ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Huế - Năm 2020 i ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: 44 01 18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Đình Luyện PGS TS Nguyễn Hữu Tùng Huế - Năm 2020 ii LỜI CAM ĐOAN Luận án đƣợc hoàn thành Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, dƣới hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Đình Luyện PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các kết luận án trung thực, đƣợc đồng tác giả cho phép sử dụng chƣa đƣợc cơng bố trƣớc Tác giả Đoàn Mạnh Dũng i LỜI CẢM ƠN Luận án đƣợc hoàn thành dƣới hƣớng dẫn tận tình đầy tâm huyết Thầy Nguyễn Đình Luyện Thầy Nguyễn Hữu Tùng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Nguyễn Đình Luyện - Trƣờng Đại học Sƣ phạm – Đại học Huế, PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng Trƣờng Đại học Quốc gia Hà Nội ngƣời giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập nghiên cứu Đặc biệt tơi xin tỏ lịng kính trọng với GS TS Trần Đình Thắng – Trƣờng Đại học Vinh, ngƣời Thầy dìu dắt, hỗ trợ điều kiện tốt cho đƣờng nghiên cứu khoa học Nhân dịp này, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế, Phịng Sau đại học, Khoa Hóa học q thầy cô giáo giảng dạy lớp nghiên cứu sinh tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tác giả xin chân thành cảm ơn bạn đồng nghiệp gần xa giúp đỡ, động viên, khích lệ tác giả suốt trình làm luận án Cuối cùng, tác giả xin dành tình cảm đặc biệt đến gia đình, ngƣời thân ngƣời bạn tác giả, ngƣời mong mỏi, động viên tiếp sức cho tác giả để hoàn thành luận án Tác giả Đoàn Mạnh Dũng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III KÝ HIỆU VIẾT TẮT V DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VII DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ IX MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học số thuốc 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học .5 1.1.3 Một số loài thuốc chứa hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 1.2 Các phƣơng pháp phân tích hợp chất thiên nhiên 11 1.2.1 Phƣơng pháp sắc ký khí 11 1.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lỏng 12 1.3 Một số nghiên cứu liên quan đến luận án 16 Chƣơng NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Thông tin mẫu 25 2.3.2 Phƣơng pháp chiết tách/phân lập 27 2.3.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc đặc trƣng hóa - lý HCTN 29 2.3.4 Phƣơng pháp tinh chế hctn để tạo chất chuẩn 29 2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn liệu chất chuẩn 30 2.3.6 Phƣơng pháp phân tích HCTN 30 2.3.7 Phƣơng pháp đánh giá độ tin cậy phƣơng pháp phân tích 32 iii 2.3.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 2.4 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 24 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Chiết tách xác định cấu trúc hợp chất thiên nhiên 35 3.1.1 Chiết tách HCTN từ Diệp hạ châu đặc trƣng cấu trúc 35 3.1.2 Chiết tách HCTN từ Đan sâm đặc trƣng cấu trúc 42 3.1.3 Chiết tách HCTN từ Mật nhân đặc trƣng cấu trúc 49 3.2 Tinh chế hợp chất thiên nhiên để tạo chất chuẩn 53 3.2.1 Chất chuẩn hypophyllanthin phyllanthin 54 3.2.2 Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA 55 3.2.3 Chất chuẩn eurycomanone 57 3.3 Quy trình phân tích hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học 58 3.4.1 Tính ổn định hệ thống thiết bị 65 3.4.2 Độ đặc hiệu phƣơng pháp phân tích 69 3.4.3 Khoảng tuyến tính 72 3.5 Áp dụng thực tế 79 3.5.1 Kiểm soát chất lƣợng phƣơng pháp phân tích 79 3.5.2 Hàm lƣợng hctn mẫu thực tế 86 3.6 Các hợp chất acetogenin chiết tách từ Mãng cầu xiêm 92 3.6.1 Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin 94 3.6.2 Định tính acetogenin phân đoạn AMF-3 95 3.6.3 Định lƣợng acetogenin phân đoạn AMF-3 97 3.7 Hàm lƣợng tinh dầu chiết tách từ Riềng đuôi nhọn 98 KẾT LUẬN .105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 109 Danh mục cơng trình cơng bố kết nghiên cứu luận án 107 PHỤ LỤC 122 iv KÝ HIỆU VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Việt ACN ACRS Acetonitril Chất chuẩn đối chiếu hóa Asean học ASEAN AOAC Reference Substance Analytical Chemists Hiệp hội nƣớc Đông Association of Southeast Nam Á CCĐC Chemical Hiệp hội nhà khoa Association of Official học Phân tích Hoa Kỳ ASEAN Tiếng Anh Asian Nations Chất chuẩn đối chiếu CE Điện di mao quản Capillary Electrophoresis DAD Detector chuỗi diot Diot Array Detector ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry mù electron EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol FLD Detector huỳnh quang Fluorescence Detector GC Sắc kí khí Gas Chromatography GC-MS Sắc ký lỏng ghép nối Gas Chromatography – khối phổ Mass Spectrometry HCTN Hợp chất thiên nhiên HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ High Performance Liquid Chromatography– Spectrometry HTSH Hoạt tính sinh học Bioactive HCTN Hợp chất thiên nhiên Natural compounds v Mass Viết tắt LC-MS/MS Tiếng Việt Tiếng Anh Sắc ký lỏng ghép lần Liquid khối phổ Chromatograph Tandem Mass Spectrometer LOD Giới hạn phát Limit of detection LOQ Giới hạn định lƣợng Limit of quantity MeOH NMR Methanol Cộng hƣởng từ hạt nhân Nuclear Magnetic Resonance NPLC Sắc ký lỏng pha thuận Normal Phase Liquid Chromatography PPPT Phƣơng pháp phân tích Analysis method PTN Phịng thí nghiệm Laboratory Sắc ký lỏng pha đảo Reversed Phase Liquid RPLC Chromatography RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối Relative Standard Deviation SKĐ Sắc kí đồ SPE Chiết pha rắn TCCL TLC Solid Phase Extraction Tiêu chuẩn chất lƣợng Sắc kí lớp mỏng Thin Layer Chromatography UV-Vis VQG Tử ngoại – khả kiến Vƣờn quốc gia vi Ultraviolet – Visible DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Một số cơng trình nghiên cứu liên quan đến đề tài nghiên cứu 17 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR PU-1 so sánh với công bố tài liệu 39 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR PU-2 so sánh với công bố tài liệu 41 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR SM-1 so sánh với công bố tài liệu 46 Bảng Dữ liệu phổ NMR SM-2 so sánh với công bố tài liệu .47 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR SM-3 so sánh với công bố tài liệu .48 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR EL-1 so sánh với công bố tài liệu 52 Bảng 3.7 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn hypophyllanthin phyllanthin .54 Bảng 3.8 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone tanshinone IIA 56 Bảng 3.9 Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết chất chuẩn eurycomanone 57 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin .67 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA .68 Bảng 3.12 Kết khảo sát độ ổn định hệ thống thiết bị LC-MS/MS phân tích Eurycomanone 69 Bảng 3.13 Kiểm tra độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD phân tích đồng thời hypophyllanthin phyllanthin, phân tích Eurycomanone 80 Bảng 3.14 Kết đánh giá độ lặp lại PP LC-MS/MS UPLC-DAD .81 Bảng 3.15 Kết kiểm tra độ phƣơng pháp LC-MS/MS hypophyllanthin phyllanthin 83 Bảng 3.16 Kết kiểm tra độ phƣơng pháp LC-MS/MS tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA 84 Bảng 3.17 Dữ liệu xác định giá trị LOD hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin eurycomanone 86 Bảng 3.18 Dữ liệu xác định giá trị LOD hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone tanshinone IIA 86 vii Bảng 3.19 Hàm lƣợng (mg/g) hypophyllanthin phyllanthin mẫu thực phẩm chức bào chế từ Diệp hạ châu 88 Bảng 3.20 Hàm lƣợng (mg/g) tanshinone I, tanshinone IIA cryptotanshinone mẫu Đan sâm 90 Bảng 3.21 Hàm lƣợng (mg/g) eurycomanone Mật nhân địa phƣơng khác 91 Bảng 3.22 Phƣơng trình đƣờng thêm chuẩn LOD, LOQ phƣơng pháp phân tích .98 Bảng 3.23 Hàm lƣợng (%) cấu tử nhóm hợp chất có mặt tinh dầu chiết tách từ phận Riềng đuôi nhọn 102 viii (mg/g) TB+S (mg/g) 0,1197±0,0012 0,119 ± 0,001 RSD(%) 1,0 0,8 1/2RSDH(%) 3,9 1,9 C (μg/mL) Hàm lƣợng Phyllanthin (*) (mg/g) 0,1648 0,1649 0,1646 4,117 4,216 4,157 0,4153 0,4155 0,4149 0,415 0,425 0,419 TB+S (mg/g) 0,4152±0,0003 0,420 ± 0,005 RSD(%) 0,1 1,2 1/2RSDH(%) 3,2 3,2 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C15 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLCDAD xác định Hypophyllanthin Phyllanthin mẫu thuốc DHC-PV Mẫu DHC-PV Thông số/ Chất Đại lƣợng L1 L2 L3 C (μg/mL) 0,1249 0,1256 0,1258 0,2993 0,3011 0,3016 (mg/g) L2 L3 3,098 3,139 3,129 0,297 0,301 0,300 0,3007±0,0012 0,299 ± 0,002 RSD(%) 0,4 0,7 1/2RSDH(%) 3,4 1,9 Hàm lƣợng (*) L1 TB+S (mg/g) C (μg/mL) Phyllanthin UPLC-DAD thống kê Hàm lƣợng Hypophyllanthin LC-MS/MS (mg/g) 0,4817 0,4820 0,4816 11,984 12,109 11,869 1,1545 1,1554 1,1543 1,149 1,161 1,138 TB+S (mg/g) 1,1547±0,0006 1,149 ± 0,012 RSD(%) 0,1 1,0 1/2RSDH(%) 2,8 2,8 TB, S RSD: giống bảng 3.4 153 Phụ lục C16 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLCDAD xác định Hypophyllanthin Phyllanthin mẫu thuốc DHC-DD5 Mẫu DHC-DD5 Thông số/ Đại Chất lƣợng thống L1 L2 L3 L1 L2 L3 C (μg/mL) 0,0245 0,0243 0,0244 0,610 0,600 0,590 0,0602 0,0596 0,0599 0,06 0,059 0,058 (mg/g) TB+S (mg/g) 0,0599±0,0003 0,059 ± 0,001 RSD(%) 0,5 1,7 1/2RSDH(%) 4,3 2,1 C (μg/mL) Hàm lƣợng Phyllanthin (*) UPLC-DAD kê Hàm lƣợng Hypophyllanthin LC-MS/MS (mg/g) 0,0326 0,0325 0,0332 0,783 0,824 0,814 0,0801 0,0799 0,0815 0,077 0,081 0,080 TB+S (mg/g) 0,0805±0,0009 0,079 ± 0,002 RSD(%) 1,1 2,6 1/2RSDH(%) 4,1 4,1 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C17 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Hypophyllanthin Phyllanthin mẫu thuốc