Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)

Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme trong chiết tách và làm giàu một số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên (tt)

B GIO DC V O TO VIN HN LM KHOA HC V CễNG NGH VIT NAM HC VIN KHOA HC V CễNG NGH HONG TH BCH Nghiên cứu sử dụng kết hợp enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên Chuyờn ngnh: Húa hc cỏc hp cht t nhiờn Mó s: 62.44.01.17 LUN N TIN S HO HC H NI - 2017 Cụng trỡnh c hon thnh ti Hc vin Khoa hc v Cụng ngh Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Ngi hng dn khoa hc: PGS TS Lờ Mai Hng PGS TS Nguyn Quyt Chin Phn bin 1: Phn bin 2: Phn bin 3: Lun ỏn s c bo v trc Hi ng ỏnh giỏ lun ỏn tin s cp Hc vin, hp ti Hc vin Khoa hc v Cụng ngh Vin Hn lõm Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam Vo hi gi , ngy thỏng nm 201 Cú th tỡm hiu lun ỏn ti: - Th vin Hc vin Khoa hc v Cụng ngh - Th vin Quc gia Vit Nam M U Tớnh cp thit ca ti ễ nhim mụi trng cng nh sc khe ngi tiờu dựng ó dn n nhu cu cp thit l tỡm cỏc phng phỏp thu nhn cỏc sn phm cú ngun gc thiờn nhiờn theo hng Xanh nhm tng nng sut, gim thi gian, tn dng trit ngun nguyờn liu v gim ụ nhim mụi trng Ngun ti nguyờn thiờn nhiờn ca Vit Nam vụ cựng phong phỳ vi h thc vt c trng v ngun sinh vt bin a dng, ú phi k n cõy Qu (ngun dc liu) v cỏ ng (ngun li thy sn) l nhng mt hng cú giỏ tr kinh t, giỏ tr s dng v giỏ tr xut khu y tim nng Sn phm du t qu v cỏ ng ngy cng c chỳ trng bi chỳng cú giỏ tr cao Tuy nhiờn cụng nghip, quỏ trỡnh sn xut hai loi du ny s dng cỏc phng phỏp truyn thng (ct cun hi nc, ộp nhit) cha phỏt huy c ht hiu qu chit xut, gõy lóng phớ ngun nguyờn liu Ngy nay, nhng tin b cụng ngh sinh hc, cụng ngh enzyme cú kh nng sn xut mt lng ln enzyme cú hot lc cao, ph c cht rng thỡ cụng ngh XANH ng dng enzyme h tr quỏ trỡnh chit xut cỏc hp cht thiờn nhiờn (enzyme assisted extract- EAE) nhm tng hiu sut, thay th dung mụi hu c l cp thit Nhm mc ớch phỏt trin hng nghiờn cu mi- phõn lp v lm giu cỏc HCTN bng enzyme h tr, chỳng tụi la chn ti lun ỏn: Nghiờn cu s dng kt hp h enzyme chit tỏch v lm giu mt s sn phm ngun gc thiờn nhiờn Mc ớch Nghiờn cu ng dng cụng ngh enzyme vo quỏ trỡnh chit xut v lm giu cỏc sn phm tinh du (t lỏ v cnh qu, v qu Cinnamomum cassia) v cỏc axit bộo n-3PUFA t ph phm u cỏ ng nhm lm tng hiu qu v phỏt trin hng nghiờn cu XANH khai thỏc cỏc SPTN Ni dung nghiờn cu - Nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chng ct tinh du t cỏc b phn khỏc ca cõy qu Cinnamomum cassia: tỏc ng ca vic x lý nguyờn liu vi enzyme c ỏnh giỏ qua hiu sut, thi gian chng ct, cht lng sn phm tinh du (thnh phn húa hc, hot tớnh sinh hc) - Nghiờn cu thm dũ ng dng h enzyme kt hp LaccaseHtec2 chng ct tinh du trm hng t g cõy giú bu Aquilaria crassna - Nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chit xut lipid v lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Thunnus albarcares: tỏc ng ca enzyme lờn quỏ trỡnh c ỏnh giỏ qua thnh phn axit bộo n-3 PUFA Nhng úng gúp mi ca lun ỏn Ln u tiờn, ng dng cụng ngh enzyme h tr quỏ trỡnh chng ct tinh du t cnh lỏ qu, v qu C cassia v g giú bu A crassna S kt hp enzyme laccase t G lucidum v enzyme Cellic Htec2 cho quỏ trỡnh thy phõn hiu qu hn s dng riờng r Kt qu ó lm gia tng hiu sut, nõng cao cht lng tinh du, gim thi gian chng ct Ln u tiờn, ng dng cụng ngh h tr quỏ trỡnh phõn lp du v lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA t ph phm u cỏ ng bng h enzyme kộp Bromelain v Lipase CRL Kt qu phõn lp cho hiu sut 70% so vi