axit béo không no đa nối đôi nhạy cảm với nhiệt độ Phương pháp ép nhiệt diễn nhiệt độ cao (trên 1000C) làm biến đổi chất lượng lipid, axit béo no (SFA) chiếm 51,35%, phương pháp thủy phân thực nhiệt độ 500C nên ảnh hưởng đến chất lượng dầu So với enzyme lại, Bromelain cho hệ số đánh giá cao lựa chọn cho nghiên cứu 21 4.3.3 Kết nghiên cứu ứng dụng enzyme lipase CRL trình làm giàu axit béo n-3 PUFA dầu đầu cá ngừ vây vàng T albacares phương pháp ure Khảo sát điều kiện thủy phân lipid thành axit béo tự enzyme lipase CRL Dầu dầu cá ngừ trước kết tinh ure thủy phân enzyme lipase CRL từ nấm men Candida rugosa hệ dung môi hai pha: nhexan nước Sau trình thủy phân 400C, pH 7,5, tỷ lệ enzyme/cơ chất 0,8% thời gian thủy phân 10 giờ, số axit đo 149,8 mgKOH/g, tỷ lệ % axit béo bị thủy phân 77,42%.Số liệu thực nghiệm đánh giá dựa phương pháp bình phương tối thiểu Kết tính hồn tồn phù hợp với thực nghiệm Thành phần axit béo sau làm giàu kết tinh ure Hình 4.13 Sắc ký đồ axit béo giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây Phương pháp kết tinh ure nhờ enzyme lipase hỗ trợ làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,30% (Hình 4.13) Thay sử dụng kiềm (NaOH) để thủy phân lipid tổng thành axit béo tự trước kết tinh ure, trình thủy phân lipid tổng enzyme Lipase CRL có lợi phương pháp hóa học nhiệt độ thủy phân thấp (40oC), tốn dung mơi hóa chất giảm thiểu nguy hại mơi trường Q trình kết tinh ure sau 22 thủy phân lipase CRL làm giảm axit béo no (SFA) từ 36,56% xuống 5,5% làm giàu n-3 PUFA từ 31,13% lên 58,3%, EPA từ 5,47 lên 8,59%, DHA từ 22,9 lên 46,70% DPA từ 1,83 lên 2,68% Đề xuất qui trình cơng nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T albacares Hình 4.14 Sơ đồ quy trình cơng nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng 23 KẾT LUẬN Trong luận án này, số enzyme nghiên cứu ứng dụng nhằm hỗ trợ cho trình chiết xuất tinh dầu từ cành lá, từ vỏ quế Cinnamomum cassia từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna trình chiết xuất dầu béo làm giàu axit n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares Các nội dung nghiên cứu kết thu cụ thể sau: Luận án thành công sử dụng hệ enzyme Laccase-Htec2 để xử lý nguyên liệu cành vỏ quế trước chưng cất cho hiệu suất thu hồi tinh dầu tăng lên rõ rệt, tỷ lệ gia tăng tinh dầu cành quế đạt 41,7%, vỏ quế đạt 14,57%, thời gian chưng cất tinh dầu rút ngắn Đặc biệt, trình xử lý hệ enzyme Laccase-Htec2 làm gia tăng hàm lượng chất cinnamaldehyde tinh dầu cành quế từ 69,74% lên 85,60%, tinh dầu vỏ quế từ 54,63% lên 68,37% không làm thay đổi số hoạt tính sinh học tinh dầu cành quế C cassia so với đối chứng Luận án sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm để tính tốn điều kiện tối ưu cho q trình thủy phân cành quế trước chưng cất pH 5,2, nhiệt độ 44oC, tỷ lệ Laccase/cơ chất 0,42 ml/g, tỷ lệ Htec2/cơ chất 1,15%, thời gian thủy phân 30 phút Trên sở kết thu được, qui trình cơng nghệ chưng cất tinh dầu cành quế có enzyme hỗ trợ đề xuất Luận án thử nghiệm thăm dò ứng dụng hệ enzyme Laccase-Htec2 hỗ trợ trình chưng cất tinh dầu trầm hương từ gỗ gió bầu Aquilaria crassna cho tỷ lệ gia tăng tinh dầu 33,33%, thành phần có giá trị tinh dầu (cis-dihydroagarofuran, αagarofuran, agarospirol, hinesol, neopetasone) tăng lên, thành phần axit béo gây cản trở giảm rõ rệt Luận án thành công chiết xuất lipid làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albacares hệ enzyme kép Bromelain Lipase CRL Qui trình chiết xuất lipid enzyme 24 Bromelain cho hiệu suất chiết xuất lipid 69%, hàm lượng n-3 PUFA 31,42% Qui trình làm giàu n-3 PUFA enzyme Lipase CRL kết hợp kết tinh ure tăng hàm lượng n-3 PUFA từ 31,42% lên 65,08% Từ đó, cho phép đề xuất qui trình cơng nghệ ứng dụng kết hợp hai enzyme Bromelain Lipase CRL việc chiết xuất lipid làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Ngoài dầu cá giàu axit béo n3 PUFA đạt chất lượng thương phẩm, qui trình cịn cho sản phẩm có giá trị gia tăng, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu đồng thời giảm thiểu dung mơi hóa chất nhiễm mơi trường Các kết nghiên cứu nêu nghiên cứu ứng dụng enzyme Việt Nam việc chiết xuất tinh dầu từ cành lá, vỏ quế C cassia từ gỗ gió bầu A crassna Qui trình ứng dụng Bromelain việc chiết xuất lipid từ đầu cá ngừ vây vàng T albarcares đăng ký giải pháp hữu ích KIẾN NGHỊ Quy trình chưng cất tinh dầu có enzyme hỗ trợ dừng lại qui mơ thí nghiệm Cần thử nghiệm qui mô sản xuất địa phương nhằm ổn định công nghệ chất lượng sản phẩm, đồng thời đánh giá chi phí tiêu hao lượng lẫn giá thành nhằm nâng cao tính ứng dụng áp dụng vào thực tiễn sản xuất Do nhu cầu cấp bách thực tiễn sản xuất, phương pháp xử lý gỗ gió bầu trước chưng cất cần nghiên cứu gấp sâu Các kết nghiên cứu luận án cho thấy việc ứng dụng enzyme hỗ trợ trình chiết xuất hợp chất thiên nhiên mang lại hiệu rõ rệt Vì cần mở rộng phạm vi nghiên cứu sang loại nguyên liệu khác tảo biển lớp hợp chất thiên nhiên có hoạt chất sinh học có ứng dụng thực phẩm, dược phẩm, y học CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Hoang Thi Bich, Le Tat Thanh, Tran Quoc Toan, Nguyen Huy Tung, Le Xuan Duy, Nguyen Van Tuyen Anh, Dinh Thi Thu Thuy, Tran Thi Tuyen, Do Trung Sy, Le Mai Huong,Nguyen Quyet Chien (2016), “Investigation of enzyme treatments to assist extraction of essential oil from the leaves and branches of Cinnamomum cassia collected in Yenbai province”, Journal of Science and Technology, 54 (2C), 479-485 Le Tat Thanh, Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Hoang Thi Bich, Pham Thi Bien, Pham Thu Hue, Dinh Nguyet Thu, Pham Quoc Long (2016), “Survey on total lipid content and composition of fatty acids from head and viscera of tuna”, Journal of Science and Technology, 54 (2C),486-492 Lê Tất Thành, Hoàng Thị Bích, Trần Quốc Tồn, Nguyễn Thị Biển, Nguyễn Quang Tùng (2016), “Ảnh hưởng số yếu tố tới trình thủy phân dầu đầu cá ngừ enzyme lipase từ Candida rugosa”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ-trường Đại học Công nghiệp Hà Nội, (số 36-2016), 67-70 Hồng Thị Bích, Nguyễn Văn Tuyến Anh, Phạm Minh Quân, Phạm Thu Huế, Nguyễn Quang Tùng, Tô Xuân Thắng, Trần Quốc Toàn, Lê Tất Thành (2017), “Xây dựng quy trình ứng dụng enzyme kĩ thuật phối hợp để thu nhận dầu cá giàu axit béo không no đa nối đôi EPA, DHA, DPA từ phụ phẩm chế biến cá ngừ vây vàng Thunnus albacares”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Biển, tập 17, (số 01), 95-102 Hồng Thị Bích, Nguyễn Quyết Chiến, Lê Tất Thành, Đinh Thị Thu Thủy1, Đỗ Thị Thảo, Hoàng Kim Chi, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Lê Mai Hương (2017), “Khảo sát hoạt tính sinh học tinh dầu cành quế cinnamomum cassia thu nhận từ phương pháp enzyme kết hợp cất nước”, Tạp chí Dược học, tháng 5/2017, (số 493), 12-15 Hoang Thi Bich, Le Mai Huong, Nguyen Quyet Chien, Dinh Thi Thu Thuy, Le Tat Thanh, Đo Trung Sy, Pham Hong Hai, “Optimization of lignocellulose hydrolysis by (Laccase and Cellic Htec2) enzyme system assisted essential oil distillation from Cinnamomum cassia leaves and branches”, Journal of Science and Technology (Acceped 02/2017) ... hướng nghiên cứu mới- phân lập làm giàu HCTN enzyme hỗ trợ, lựa chọn đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên” 2 Mục đích Nghiên. .. pháp ? ?hóa học xanh” chiết xuất làm giàu hợp chất thiên nhiên 1.2 Các enzyme sử dụng công nghệ EAE để trích ly dầu làm giàu axit béo n-3 PUFA 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ enzyme chiết. .. nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T albacares Hình 4.14 Sơ đồ quy trình cơng nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm làm giàu n-3