DHC-KH Mẫu DHC-KH Thông số/ Chất Đại lƣợng UPLC-DAD thống kê L1 L2 L3 L1 L2 L3 C (μg/mL) 0,4904 0,4899 0,4910 12,295 12,258 12,239 0,6602 0,6594 0,6609 0,662 0,66 0,659 Hàm lƣợng Hypophyllanthin LC-MS/MS (mg/g) TB+S (mg/g) 0,6602±0,0008 0,660 ± 0,001 RSD(%) 0,1 0,2 1/2RSDH(%) 3,0 1,8 154 C (μg/mL) Hàm lƣợng Phyllanthin (*) (mg/g) 1,4158 1,4160 1,4151 35,305 35,510 35,101 1,9058 1,9061 1,9049 1,901 1,912 1,890 TB+S (mg/g) 1,9056±0,0006 1,901 ± 0,011 RSD(%) 0,1 0,6 1/2RSDH(%) 2,6 2,6 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C18 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLCDAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Sapa Mẫu Sapa Thông số/ Đại Chất lƣợng thống L1 L2 L3 C (μg/mL) 0,7997 0,8000 0,8001 2,4606 2,4614 2,4619 (mg/g) L3 2,44 2,46 2,46 2,45±0,01 RSD(%) 0,03 0,5 1/2RSDH(%) 2,47 2,5 (mg/g) 2,9863 2,9865 2,9865 9,1887 9,1889 9,1891 9,21 9,15 TB+S (mg/g) 9,1889±0,0002 9,18±0,03 RSD(%) 0,002 0,3 1/2RSDH(%) 2,03 2,0 C (μg/mL) Hàm lƣợng (*) L2 2,4613±0,0007 Hàm lƣợng Cryptotanshinone L1 TB+S (mg/g) C (μg/mL) Tanshinone IIA UPLC-DAD kê Hàm lƣợng Tanshinone I LC-MS/MS (mg/g) 1,5126 1,5128 1,5130 4,6543 4,6549 4,6555 4,63 4,66 TB+S (mg/g) 4,6549±0,0006 4,65±0,02 RSD(%) 0,01 0,4 1/2RSDH(%) 2,24 2,2 TB, S RSD: giống bảng 3.4 155 9,18 4,67 Phụ lục C19 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Lâm Đồng Mẫu Lâm Đồng Thông số/ Đại Chất lƣợng thống kê C (μg/mL) Hàm lƣợng Tanshinone I (mg/g) L3 1,4218 1,4212 1,4217 4,4293 4,4275 4,4289 L1 L2 L3 4,43 4,42 4,44 4,43±0,01 RSD(%) 0,02 0,2 1/2RSDH(%) 2,26 2,3 (mg/g) 3,1757 3,1775 3,1775 9,893 9,8991 9,8989 9,88 9,86 TB+S (mg/g) 9,8970±0,0035 9,88±0,03 RSD(%) 0,035 0,3 1/2RSDH(%) 2,0 2,0 C (μg/mL) Hàm lƣợng (*) L2 4,4286±0,0009 Hàm lƣợng Cryptotanshinone L1 UPLC-DAD TB+S (mg/g) C (μg/mL) Tanshinone IIA LC-MS/MS (mg/g) 2,6190 2,6188 2,6192 8,1590 8,1583 8,1595 8,13 8,16 TB+S (mg/g) 8,1589±0,0006 8,14±0,02 RSD(%) 0,01 0,2 1/2RSDH(%) 2,06 2,1 9,91 8,14 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C20 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Hà Giang Mẫu Hà Giang Thông số/ Chất Đại lƣợng thống kê Tanshinone I C (μg/mL) LC-MS/MS L1 1,0996 L2 1,0989 156 UPLC-DAD L3 1,0991 L1 L2 L3 Hàm lƣợng (mg/g) 3,51 3,54 3,53±0,02 RSD(%) 0,03 0,4 1/2RSDH(%) 2,34 2,3 (mg/g) 4,0510 4,0507 4,0507 13,0257 13,0251 13,0249 12,97 12,95 3,53 13,06 TB+S (mg/g) 13,0252±0,0004 12,99±0,06 RSD(%) 0,003 0,5 1/2RSDH(%) 1,92 1,9 C (μg/mL) Hàm lƣợng (*) 3,5342 3,5345±0,0011 Hàm lƣợng Cryptotanshinone 3,5335 TB+S (mg/g) C (μg/mL) Tanshinone IIA 3,5357 (mg/g) 1,6173 1,6178 1,6182 5,2002 5,2019 5,2031 5,14 5,19 TB+S (mg/g) 5,2017±0,0015 5,19±0,03 RSD(%) 0,03 0,5 1/2RSDH(%) 2,21 2,2 5,21 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C21 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Mộc Châu Mẫu Mộc Châu Thông số/ Đại Chất lƣợng thống kê C (μg/mL) Hàm lƣợng Tanshinone I Tanshinone IIA (mg/g) LC-MS/MS L1 UPLC-DAD L2 L3 0,8887 0,8884 0,8889 2,8853 2,8843 2,8861 L1 L2 L3 2,85 2,91 2,87 TB+S (mg/g) 2,8852±0,0009 2,88±0,03 RSD(%) 0,03 1,1 1/2RSDH(%) 2,41 2,4 C (μg/mL) 2,5823 157 2,5826 2,5826 Hàm lƣợng (mg/g) 8,3851 8,35 8,45 8,3844±0,0006 8,39±0,05 