Cây mãng cầu xiêm (Annona muricata) – một loài cây có mặt ở nhiều quốc gia trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam – đã đƣợc thừa nhận là chứa nhiều HCTN có giá trị, trong đó đáng quan tâm nhất là nhóm các hợp chất acetogenin, đƣợc ghi nhận là có khả năng chống ung thƣ [89], [98]. Song, do nhóm hợp chất đó vừa có số lượng phong phú lại có cấu trúc tương tự nhau, giống các chất béo, nên rất khó chiết tách/phân lập riêng và xác định cấu trúc của chúng. Một vài nghiên cứu trên thế giới đã tập trung nghiên cứu chiết tách nhóm các hợp chất đó và phân tích cấu trúc các chất trong nhóm [98], [59]. Ở nước ta, chưa có nhiều nghiên cứu theo hướng này.
Người ta cho rằng, để kết hợp đồng thời – chiết tách, phân tích cấu trúc và định tính nhóm các hợp chất acetogenin rất khó khi sử dụng các phương pháp như HPLC- UV, LC-MS… – Và vì vậy cần thiết phải sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại kết hợp nhƣ qNMR, HRMS… [46], [90].
Để góp phần cung cấp thông tin về các HCTN - nhóm các hợp chất acetogenin - chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm (thu hái ở Nghệ An) và phân tích cấu trúc của chúng, nghiên cứu này sẽ sử dụng phương pháp phân tích hiện đại qNMR kết hợp với HPLC-PDA-HRMS (sắc ký lỏng ghép nối với detector mảng diot quang và khối phổ phân giải cao) để phân tích cấu trúc và định tính các hợp chất acetogenin trong dịch chiết phân đoạn từ là cây Mãng cầu xiêm.
93
Hình 3.37. Quy trình phân tích định tính, định lƣợng các hợp chất acetogenin từ dịch chiết của cây Mãng cầu xiêm
Bột lá Mãng cầu xiêm (25 g)
Cao chiết
Mẫu dạng siro
AMF-1 AMF-3 AMF-3 AMF-4
qNMR
HPLC-PDA-HRMS
- Pha dãy các nồng độ chất chuẩn annonacin (4-OH acetogenin) và squamocin (không chứa 4-OH acetogenin);
- Xây dựng đường thêm chuẩn;
- Phân tích mẫu thực;
- Xử lý kết quả.
Phân tích định lƣợng bằng qNMR
100 mL EtOH
- 400 MHz;
- Thời gian quét là 10 lần trong 7 phút;
- Chiều rộng phổ là 6002,4 Hz;
- Chiều rộng của xung là 6,3 ms;
- Tín hiệu đặc trƣng trên phổ 1H-NMR tại (δH 8,66).
- Cột RP-18 (250 mm x 4,6 mm, 5 micron);
- Nhiệt độ cột ở 300C;
- Pha động MeOH:H2O 90:10 (v/v);
- Tốc độ dòng là 1,0 ml/phút - Bước sóng phát hiện tại 220 nm;
- Phổ khối lƣợng MALDI-TOF HRMS.
Chọn mẫu chứa tín hiệu của các acetogenin để phân tích tiếp.
Định tính dựa vào thời gian lưu và các mảnh phổ phân tử phân giải cao
Phân bố vào nước; chiết lỏng lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexan, cloroform, etyl axetat, butanol); Lọc; Cô loại dung môi thu dc cao chiết tương ứng.
Trích ly một bậc gián đoạn;
Lọc; Cô loại dung môi. Trích ly nhiều bậc, ngƣợc chiều để loại béo và lipid;
lọc; Cô loại dung môi.
94
Sử dụng quy trình chiết phân đoạn lá cây Mãng cầu xiêm bằng các dung môi khác nhau (như nêu ở hình 3.37): Trước hết, chiết bằng ethanol (chiết lỏng – rắn có trợ giúp của siêu âm); Tiếp theo chiết phần cao ethanol theo kiểu chiết phân đoạn lần lƣợt bằng các dung môi khác nhau (n-hexane, ethylacetate, chlorofoorm và butanol), thu được các phân đoạn (ở dạng cao chiết) tương ứng là AMF1, AMF2, AMF3 và AMF4. Tiếp theo, hòa tan mỗi phần cao đó vào dung môi CD3OD và đƣa vào hệ thiết bị qNMR để nhận biết phần cao nào chứa nhiều nhóm acetogenin, dựa vào các tín hiệu đặc trƣng của phổ qNMR. Từ kết quả này, đã xác định đƣợc - phân đoạn cao chiết AMF3 là phân đoạn chứa nhiều (hay giàu) acetogenin nhất. Tiếp theo, phân đoạn này đƣợc hòa tan vào dung môi MeOH và đƣa vào hệ thiết bị HPLC-PDA-HRMS để phân tích định tính các hợp chất acetogenin, dựa vào các đặc trƣng phổ khối phân giải cao của chúng.