phng ỏn dung mụi song quỏ trỡnh ó to sn phm cú giỏ tr gia tng, tn dng trit ngun nguyờn liu ng thi gim thiu dung mụi húa cht v ụ nhim mụi trng B cc ca lun vn: Lun ỏn gm cú 153 trang (khụng k ph lc), gm 55 hỡnh, 32 bng Ni dung chớnh ca lun ỏn c trỡnh by gm chng chớnh (ngoi M u-2 trang, kt lun- trang v kin ngh-1 trang); cỏc chng chớnh bao gm: Tng quan ti liu -38 trang, Nguyờn vt liu v phng phỏp nghiờn cu -11 trang, Thc nghim -11 trang v Kt qu v tho lun -63 trang PHN - TNG QUAN Trong phn ny, ó tng hp ti liu, chia lm mc 1.1 Tng quan gii thiu v ng dng cụng ngh enzyme gii phỏp húa hc xanh chit xut v lm giu cỏc hp cht thiờn nhiờn 1.2 Cỏc enzyme s dng cụng ngh EAE trớch ly du v lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA 1.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cu ng dng cụng ngh enzyme chit xut v lm giu cỏc hp cht thiờn nhiờn v ngoi nc 1.4 Gii thiu v nguyờn liu sn xut tinh du qu 1.5 Gii thiu v nguyờn liu ph phm cỏ ng sn xut n-3 PUFA PHN - NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 Nguyờn liu - Cnh lỏ qu, v qu Cinnamomum cassiathu ti xó Tõn ng, huyn Trn Yờn, tnh Yờn Bỏi - Ph phm u cỏ ng:08 mu u cỏ ng (ó b mt v mang) ca 08 loi cỏ ng thu ti Nha Trang- Khỏnh Hũa v Tuy HũaPhỳ Yờn - Enzyme s dng nghiờn cu + Enzyme Cellic Htec2 (Novozyme-an Mch) l hn hp a enzyme bao gm cellulase v xylanase + Enzyme laccase l enzyme thụ thu t canh trng nuụi cy nm Ganoderma lucidum (c cung cp bi Vin Di truyn nụng nghip) + Nhúm enzyme protease t vi sinh vt s dng hai enzyme Protamex v Alcalase (Novozyme- an Mch) + Nhúm enzyme Protease t thc vt s dng hai enzyme Bromelain v Papain, l enzyme nc, cung cp bi cụng ty Biogreen + Enzyme Lipase CRL (Novozyme- an Mch) c sn xut t quỏ trỡnh lờn men ca nm men Candida rugosa 2.3 Phng phỏp nghiờn cu: phn ny NCS trỡnh by cỏc phng phỏp xỏc nh - Cỏc phng phỏp phõn tớch húa sinh + Nguyờn liu thc vt: phõn tớch hm m, cellulose, hemicellulose, lignin, hm lng tinh du, + Nguyờn liu sinh vt bin: xỏc nh hm lng nc, hm lng protein, hm lng tro, hm lng lipid, ch s axit, ch s x phũng húa, - Phng phỏp phõn tớch thnh phn hp cht bng GC-MS + Phng phỏp xỏc nh thnh phn v hm lng tinh du + Phng phỏp xỏc nh thnh phn, hm lng axit bộo - Phng phỏp xỏc nh sn phm quỏ trỡnh thy phõn + Phng phỏp nh lng ng kh bng DNS (Miler, 1959) + Phng phỏp nh lng protein- axitamin (Bradford, 1976) - Cỏc phng phỏp xỏc nh hot enzyme + Xỏc nh hot enzyme Cellulase (Wood, 1987) + Xỏc nh hot enzyme Xylanse (Bailey, 1992) + Xỏc nh hot enzyme Laccase (Dinh, 2012) - Cỏc phng phỏp thy phõn + Phng phỏp thy phõn vi dung mụi l nc (ỏp dng cho enzyme cellulase, hemicellulase, protease ) + Phng phỏp thy phõn h dung mụi hai pha (ỏp dng cho enzyme lipase) theo (Fernỏdez Lorente G v cs.;2011) - Phng phỏp xỏc nh iu kin ti u cho quỏ trỡnh thy phõn + Kho sỏt mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh thy phõn + X lý s liu thc nghim bng phng phỏp bỡnh phng ti thiu + Ti u húa quỏ trỡnh thy phõn bng bng phng phỏp qui hoch húa thc nghim - Cỏc phng phỏp xỏc nh hot tớnh sinh hc + Phng phỏp xỏc nh hot tớnh khỏng VSV kim nh (Vander Bergher & Vlietlinck, 1991) + Phng phỏp xỏc nh kh nng gõy c t bo (cytotoxicity) (Likhitayawuid, 1991) ang trin khai ti Vin nghiờn cu ung th Quc gia M (NCI) + Phng phỏp xỏc nh hot tớnh khỏng viờm: thụng qua kh nng c ch sn sinh NO ca t bo macrophage RAW 264.7 (Lee et al., (2009)) + Phng phỏp xỏc nh hot tớnh chng oxi húatrờn h DPPH theo phng phỏp P Yuvaraj et al., (2013) PHN - THC NGHIM 3.1 Nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chng