RSD(%) 0,008 0,6 1/2RSDH(%) 2,05 2,1 Hàm lƣợng (*) 8,3839 TB+S (mg/g) C (μg/mL) Cryptotanshinone 8,3841 (mg/g) 1,2853 1,2849 1,2850 4,1729 4,1719 4,1722 4,18 4,14 TB+S (mg/g) 4,1723±0,0005 4,16±0,02 RSD(%) 0,01 0,5 1/2RSDH(%) 2,28 2,3 8,38 4,16 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C22 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Quảng Tây Mẫu Quảng Tây Thông số/ Đại Chất lƣợng thống kê C (μg/mL) Hàm lƣợng Tanshinone I (mg/g) L2 L3 0,4978 0,4984 0,4976 1,5555 1,5574 1,5549 L1 L2 L3 1,56 1,54 1,58 1,5559±0,0013 1,56±0,02 RSD(%) 0,08 1,3 1/2RSDH(%) 2,65 2,6 Hàm lƣợng Cryptotanshinone L1 UPLC-DAD TB+S (mg/g) C (μg/mL) Tanshinone IIA LC-MS/MS (mg/g) 1,5347 1,5348 1,5348 4,7958 4,7951 4,7964 4,75 4,79 TB+S (mg/g) 4,7958±0,0007 4,78±0,03 RSD(%) 0,014 0,6 1/2RSDH(%) 2,23 2,2 C (μg/mL) 0,9164 158 0,9159 0,9163 4,81 Hàm lƣợng (mg/g) (*) 2,8636 2,8621 2,8634 2,86 2,84 TB+S (mg/g) 2,8630±0,0008 2,85±0,01 RSD(%) 0,03 0,4 1/2RSDH(%) 2,41 2,4 2,86 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C23 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS UPLC-DAD xác định Tanshinone I, Tanshinone IIA Cryptotanshinone mẫu Mƣờng Lống Mẫu Mƣờng Lống Thông số/ Đại Chất lƣợng thống kê C (μg/mL) Hàm lƣợng Tanshinone I (mg/g) L3 0,4080 0,4080 0,4087 1,2711 1,2709 1,2732 L1 L2 L3 1,28 1,26 1,25 1,26±0,02 RSD(%) 0,10 1,2 1/2RSDH(%) 2,73 2,7 (mg/g) 1,2288 1,2286 1,2286 3,8279 3,8281 3,8275 3,84 3,78 TB+S (mg/g) 3,8278±0,0003 3,81±0,03 RSD(%) 0,008 0,8 1/2RSDH(%) 2,31 2,3 C (μg/mL) Hàm lƣợng (*) L2 1,2717±0,0013 Hàm lƣợng Cryptotanshinone L1 UPLC-DAD TB+S (mg/g) C (μg/mL) Tanshinone IIA LC-MS/MS (mg/g) 1,2509 1,2501 1,2505 3,8969 3,8945 3,8955 3,85 3,91 TB+S (mg/g) 3,8956±0,0012 3,88±0,03 RSD(%) 0,03 0,8 1/2RSDH(%) 2,30 2,3 TB, S RSD: giống bảng 3.4 159 3,81 3,89 Phụ lục C24 Kết đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp LC-MS/MS xác định Eurycomanone mẫu Ký hiệu mẫu Vũng Tàu Đăk Nơng Hịa Bình Nghệ An Bắc Giang Hà Giang Thông số/ Đại lƣợng Eurycomanone thống kê L1 L2 L3 C (μg/mL) 2,8706 2,8708 2,8706 Hàm lƣợng (mg/g) 1,8533 1,8534 1,8533 TB+S (mg/g) 1,8533±0,0001 RSD(%) 0,002 1/2RSDH(%) 2,6 C (μg/mL) 0,2623 0,2624 0,2622 Hàm lƣợng (mg/g) 0,1716 0,1716 0,1715 TB+S (mg/g) 0,1716±0,0001 RSD(%) 0,035 1/2RSDH(%) 3,7 C (μg/mL) 1,2352 1,2354 1,2351 Hàm lƣợng (mg/g) 0,8015 0,8016 0,8014 TB+S (mg/g) 0,8015±0,0001 RSD(%) 0,003 1/2RSDH(%) 2,9 C (μg/mL) 0,4201 0,4199 0,4202 Hàm lƣợng (mg/g) 0,2739 0,2738 0,2740 TB+S (mg/g) 0,2739±0,0001 RSD(%) 0,008 1/2RSDH(%) 3,4 C (μg/mL) 4,7814 4,7822 4,7806 Hàm lƣợng (mg/g) 3,1336 3,1341 3,1331 TB+S (mg/g) 3,1336±0,0005 RSD(%) 0,014 1/2RSDH(%) 2,4 C (μg/mL) 1,3939 160 1,3937 1,3940 Hàm lƣợng (mg/g) (*) 0,9292 0,9291 TB+S (mg/g) 0,9291±0,0001 RSD(%) 0,009 1/2RSDH(%) 2,9 0,9292 TB, S RSD: giống bảng 3.4 Phụ lục C25 Kết phân tích hàm lƣợng phyllanthin Mẫu Lá Thân Rễ Hàm lƣợng phyllanthin đo đƣợc, mg/g Lần Lần Lần TB ± S RSD(%) 0,0439 0,0050 0,0039 0,0436 0,0048 0,0037 0,0443 0,0054 0,0041 0,0439±0,0004 0,0051±0,0003 0,0039±0,0002 0,8 6,0 5,1 ½ RSDH (%) 4,5 6,3 6,5 Phụ lục C26 Kết phân tích hàm lƣợng hypophyllanthin Mẫu Hàm lƣợng hypophyllanthin đo đƣợc, mg/g ½ RSDH (%) Lần