3.6.1. Xác định phân đoạn giàu hoạt chất acetogenin
Kết quả phân tích phân đoạn AMF3 bằng phương pháp qNMR (1H-NMR 500 MHz trong dung môi CDCl3) cho thấy (hình 3.38, phụ lục B11, B12, B13): Tín hiệu tại độ dịch chuyển hóa học δH 0,85 và 1,2 - 1,6 là ứng với một nhóm methyl cuối mạch và các nhóm methylene trong chuỗi dài; Tín hiệu của vòng (lacton) α, β và γ chƣa bão hòa xuất hiện tại δH 6,96/7,17 (1H, H-33/35) và 5,09/5,10 (1H, H- 34/36); Đồng thời, cũng xuất hiện tín hiệu của vòng mono-THF ứng với hai nhóm hydroxyl nằm bên sườn tại δH 3,76/3,81 và 3,37/3,44. Các tín hiệu trên là đặc trƣng cho nhóm acetogenin và chúng cũng phù hợp với kết quả đã đƣợc công bố ở [46], [59], [90].
Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz trong dung môi CDCl3) đối với các phân đoạn AMF-1, AMF-2 và AMF-4 cho thấy, không xuất hiện các tín hiệu đặc trƣng của nhóm acetogenin và nhƣ vậy, các phân đoạn đó chủ yếu giàu các axit béo (phổ 1H-NMR của các phân đoạn AMF-1, AMF-2 và AMF-4 không đƣa ra ở đây). Điều này cũng chứng tỏ rằng, quy trình chiết phân đoạn nói trên đã cho phép thu đƣợc phân đoạn AMF3 (cao ethylacetate) giàu acetogenin.
95
Hình 3.38. Phổ 1H-NMR của phân đoạn AMF-3 trong dung môi CDCl3. 3.6.2. Định tính các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3
Kết quả phân tích qNMR đã cho phép khẳng định rằng, phân đoạn AMF3 là phân đoạn giàu các hợp chất acetogenin. Song, vấn đề đặt là phân đoạn đó chứa chủ yếu những acetogenin nào. Để trả lời điều này, phân đoạn AFM3 (hòa tan trong dung môi MeOH) đƣợc đƣa vào phân tích trên hệ thống thiết bị HPLC-PDA-HRMS (detector HRMS kiểu MALDI-TOF) với các điều kiện thí nghiệm thích hợp đƣợc tham khảo từ các công bố trước đây [46], [90]. Các kết quả thu được ở các hình 3.31 - 3.34 cho thấy, trên sắc đồ xuất hiện các pic ở các thời gian lưu (tR) lần lượt là 12,19; 12,86; 18,94; 20,40; 23,28; 24,38 và 25,19 phút.
Tiếp theo, các phần chất ứng với các pic đó đƣợc tự động đƣa vào bộ phận MADLI-TOF-HRMS, sẽ thu được các phổ khối phân giải cao tương ứng. Từ các phổ này, chọn ra các phổ có các mảnh đặc trƣng để nhận biết các hợp chất acetogenin có mặt trong phân đoạn AMF-3 (hình 3.39, 3.40 và phụ lục B14, B15).
Từ các mảnh đặc trƣng có tỷ số (m/z) trong khoảng 100-1000 trên phổ MADLI-TOF-HRMS, xác định đƣợc các hợp chất acetogenin chính trong phân đoạn AMF3 (chiết tách từ lá của cây Mãng cầu xiêm). Việc nhận biết (hay định
96
tính) các hợp chất nhóm acetogenin là dựa vào thƣ viện phổ (cài đặt sẵn trong máy) và kết hợp so sánh với các công bố trước đây [46], [59], [89], [90]. Các chất chính trong nhóm acetogenin trong phân đoạn AMF3 gồm các chất: Annonacin (m/z 597,47); cis-annomonacin (m/z, 625,50); annocatacin A (m/z 579,46); Cohibin A (m/z, 549,48); cis-corossolone (m/z, 579,46); muricin A (m/z, 597,47); muricin B (m/z, 597,47); muricin C (m/z, 597,47); muricin D (m/z, 569,44), muricin E (m/z, 569,44), muricin F (m/z, 595,46), muricin G (m/z, 595,46).