ct tinh du t cỏc b phn khỏc ca cõy qu Cinnamomum cassia 3.2 Nghiờn cu thm dũ ng dng h enzyme kt hp Laccase-Htec2 chng ct tinh du trm hng t g cõy giú bu Aquilaria crassna 3.3 Nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chit xut lipid v lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Thunnus albarcares PHN - KT QU V THO LUN 4.1 Kt qu nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chng ct tinh du t cỏc b phn khỏc ca cõy qu Cinnamomum cassia 4.1.1 Kt qu phõn tớch cht nn v tinh du cnh lỏ, v qu C cassia Hm lng cỏc cht nn ca cnh lỏ v v qu C cassia Kt qu phõn tớch cho thy mu cnh, lỏ v mu v qu mang c trng ca nhúm cõy thõn g vi thnh phn ch yu l lignocellulose, chim hn 60% lng nguyờn liu Hm lng cỏc thnh phn cu trỳc gm cellulose, hemicellulose v lignin xỏc nh c mu cnh, lỏ cú cỏc giỏ tr tng ng l 24,74%; 25,50% v 16,28%; mu v qu l 20,36%, 14,02% v 25,78% Hm lng v thnh phn húa hc ca tinh du t cnh lỏ, v qu C cassia Hm lng tinh du cnh lỏ qu, v qu thu c bng chng ct hi nc tng n l 0,69 0,02%, 2,87 0,04% tinh du (tớnh theo nguyờn liu khụ giú) Thnh phn húa hc ca tinh du cnh lỏ qu v v qu xỏc nh bng GC-MS ch Bng 4.2: Bng 4.2 Kt qu phõn tớch thnh phn húa hc ca tinh du cnh lỏ v tinh du v qu C cassia Cht Nhúm cỏc hidrocarbon Nhúm cỏc HC cha oxy Tng Phenylpropannoid trans- Cinnamaldehyde Tng Sesquiterpenoid Sesquiterpen hidrocarbon Sesquiterpen cha oxy % TD cnh, lỏ 3,87 95,54 88,73 67,74 2,42 1,99 0,43 % TD v 38,26 60,85 58,83 53,99 40,38 35,87 4,51 Mt s thnh phn tinh du qu C cassia thu thp Vn Yờn, Yờn Bỏi (hỡnh 4.1a v 4.1b) Benzenepropanal (C9H10O) trans-Cinnamaldehyde (C9H8O) Cinnamyl alcohol (C9H10O) Coumarin (C9H6O2) cis-Cinnamaldehyde (C9H8O) o-Methoxy cinamaldehyde Hỡnh 4.1a Mt s thnh phn thuc nhúm phenylpropanoid Copaene (C15H24) Muurolene (C15H24) Calamenene (C15H22) Cadinene (C15H24) Caryophyllene oxide ( C15H24O) Bisabolol (C15H26O) Bisabolene ( C15H24) Nerolidol (C15H26O) Hỡnh 4.1b Mt s thnh phn sesquiterpen v sesquiterpenoid Kt qu GC- MS phõn tớch thnh phn húa hc ca tinh du cnh lỏ qu v v qu C cassia cho thy: - Khong 28 hp cht c tỡm thy tinh du cnh lỏ qu C cassia, ú trans-cinnamaldehyde l hp cht chớnh (69,74%), theo sau l Cinnamyl acetate (17,2%), Benzofuran (5,9%), Benzaldehyde (1,62%), Benzenepropanal (1,59%) Ngoi ra, mt s cỏc thnh phn khỏc cng c xỏc nh vi hm lng nh hn 1,00% - Khong 38 hp cht c phỏt hin tinh du v qu C cassia, ú trans- cinnamaldehyde l hp cht chớnh (53,99%), theo sau l Copaene (13,86%), Cadinene (7,69%), Benzenpropanal (2,39%) Ngoi ra, mt s cỏc thnh phn khỏc cng c xỏc nh vi hm lng nh hn 1,00% - Phenylpropanoid l nhúm hp cht ch yu tinh du cnh lỏ qu v v qu C cassia thu t Vn Yờn, Yờn Bỏi, ú trans-cinnamaldehyde l thnh phn chớnh Tng ca cỏc hp cht hydrocarbon, ca cỏc hp cht cha oxy, ca cỏc phenylpropanoid v ca cỏc sesquiterpenoid cú s khỏc rừ rt gia nguyờn liu cnh lỏ qu v v qu 11 So sỏnh kt qu phõn tớch GC-MS ca c phng ỏn x lý cho thy, quỏ trỡnh tin x lý cnh lỏ qu bng enzyme ó khụng lm thay i bn cht ca tinh du v qu, cỏc mu tinh du u cú thnh phn chớnh l cinnamaldehyde v cú cựng s lng cỏc thnh phn quan trng khỏc Nhúm phenylpropanoid (C6- C3) l nhúm cht chớnh c phng ỏn x lý, ú trans-cinnamaldehyde l thnh phn chớnh cú hm lng t t 68,49% n 86,83% Tinh du thu c bng cỏch x lý nguyờn liu vi cỏc enzyme Laccase v HTec2 riờng r khụng gõy bin ng ln v thnh phn húa hc, nhng vic x lý nguyờn liu vi h enzyme kt hp Laccase-Htec2 ó lm thay i rừ rt nht thnh phn % ca mt s cht quan trng tinh du