Lần Lần Trung bình ± SD RSD(%) Lá 0,2748 0,2744 0,2751 0,2748±0,0004 0,1 3,4 Thân Rễ 0,0166 0,0029 0,0163 0,0030 0,0171 0,0027 0,0167±0,0004 0,0029±0,0002 2,4 5,3 5,2 6,8 161 Phụ lục C27 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định phyllanthin mẫu thuốc nghiên cứu Mẫu DHC-VX Cx(ug/mL) DHC-PV Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần C0(ug/mL) 0,1186 0,1190 0,1188 0,1186 0,1190 0,1188 0,1186 0,1190 0,1188 C(ug/mL) 0,1477 0,1475 0,1476 0,2656 0,2672 0,2691 1,6141 1,6191 1,6182 100 100 DHC-KH 97 95 96 98 98 100 99 C0(ug/mL) 0,0453 0,0454 0,0456 0,0453 0,0454 0,0456 0,0453 0,0454 0,0456 C(ug/mL) 0,0745 0,0739 0,0743 0,1949 0,1938 0,1944 1,5456 1,5428 1,5451 97 95 95 99 98 99 100 99 0,1648 0,1649 0,1646 0,1648 0,1649 0,1646 0,1648 0,1649 0,1646 C(ug/mL) 0,1935 0,1941 0,1939 0,3132 0,3132 0,3151 1,6639 1,6643 1,6653 Rev(%) 96 97 97 98 98 100 99 99 0,4817 0,4820 0,4816 0,4817 0,4820 0,4816 0,4817 0,4820 0,4816 C(ug/mL) 0,5102 0,5123 0,5115 0,6301 0,6335 0,6322 1,9787 1,9811 1,9845 101 100 101 99 98 99 99 0,0326 0,0325 0,0332 0,0326 0,0325 0,0332 0,0326 0,0325 0,0332 C(ug/mL) 0,0618 0,0632 0,0620 0,1811 0,1821 0,1835 1,5311 1,5329 1,5342 100 100 97 102 96 99 99 100 99 95-100 96-100 95-101 100 C0(ug/mL) Rev(%) 95-100 100 C0(ug/mL) 95 RevTB (%) 99 C0(ug/mL) Rev(%) DHCDD5 1.5 Lần Rev(%) DHCPNC 0.15 Thí nghiệm Rev(%) DHC-DH 0.03 C0(ug/mL) 1,4158 1,4160 1,4151 1,4158 1,4160 1,4151 1,4158 1,4160 1,4151 C(ug/mL) 1,4445 1,4451 1,4449 1,5652 1,5664 1,5661 2,9144 2,9139 2,9164 96-102 95-100 Rev(%) 95 97 99 99 100 100 99 99 100 (*) Cx: Nồng độ chất chuẩn thêm vào; Co: Nồng độ chất mẫu (µg / mL); C: Nồng độ mẫu sau thêm chuẩn; Rev: Độ thu hồi; RevTB: Độ thu hồi trung bình (n = 9); Điều kiện thí nghiệm giống nhƣ mục 3.3 162 Phụ lục C28 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định hypophyllanthin mẫu thuốc nghiên cứu Mẫu DHC-VX Cx(ug/mL) Thí nghiệm Lần Lần C0(ug/mL) 0,0499 0,0498 C(ug/mL) 0,0596 0,0595 Rev(%) DHC-DH DHC-PV DHC-KH 97 Lần Lần Lần 0,05 0,0499 0,0498 0,0598 0,0988 0,0976 98 97 95 RevTB 0.5 Lần Lần Lần 0,05 0,0499 0,0498 0,05 0,0998 0,5487 0,5479 0,5522 99 99 99 Lần 0,0263 0,0265 0,0264 0,0263 0,0265 0,0264 0,0263 0,0265 C(ug/mL) 0,0359 0,0362 0,0368 0,0756 0,0767 0,0761 0,5272 0,5265 0,5269 100 100 100 95 99 103 98 100 99 C0(ug/mL) 0,0473 0,0481 0,0472 0,0473 0,0481 0,0472 0,0473 0,0481 0,0472 C(ug/mL) 0,0569 0,0577 0,0573 0,0974 0,0969 0,0971 0,5456 0,5468 0,5475 101 100 Rev(%) 96 96 97 99 99 99 0,1249 0,1256 0,1258 0,1249 0,1256 0,1258 0,1249 0,1256 0,1258 C(ug/mL) 0,1346 0,1359 0,1355 0,1746 0,1751 0,1763 0,6232 0,6244 0,626 103 97 99 99 101 99 99 0,0245 0,0243 0,0244 0,0245 0,0243 0,0244 0,0245 0,0243 0,0244 C(ug/mL) 0,0341 0,0338 0,0345 0,0727 0,0755 0,0746 0,5222 0,5219 0,5268 102 100 96 95 101 96 99 99 0,4904 0,4899 0,491 0,4904 0,4899 0,491 0,4904 0,4899 0,491 C(ug/mL) 0,4998 0,4995 0,5011 0,5392 0,5408 0,5397 0,989 0,9867 0,9901 97 163 101 97 99 99 96-101 97-103 95-102 100 C0(ug/mL) Rev(%) 94 96 101 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22 95-103 100 C0(ug/mL) Rev(%) 95-100 100 C0(ug/mL) 97 (%) 100 0,0264 Rev(%) DHCDD5 97 0.05 C0(ug/mL) Rev(%) DHCPNC 0.01 99 