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0
mAU
0 5 10 15 20 25 30
mAU
0 5 10 15 20 25 30
9.872 12.199 12.863 18.938 23.287 25.193 25.920
2: 225 nm, 8 nm
AMM-DI-3-agilent-1021213-TEST-40-MIN-F-1.0-1 AMM-DI-3-agilent-1021213-TEST-40-MIN-F-1.0-1
Retention Time
Hình 3.39. Sắc đồ HPLC-PDA đối với phân đoạn AMF-3.
97
Hình 3.40. Phổ MALDI-TOF-HRMS của các hợp chất acetogenin trong phân đoạn AMF-3
3.6.3. Định lƣợng các acetogenin chính trong phân đoạn AMF-3
Do rất khó tách riêng từng chất thuộc nhóm acetogenin, nên thông thường người ta chỉ định lượng tổng các chất chứa 4-OH và tổng các chất không chứa 4- OH trong nhóm các hợp chất acetogenin.
Sử dụng phương pháp qNMR với các điều kiện: tần số sóng 400 MHz, thời gian quét - 10 lần trong 7 phút, bề rộng phổ 6002,4 Hz và bề rộng xung 6,3 ms, để định lƣợng tổng các chất chứa 4-OH và tổng các chất không chứa 4-OH (non-4- OH) trong phân đoạn AMF3 (chiết tách từ lá cây Mãng cầu xiêm). Để định lƣợng, sử dụng chất chuẩn tương ứng là dung dịch chuẩn hồn hợp annonacin 4-OH (viết tắt là annonacin) và squamocin non-4-OH (viết tắt là squamocin) đƣợc pha trong dung môi chloroform-D1. Tiến hành định lƣợng annonacin và squamocin trong 10 mg mẫu (10 mg phân đoạn AMF3 hòa tan trong 0,6 mL chloroform-D1) theo phương pháp thêm chuẩn. Tín hiệu đo hay diện tích pic (để thiết lập đường thêm chuẩn) được chọn ở độ dịch chuyển hóa học δH 8,66. Phương trình đường thêm chuẩn và LOD, LOQ của phương pháp phân tích được nêu ở bảng 3.22.
98
Bảng 3.22. Phương trình đường thêm chuẩn và LOD, LOQ của phương pháp phân tích (*) Chất phân
tích
Phương trình đường
thêm chuẩn R2 LOD
(mg/mL)
LOQ (mg/mL) Annonacin y= 3,4705x + 1,1743 0,9925 0,05 0,14 Squamocin y= 3,575x + 0,209 0,9997 0,06 0,17
(*)y và x: Tương ứng là tín hiệu đo trên trục tung (diện tích pic) và nồng độ chất phân tích;
LOD (giới hiện phát hiện của phương pháp phân tích) ở đây được xác định dựa vào hồi quy tuyến tính, tức là LOD 3Sy/b; Trong đó, Sy và b tương ứng là sai số chuẩn của tín hiệu đo trên trục tung và độ dốc của đường hồi quy tuyến tính [88].
Kết quả phân tích cho thấy: Hàm lƣợng của tổng các chất chứa 4-OH trong mẫu (10 mg phân đoạn AMF3) là 2,88 mg và tổng các chất không chứa 4-OH là 1,77 mg. Nhƣ vậy, tổng hàm lƣợng các hoạt chất nhóm acetogenin có HTSH trong mẫu là 46%.
Cuối cùng, cũng cần thấy rằng, tuy các kết quả thu đƣợc ở trên chỉ là đối với một mẫu lá cây Mãng cầu xiêm (thu hái ở Nghệ An), nên tính đại diện còn hạn chế.
Song, nghiên cứu này đã góp phần cung cấp những thông tin ban đầu về các HCTN nhóm acetogenin chiết tách được từ lá cây Mãng cầu xiêm ở nước ta và là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo. Mặt khác, nghiên cứu này cũng cho phép khẳng định rằng, việc sử dụng hệ thống thiết bị kết hợp qNMR và HPLC-PDA-HRMS là cần thiết khi cần định tính và định lƣợng những hỗn hợp chất phức tạp, có đặc tính hóa – lý tương tự nhau như nhóm các hợp chất acetogenin.