C th nh sau: - Lm giu mt s cht mong mun tinh du qu C cassia nh: hm lngcinnamaldehyde tng t 69,74% lờn 85,60%, o-methoxy-cinnamaldehyde t 0% lờn 0,23% - Lm gim hm lng mt s cht khỏc, c bit cinnamyl acetat gim t 17,2% xung 1,34%, cinnamyl alcohol gim t 0,57% xung 0,29% S tng v gim ca cinnamaldehyde v cinnamyl acetat cú th cú mi liờn h mt thit vi Tỏc ng ca vic x lý nguyờn liu vi enzyme lờn hot tớnh sinh hc ca tinh du cnh lỏ qu - Kt qu xỏc nh hot tớnh khỏng vi sinh vt kim nh Mu tinh du cú s dng enzyme h tr (Tinh du EAD) khụng cú s sai khỏc v hot tớnh khỏng khun so vi mu chit thụng thng Cỏc mu tinh du qu u khụng cú hot tớnh khỏng P.aeruginosa v F oxysporum., cú hot tớnh khỏng S aureus vi 12 MIC = 100 g/ml, A niger vi MIC = 200 g/ml E coli, B subtilis, S cerevisiae, C albicans l MIC = 400 g/ml Trong s cỏc vi sinh vt kim nh, tinh du cú hot tớnh khỏng khun cao nht i vi S aureus vi MIC 100 àg/ml - Kt qu xỏc nh hot tớnh gõy c t bo Hai mu tinh duu cú hot tớnh gõy c t bo vi nng th nghim ban u (40 g/ml) cỏc nng th nghim tip theo, tinh du HD biu hin hot tớnh gõy c t bo vi 02 dũng t bo ung th gan v ung th biu mụ liờn kt (Hep-G2 v RD) vi giỏ tr IC50 ln lt l 29,25 v 6,01 g/ml, tinh du EAD biu hin hot tớnh gõy c t bo i vi dũng t bo ung th (Hep-G2, LU-1 v RD) vi giỏ tr IC50 ln lt l 12,89, 25,95 v 2,34 g/ml c bit, EAD cú hot tớnh khỏ mnh trờn dũng ung th biu mụ phi vi giỏ tr IC50 2,34(g/ml) - Kt qu xỏc nh hot tớnh khỏng viờm C hai mu tinh du u th hin hot tớnh c ch i thc bo sn sinh NO cỏc khong nng t 6,25 n 100 g/ml (P < 0.05 vi LPS i chng õm), tinh du EAD cú biu hin hot tớnh khỏng viờm mnh hn tinh du HD - Kt qu xỏc nh hot tớnh chng oxi húa Hai mu tinh du th nghim cha th hin kh nng trung hũa gc t ca DPPH nng nghiờn cu 4.1.3 Tỏc ng ca vic x lý nguyờn liu vi enzyme lờn quỏ trỡnh chng ct tinh du t v qu C cassia Tỏc ng ca vic x lý nguyờn liu vi enzyme lờn hiu sut thu hi tinh du v mc thy phõn cỏc cht nn ca v qu 13 Hỡnh 4.5 th biu din mi tng quan gia mc thy phõn v t l gia tng tinh du v qu Kt qu cho thy mi tng quan rừ rt gia mc thy phõn thnh t bo v t l gia tng tinh du v qu C cassia Ln lt t phng ỏn 01 n 04, hm lng ng kh gia tng t lờn n 38,34 àg/ml, cũn hm lng lignin gim t 25,78 xung cũn 20,34% Phng ỏn 04, kt hp enzyme Laccase v Htec2 cho hiu qu thy phõn cao nht vi hm lng ng kh l 38,34 àg/ml v t l gia tng hiu sut tinh du t 14,57% Tỏc ng ca vic x lý nguyờn liu vi enzyme lờn thi gian chng ct tinh du v qu Hỡnh 4.6 nh hng ca thi gian ct n hiu sut thu tinh du v qu 14 Cng tng t nh cnh lỏ qu, kt qu kho sỏt trờn v qu cho thy h enzyme Laccase + Htec2 cú vai trũ tớch cc vic gim thi gian chng ct tinh du qu Ti cỏc thi im khỏc ca quỏ trỡnh chng ct: 2h, 3h, 4h lng tinh du thu t mu v qu x lý bng enzyme u cao hn so vi khụng x lý enzyme Sau 6h chng ct, lng tinh du t cc i (3,28%) ú sau 8h mu khụng x lý enzyme mi t cc i (2,87%) Kt qu ỏnh giỏ tỏc ng ca cỏc h enzyme lờn thnh phn húa hc tinh du v qu Bng 4.9 Thnh phn húa hc ca cỏc tinh du v qu thu c t cỏc nguyờn liu c x lý vi cỏc h enzyme khỏc Khụng enzyme Laccase Htec2 Laccase +Htec2 Nhúm hidrocarbon 38,26 26,52 26,29 27,26 Nhúm HC cha oxy 60,85 71,47 70,35 72,02 Tng Phenyl propanoid 58,83 65,97 65,73 70,98 trans-cinnamaldehyde 53,99 59,22 58,36 67,6 Tng sesquiterpen 39,29 30,98 29,85 27,44 Sesquiterpen hidrocarbon 35,87 24,64 24,28 25,08 Sesquiterpen cha oxy 3,42 6,34 5,57 2,36 Cht So sỏnh thnh phn GC-MS ca c phng ỏn x lý cho thy quỏ trỡnh tin x lý v qu bng enzyme ó khụng lm thay i bn cht ca tinh du qu, cỏc mu nghiờn cu