94-101 Phụ lục C29 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định tanshinone I* Mẫu Sapa Lâm Đồng Hà Giang Mộc Châu Guangxi Mƣờng Lống Cx(ug/mL) 0.3 1.0 RevTB 2.0 Thí nghiệm Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần C0(ug/mL) 0,7997 0,8000 0,8001 0,7997 0,8000 0,8001 0,7997 0,8000 0,8001 C(ug/mL) 1,1012 1,0941 1,1109 1,8211 1,7809 1,8321 2,8751 2,8112 2,7501 Rev(%) 100 98 103 102 98 103 103 100 97 C0(ug/mL) 1,4218 1,4212 1,4217 1,4218 1,4212 1,4217 1,4218 1,4212 1,4217 C(ug/mL) 1,7092 1,7094 1,7139 2,4511 2,4059 2,4121 3,4751 3,4512 3,3501 Rev(%) 95 96 97 102 98 99 102 101 96 C0(ug/mL) 1,0996 1,0989 1,0991 1,0996 1,0989 1,0991 1,0996 1,0989 1,0991 C(ug/mL) 1,3892 1,3941 1,3909 2,1211 2,1059 2,0821 3,0751 3,1512 3,0501 Rev(%) 96 98 97 102 100 98 98 102 97 C0(ug/mL) 0,8887 0,8884 0,8889 0,8887 0,8884 0,8889 0,8887 0,8884 0,8889 C(ug/mL) 1,1792 1,1841 1,1809 1,9211 1,9059 1,8721 2,8751 2,9512 2,9301 Rev(%) 96 98 97 103 101 98 99 103 102 C0(ug/mL) 0,4978 0,4984 0,4976 0,4978 0,4984 0,4976 0,4978 0,4984 0,4976 C(ug/mL) 0,7921 0,7892 0,7879 1,5211 1,5059 1,4872 2,4751 2,5121 2,5301 Rev(%) 98 96 96 102 100 98 98 100 101 C0(ug/mL) 0,4080 0,4080 0,4087 0,4080 0,4080 0,4087 0,4080 0,4080 0,4087 C(ug/mL) 0,7201 0,6992 0,7009 1,4211 1,4059 1,4172 2,4751 2,3901 2,4331 101 99 100 103 99 101 Rev(%) 98 97 97 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22 164 (%) 97-103 95-102 96-102 96-103 96-102 97-103 Phụ lục C30 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định cryptotanshinone Mẫu Sapa Lâm Đồng Hà Giang Mộc Châu Guangxi Mƣờng Lống Cx(ug/mL) 0,5 1,5 3,0 Thí nghiệm Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần C0(ug/mL) 1,5126 1,5128 1,5130 1,5126 1,5128 1,5130 1,5126 1,5128 1,5130 C(ug/mL) 2,0021 2,0173 1,9992 3,0511 2,9759 3,0172 4,4751 4,5901 4,4331 Rev(%) 97 100 97 102 97 100 98 102 97 C0(ug/mL) 2,6190 2,6188 2,6192 2,6190 2,6188 2,6192 2,6190 2,6188 2,6192 C(ug/mL) 3,1071 3,1133 3,1072 4,0913 4,1705 4,1004 5,5955 5,6514 5,5331 Rev(%) 97 98 97 98 103 98 99 101 97 C0(ug/mL) 1,6173 1,6178 1,6182 1,6173 1,6178 1,6182 1,6173 1,6178 1,6182 C(ug/mL) 2,1017 2,1343 2,1127 3,1023 3,1695 3,1064 4,5458 4,6574 4,5371 Rev(%) 96 103 98 99 103 99 97 101 97 C0(ug/mL) 1,2853 1,2849 1,2850 1,2853 1,2849 1,2850 1,2853 1,2849 1,2850 C(ug/mL) 1,7722 1,8034 1,7912 2,7628 2,7865 2,8336 4,2544 4,1697 4,3712 Rev(%) 97 103 101 98 101 103 98 96 102 C0(ug/mL) 0,9164 0,9159 0,9163 0,9164 0,9159 0,9163 0,9164 0,9159 0,9163 C(ug/mL) 1,4042 1,4139 1,3996 2,4682 2,4405 2,3963 4,0374 3,9677 3,8379 Rev(%) 97 99 96 103 101 98 104 101 97 C0(ug/mL) 1,2509 1,2501 1,2505 1,2509 1,2501 1,2505 1,2509 1,2501 1,2505 C(ug/mL) 1,7394 1,7391 1,7350 2,7692 2,7185 2,7936 4,2037 4,2647 4,3097 96 101 97 102 98 100 101 Rev(%) 97 97 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22 165 RevTB (%) 97-102 97-101 96-103 96-103 96-103 96-102 Phụ lục C31 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định tanshinone IIA Mẫu Sapa Lâm Đồng Hà Giang Mộc Châu Guangxi Mƣờng Lống Cx(ug/mL) 1,0 3,0 RevTB 6,0 Thí nghiệm Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần (%) C0(ug/mL) 2,9863 2,9865 2,9865 2,9863 2,9865 2,9865 