u cú thnh phn chớnh l cinnamic aldehyde v cú cựng s lng cỏc thnh phn quan trng khỏc, ớt cú s bin ng v t l nhúm cỏc hidrocarbon v cỏc hp cht cha oxy, t l phenylpropanoid v sesquiterpen c bit, quỏ trỡnh (Laccase + Htec2)- EAD cú s gia tng ca hm lng cht chớnhcinnamic aldehyde tng t 54,63% % lờn 68,37% 15 4.1.4 Kt qu tỡm iu kin ti u cho quỏ trỡnh ng dng h enzyme kt hp Laccase-Htec2 chng ct tinh du t cnh lỏ qu Qua phõn tớch cỏc yu t nh hng, chn yu t nh hng gm: pH, nhit T, thi gian t, t l enzyme laccase/c cht, t l enzyme Htec2/c cht S dng phn mm Design Expert 7.0 x lý s liu ta nhn c kt qu phng trỡnh hi qui: = 79,73 + 0,48 x1 + 0,56x2 + 1,66 x3 + 2,19 x4 + 0,44 x1x5 0,44 x2x3 - 0,44 x2x4 - 0,69 x3x4 - 1,98 x12 - 1,84 x22 - 1,83 x32 - 1,26 x42 -1,29 x52 Bng phn mm trờn ó tin hnh xem xột mụ t nh hng ca tng cp tng tỏc, u c mụ t dng paraboloid tc cú im cc tr Hỡnh 4.9 Mt ỏp ng vựng ti u ca tng cp yu t Nh vy, iu kin ti u cho quỏ trỡnh thy phõn cnh lỏ qu bng h enzyme Laccase + Htec2 l pH 5,2, nhit 440C, Laccases/S = 0,42ml/g, Htec2/S= 1,15%, thi gian 5h30 phỳt xut quy trỡnh cụng ngh ng dng h enzyme kt hp Laccase-Htec2 chng ct tinh du t cnh lỏ qu C cassia (hỡnh 4.10) 16 Cnh lỏ qu Xay, nghin Tin x lý H2O/24h Laccase/S 0,42 ml/g, Htec2/S 1,15%, nhit 440C, pH 5.2, thi gian 5h30, tc 200 rpm, Thy phõn Chng ct tinh du Tinh du+ Nc Bó nguyờn liu Na2SO4 Tinh du Cassia Phõn bún Hỡnh 4.10 S quy trỡnh cụng ngh ng dng h enzyme kt hp Laccase-Htec chng ct tinh du t cnh lỏ qu C cassia 4.2 Kt qu thm dũ ng dng h enzyme kt hp Laccase-Htec2 chng ct tinh du trm hng t g cõy giú bu Aquilaria crassna Kt qu phõn tớch thnh phn cht nn ca bt g giú bu A crassna Kt qu xỏc nh cỏc thnh phn kin to nờn khung cu trỳc ca g giú bu cho thy g giú bu mang cỏc c trng ca nguyờn liu cha lignocellulose bao gm cellulose 34,75%, hemicellulose 15,27% v lignin 29,10% 17 Kt qu thm dũ tỏc ng h enzyme Laccase - Htec2 lờn hm lng v thnh phn tinh du trm hng t g cõy giú bu Aquilaria crassna Da trờn cỏc kt qu thu c nghiờn cu ng dng enzyme chng ct tinh du qu, chỳng tụi ó chn h enzyme LaccaseHtec2 ỏp dng cho vic chng ct tinh du trm hng Kt qu sau ngy chng ct, mu i chng (mu khụng cú enzyme) cho 0,024% tinh du (tớnh theo lng mu khụ giú), mu nghiờn cu (mu cú enzyme) cho 0,032% tinh du, t l gia tng tinh du Thnh phn húa hc ca cỏc mu tinh du c xỏc nh bng phng phỏp GC-MS Mt s thnh phn c trng ca tinh du trm hng Hỡnh 4.11 Mt s thnh phn c trng ca tinh du trm hng - Hm lng ca cỏc thnh phn cú giỏ tr, mang mựi trm hng c trng (Hỡnh 4.11b) cng tng lờn rừ rt, c th cisdihydroagarofuran (0,11%, i chng 0%), -agarofuran (0,17%, i chng 0%), agarospirol (0,72%, i chng 0,23%), hinesol (0,56%, i chng 0,16%), valerianol (2,59%, i chng 0,89%), neopetasone (0,76%, i chng 0,11%), tng cỏc terpen hydrocarbon (3,70%, i chng 0%), tng cỏc terpen cha oxy (24,76%, i chng 8,78%) 18 - Cỏc axit bộo v dn xut ca chỳng l cỏc thnh phn khụng mong mun tinh du trm hng Trong mu nghiờn cu, hm lng ca chỳng ch cũn 22,89%, ớt hn hn so vi i chng l 59,85% - Tng s cỏc cht cha c xỏc nh (unknown) kt qu phõn tớch tinh du trm hng l rt cao, vỡ th cn cú cỏc nghiờn cu húa hc tip theo lm rừ 4.3 Kt qu nghiờn cu ng dng enzyme kt hp chit xut lipid v lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Thunnus albarcares 4.3.1 Kt qu nghiờn cu cỏc cht nn v thnh phn axit bộo ca mt s loi u cỏ ng ca Vit Nam Kt qu nghiờn cu cỏc cht nn Hm lng protein ca cỏc mu u cỏ ng dao ng khong 17 - 20%, tng ng vi 40 - 50% protein tớnh theo lng cht khụ Hm lng lipid ca cỏc mu dao ng khong 4,5 14,8%, cao nht l nhúm cỏ ng i dng cú kớch thc ln (500 2.000 mm) nh cỏ ng võy vng (14,8%), cỏ ng mt to (14,2%) Kt qu phõn tớch thnh phn axit bộo Bng 4.13 Thnh phn axit bộo cỏc mu lipid thu c t u mt s loi cỏ ng ca Vit Nam Ng Ng chự Ng chm Ng Ng bũ Sc da Võy vng Mt to Tng SFA 33,44 39,59 39,04 33,76 35,45 38,59 22,74 37,43 Tng MUFA 35,05 24,78 25,97 29,65 24,21 22,63 28,86 19,33 Tng PUFA 31,49 35,63 34,77 36,34 39,94 38,28 48,36 40,5 n-3PUFA 25,35 26,86 24,28 29,4 32,89 30,18 37,82 34,84 EPA+DHA+DPA 25,35 26,55 24,28 28,27 31,79 29,83 39,15 34,84 H s ỏnh giỏ 114,08 136,99 133,54 217,30 343,98 263,12 559,74 494,73 Axit bộo (% / lipid tng) * Qua h s ỏnh giỏ cho thy 03 loi cỏ ng cú trin vng vic s dng lm nguyờn liu sn xut du cỏ cht lng cao giu n-3 19 PUFA: cỏ ng bũ, cỏng võy vng v cỏ ng mt to cú h s ỏnh giỏ cao tng ng l 343,98;559,74v 494,73; ú cao nht l cỏ ng võy vng Thunnus albarcares c la chn cho nghiờn cu tip theo 4.3.2 Kt qu nghiờn cu ng dng enzyme chit xut lipid t u cỏ ng võy vng T albarcares Tỏc ng ca vic x lý enzyme lờn hiu sut phõn lp lipid v mc thy phõn nguyờn liu Bng 4.14 Sn phm ca quỏ trỡnh phõn lp lipid Sn phm Lipid (%) Protein hũa tan (%) ẫp nhit 3,22 0,34 Dng thụ Blight& Dyer 14,80 0,28 Loi b Protamex 9,19 0,14 3,71 0,14 Alcalase 7,84 0,33 3,63 0,26 Bromelain 10,23 0,42 4,12 0,15 Papain 6,71 0,43 3,14 0,34 Kt qu ỏnh giỏ bng phng phỏp s dng enzyme trờn Bng 4.14: - So vi phng phỏp truyn thng (ộp nhit), phng phỏp thy phõn bng enzyme protease ó ci thin ỏng k quỏ trỡnh tỏch du t 3,22% lờn 6,71 - 10,23% (tng - ln), ng thi thu c sn phm protein hũa tan giu axit amin t cú giỏ tr dinh dng cao hn s dng phng phỏp ộp nhit - So sỏnh vi phng phỏp s dng dung mụi (phng phỏp Blight & Dyer), phng phỏp thy phõn bng enzyme protease cú hiu sut phõn lp khong 45-70%, ph thuc vo tng loi enzyme Tuy nhiờn, phng phỏp enzyme tn thu c trit ngun nguyờn liu protein cú giỏ tr cao phng phỏp s dng dung mụi hu c, protein b loi b quỏ trỡnh chit lipid c bit, v mt cm quan, du cỏ thu c bng phng phỏp thy Phng phỏp 20 phõn enzyme cú mu sc (mu vng sỏng) p hn so vi phng phỏp chit xut bng dung mụi (mu vng nõu) v khụng cú d lng dung mụi hu c - So sỏnh loi enzyme protease s dng nghiờn cu, enzyme Bromelain cho hiu sut phõn lp cao hn cỏc enzyme cũn li Thnh phn axit bộo ca lipid tỏch t u cỏ ng võy vng Thunnus albacare bng cỏc phng phỏp Thnh phn axit bộo ca lipid tng chit bng phng phỏp khỏc c xỏc nh bng GC-MS (Bng 4.15) Bng 4.15 Thnh phn axit bộo bng cỏc phng phỏp khỏc Axit bộo Tng SFA Tng MUFA Tng PUFA n-3PUFA EPA+DHA+DPA H s ỏnh giỏ ẫp nhit 51,35 35,84 12,80 10,82 10,82 24,06 B&D Protamex Alcalase Bromelain Papain 22,69 28,96 48,35 40,98 39,22 606,5 33,54 33,01 32,20 27,15 25,51 247,61 40,39 26,48 32,10 21,86 21,86 137,06 36,56 21,77 40,11 31,42 30,20 294,72 47,19 21,93 30,88 19,56 19,56 105,23 Kt qu phõn tớch nờu trờn Bng 4.15 cho thy: So vi phng phỏp chit xut truyn thng (ộp nhit), phng phỏp tỏch du bng enzyme ó lm tng cht lng du cho t l cỏc axit bộo khụng no a ni ụi n-3 PUFA cao hn gp - ln (t 20 - 30%), phng phỏp ộp nhit ch t 12,82% Cú th thy rng, cỏc axit bộo khụng no a ni ụi rt nhy cm vi nhit Phng phỏp ộp nhit din nhit cao (trờn 1000C) ó lm bin i cht lng ca lipid, cỏc axit bộo no (SFA) chim 51,35%, phng phỏp thy phõn thc hin nhit 500C nờn ớt nh hng n cht lng ca du So vi enzyme cũn li, Bromelain cho h s ỏnh giỏ cao nht v c la chn cho cỏc nghiờn cu tip theo 21 4.3.3 Kt qu nghiờn cu ng dng enzyme lipase CRL quỏ trỡnh lm giu cỏc axit bộo n-3 