2,9863 2,9865 2,9865 97- C(ug/mL) 3,9754 3,9639 3,9753 6,0692 5,9155 5,9376 9,0203 9,1264 9,0309 102 Rev(%) 98 97 98 102 97 98 100 102 100 C0(ug/mL) 3,1757 3,1775 3,1775 3,1757 3,1775 3,1775 3,1757 3,1775 3,1775 97- C(ug/mL) 4,1504 4,1603 4,1735 6,1959 6,1135 6,0937 9,1020 9,2264 9,2430 101 Rev(%) 97 98 99 100 97 97 98 100 101 C0(ug/mL) 4,0510 4,0507 4,0507 4,0510 4,0507 4,0507 4,0510 4,0507 4,0507 96- C(ug/mL) 5,0314 5,0196 5,0435 7,0915 6,9853 7,1032 10,1202 10,0296 10,2243 102 Rev(%) 98 96 99 101 97 101 101 99 102 C0(ug/mL) 2,5823 2,5826 2,5826 2,5823 2,5826 2,5826 2,5823 2,5826 2,5826 97- C(ug/mL) 3,5641 3,5609 3,5705 5,6191 5,4985 5,6503 8,5247 8,6297 8,7224 102 97 98 101 97 102 99 100 102 Rev(%) 98 C0(ug/mL) 1,5347 1,5348 1,5348 1,5347 1,5348 1,5348 1,5347 1,5348 1,5348 96- C(ug/mL) 2,4991 2,4965 2,5071 4,6019 4,4968 4,4543 7,5284 7,6029 7,7022 102 Rev(%) 96 96 97 102 98 97 99 101 102 C0(ug/mL) 1,2288 1,2286 1,2286 1,2288 1,2286 1,2286 1,2288 1,2286 1,2286 96- C(ug/mL) 2,1909 2,2096 2,2237 4,2192 4,2968 4,1904 7,2148 7,1672 7,3012 102 99 102 98 99 98 101 Rev(%) 96 98 99 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22 166 Phụ lục C32 Kết đánh giá độ phƣơng pháp xác định eurycomanone mẫu nghiên cứu Mẫu Vũng Tàu Đắk Nơng Hịa Bình Nghệ An Bắc Giang Hà Giang Cx(ug/mL) 0,5 1,0 2,0 Thí nghiệm Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần C0(ug/mL) 2,8706 2,8708 2,8706 2,8706 2,8708 2,8706 2,8706 2,8708 2,8706 C(ug/mL) 3,3682 3,3688 3,3713 3,8701 3,8684 3,8689 4,8712 4,8721 4,8701 Rev(%) 97 99 100 99 98 101 101 100 C0(ug/mL) 0,2623 0,2624 0,2622 0,2623 0,2624 0,2622 0,2623 0,2624 0,2622 C(ug/mL) 0,7588 0,7611 0,7601 1,2604 1,2612 1,2626 2,2634 2,2615 2,2623 Rev(%) 99 97 99 99 100 100 C0(ug/mL) 1,2352 1,2354 1,2351 1,2352 1,2354 1,2351 1,2352 1,2354 1,2351 C(ug/mL) 1,7308 1,7312 1,7302 2,2304 2,2307 2,2310 3,2354 3,2356 3,2360 Rev(%) 98 99 99 99 98 98 101 100 100 C0(ug/mL) 0,4201 0,4199 0,4202 0,4201 0,4199 0,4202 0,4201 0,4199 0,4202 C(ug/mL) 0,9178 0,9182 0,9174 1,4187 1,4185 1,4179 2,4211 2,4215 2,4221 Rev(%) 97 99 101 99 98 100 C0(ug/mL) 4,7814 4,7822 4,7806 4,7814 4,7822 4,7806 4,7814 4,7822 4,7806 C(ug/mL) 5,2764 5,277 5,2771 5,7822 5,7812 5,7816 6,7804 6,781 6,7801 Rev(%) 99 98 99 100 99 101 C0(ug/mL) 1,3939 1,3937 1,394 1,3939 1,3937 1,394 C(ug/mL) 1,8891 1,8879 1,8885 2,3917 2,392 2,3924 98 99 Rev(%) 99 98 (*) Cx, Co, C, Rev, RevTB giống nhƣ Phụ lục C22 167 98 100 99 100 99 99 99 99 100 102 101 99 1,3939 1,3937 1,394 3,3929 3,3931 3,3921 98 99 101 RevTB (%) 97101 97100 98101 97102 98101 98101 ... HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ĐOÀN MẠNH DŨNG NGHIÊN CỨU TÁCH, ĐIỀU CHẾ CHẤT CHUẨN VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC Ngành: Hóa Phân tích Mã số: ... Giới thiệu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học số thuốc 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Các nghiên cứu tách chiết số hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học ... sinh học nguồn thiên nhiên sinh tổng hợp hợp chất Hơn nữa, hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên dùng trực tiếp y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng phân