PUFA ca du u cỏ ng võy vng T albacares bng phng phỏp ure Kho sỏt iu kin thy phõn lipid thnh cỏc axit bộo t bng enzyme lipase CRL Du du cỏ ng trc kt tinh ure c thy phõn bng enzyme lipase CRL t nm men Candida rugosa h dung mụi hai pha: nhexan v nc Sau quỏ trỡnh thy phõn 400C, pH 7,5, t l enzyme/c cht l 0,8% v thi gian thy phõn l 10 gi, ch s axit o c l 149,8 mgKOH/g, t l % axit bộo ó b thy phõn l 77,42%.S liu thc nghim c ỏnh giỏ da trờn phng phỏp bỡnh phng ti thiu Kt qu tớnh hon ton phự hp vi thc nghim Thnh phn axit bộo sau lm giu bng kt tinh ure Hỡnh 4.13 Sc ký cỏc axit bộo giu n-3 PUFA t u cỏ ng võy Phng phỏp kt tinh bng ure nh enzyme lipase h tr ó lm giu n-3 PUFA t 31,13% lờn 58,30% (Hỡnh 4.13) Thay vỡ s dng kim (NaOH) thy phõn lipid tng thnh cỏc axit bộo t trc kt tinh ure, quỏ trỡnh thy phõn lipid tng bng enzyme Lipase CRL cú li th hn phng phỏp húa hc l nhit thy phõn thp (40oC), tn ớt dung mụi húa cht v gim thiu s nguy hi i vi mụi trng Quỏ trỡnh kt tinh bng ure sau 22 thy phõn bng lipase CRL ó lm gim cỏc axit bộo no (SFA) t 36,56% xung 5,5% v lm giu n-3 PUFA t 31,13% lờn 58,3%, ú EPA t 5,47 lờn 8,59%, DHA t 22,9 lờn 46,70% v DPA t 1,83 lờn 2,68% xut qui trỡnh cụng ngh ng dng enzyme kt hp chit xut lipid v lm giu n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng T albacares Hỡnh 4.14 S quy trỡnh cụng ngh ng dng enzyme kt hp chit xut lipid v lm lm giu n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng 23 KT LUN Trong lun ỏn ny, mt s enzyme ó c nghiờn cu ng dng nhm h tr cho quỏ trỡnh chit xut tinh du t cnh lỏ, t v qu Cinnamomum cassia v t g giú bu Aquilaria crassna cng nh quỏ trỡnh chit xut du bộo v lm giu cỏc axit n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Thunnus albacares Cỏc ni dung nghiờn cu v kt qu thu c c th nh sau: Lun ỏn ó thnh cụng s dng h enzyme Laccase-Htec2 x lý cỏc nguyờn liu cnh lỏ v v qu trc chng ct cho hiu sut thu hi tinh du tng lờn rừ rt, t l gia tng tinh du cnh lỏ qu t 41,7%, v qu t 14,57%, thi gian chng ct tinh du c rỳt ngn c bit, quỏ trỡnh x lý bng h enzyme Laccase-Htec2 ó lm gia tng hm lng cht chớnh cinnamaldehyde tinh du cnh lỏ qu t 69,74% lờn 85,60%, tinh du v qu t 54,63% lờn 68,37% v khụng lm thay i mt s hot tớnh sinh hc ca tinh du cnh lỏ qu C cassia so vi i chng Lun ỏn ó s dng phng phỏp qui hoch thc nghim tớnh toỏn iu kin ti u cho quỏ trỡnh thy phõn cnh lỏ qu trc chng ct pH 5,2, nhit 44oC, t l Laccase/c cht 0,42 ml/g, t l Htec2/c cht 1,15%, thi gian thy phõn gi 30 phỳt Trờn c s cỏc kt qu thu c, mt qui trỡnh cụng ngh chng ct tinh du cnh lỏ qu cú enzyme h tr ó c xut Lun ỏn ó th nghim thm dũ ng dng ca h enzyme Laccase-Htec2 h tr quỏ trỡnh chng ct tinh du trm hng t g cõy giú bu Aquilaria crassna cho t l gia tng tinh du l 33,33%, cỏc thnh phn cú giỏ tr ca tinh du (cis-dihydroagarofuran, agarofuran, agarospirol, hinesol, v neopetasone) tng lờn, cỏc thnh phn axit bộo gõy cn tr gim i rừ rt Lun ỏn ó thnh cụng chit xut lipid v lm giu n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Thunnus albacares bng h enzyme kộp Bromelain v Lipase CRL Qui trỡnh chit xut lipid bng enzyme 24 Bromelain cho hiu sut chit xut lipid 69%, hm lng n-3 PUFA 31,42% Qui trỡnh lm giu n-3 PUFA bng enzyme Lipase CRL kt hp kt tinh ure ó tng hm lng n-3 PUFA t 31,42% lờn 65,08% T ú, cho phộp xut mt qui trỡnh cụng ngh ng dng kt hp hai enzyme Bromelain v Lipase CRL vic chit xut lipid v lm giu n-3 PUFA t u cỏ ng võy vng Ngoi du cỏ giu axit bộo n3 PUFA t cht lng thng phm, qui trỡnh ny cũn cho cỏc sn phm cú giỏ tr gia tng, tn dng trit ngun nguyờn liu ng thi gim thiu dung mụi húa cht v ụ nhim mụi trng Cỏc kt qu nghiờn cu nờu trờn l cỏc nghiờn cu ng dng enzyme u tiờn Vit Nam vic chit xut tinh du t cnh lỏ, v qu C cassia v t g giú bu A crassna Qui trỡnh ng dng Bromelain vic chit xut lipid t u cỏ ng võy vng T albarcares ó c ng ký gii phỏp hu ớch KIN NGH Quy trỡnh chng ct tinh du cú enzyme h tr mi ch dng li qui mụ thớ nghim Cn th nghim qui mụ sn xut ti a phng nhm n nh cụng ngh v cht lng sn phm, ng thi ỏnh giỏ chi phớ tiờu hao nng lng ln giỏ thnh nhm nõng cao tớnh ng dng ỏp dng vo thc tin sn xut Do nhu cu cp bỏch ca thc tin sn xut, phng phỏp x lý g giú bu trc chng ct cn c nghiờn cu gp v sõu hn Cỏc kt qu nghiờn cu ca lun ỏn cho thy vic ng dng enzyme h tr cỏc quỏ trỡnh chit xut cỏc hp cht thiờn nhiờn mang li hiu qu rừ rt Vỡ th cn m rng phm vi nghiờn cu sang cỏc loi nguyờn liu khỏc nh to bin v cỏc lp hp cht thiờn nhiờn cú hot cht sinh hc cú ng dng thc phm, dc phm, y hc CC CễNG TRèNH CễNG B LIấN QUAN N LUN N Hoang Thi Bich, Le Tat Thanh, Tran Quoc Toan, Nguyen Huy Tung, Le Xuan Duy, Nguyen Van Tuyen Anh, Dinh Thi Thu Thuy, Tran Thi Tuyen, Do Trung Sy, Le Mai Huong,Nguyen Quyet Chien (2016), Investigation of enzyme treatments to assist extraction of essential oil from the leaves and branches of Cinnamomum cassia collected in Yenbai province, Journal of Science and Technology, 54 (2C), 479-485 Le Tat Thanh, Le Xuan Duy, Tran Quoc Toan, Hoang Thi Bich, Pham Thi Bien, Pham Thu Hue, Dinh Nguyet Thu, Pham Quoc Long (2016), Survey on total lipid content and composition of fatty acids from head and viscera of tuna, Journal of Science and Technology, 54 (2C),486-492 Lờ Tt Thnh, Hong Th Bớch, Trn Quc Ton, Nguyn Th Bin, Nguyn Quang Tựng (2016), nh hng ca mt s yu t ti quỏ trỡnh thy phõn du u cỏ ng bng enzyme lipase t Candida rugosa, Tp Khoa hc v Cụng ngh-trng i hc Cụng nghip H Ni, (s 36-2016), 67-70 Hong Th Bớch, Nguyn Vn Tuyn Anh, Phm Minh Quõn, Phm Thu Hu, Nguyn Quang Tựng, Tụ Xuõn Thng, Trn Quc Ton, Lờ Tt Thnh (2017), Xõy dng quy trỡnh ng dng enzyme v cỏc k thut phi hp thu nhn du cỏ giu cỏc axit bộo khụng no a ni ụi EPA, DHA, DPA t ph phm ch bin cỏ ng võy vng Thunnus albacares, Tp Khoa hc v Cụng ngh Bin, 17, (s 01), 95-102 Hong Th Bớch, Nguyn Quyt Chin, Lờ Tt Thnh, inh Th Thu Thy1, Th Tho, Hong Kim Chi, Trn Th Nh Hng, Trn Th Hng H, Lờ Mai Hng (2017), Kho sỏt hot tớnh sinh hc tinh du cnh lỏ qu cinnamomum cassia thu nhn t phng phỏp enzyme kt hp ct cun hi nc, Tp Dc hc, thỏng 5/2017, (s 493), 12-15 Hoang Thi Bich, Le Mai Huong, Nguyen Quyet Chien, Dinh Thi Thu Thuy, Le Tat Thanh, o Trung Sy, Pham Hong Hai, Optimization of lignocellulose hydrolysis by (Laccase and Cellic Htec2) enzyme system assisted essential oil distillation from Cinnamomum cassia leaves and branches, Journal of Science and Technology (Acceped 02/2017) ... hướng nghiên cứu mới- phân lập làm giàu HCTN enzyme hỗ trợ, lựa chọn đề tài luận án: Nghiên cứu sử dụng kết hợp hệ enzyme chiết tách làm giàu số sản phẩm nguồn gốc thiên nhiên 2 Mục đích Nghiên. .. 3.3 Nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu axit béo n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng Thunnus albarcares PHẦN - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết nghiên cứu ứng dụng enzyme kết hợp. .. nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm giàu n-3 PUFA từ đầu cá ngừ vây vàng T albacares Hình 4.14 Sơ đồ quy trình công nghệ ứng dụng enzyme kết hợp chiết xuất lipid làm làm giàu n-3