Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Nội dung nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu của đề tài luận án bao gồm:
(1). Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng (dung môi, tỷ lệ dung môi…) đến quá trình chiết tách bằng kỹ thuật chiết dung môi và sắc ký cột để xây dựng quy trình tách chiết các phân đoạn giàu HCTN từ các cây thuốc quan tâm:
- Chiết tách hợp phần giàu chất hypophyllanthin và phyllanthin từ cây Diệp hạ châu.
- Chiết tách hợp phần giàu chất tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA từ cây Đan sâm.
- Chiết tách hợp phần giàu chất eurycomanone từ cây Mật nhân.
(2). Tinh chế một số HCTN từ hợp phần tương ứng đến độ tinh khiết đạt yêu cầu làm chất chuẩn cho phân tích:
- Tinh chế những chất phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone nào bằng kỹ thuật HPLC điều chế;
- Xác định các đặc trƣng của chất (cấu trúc, đặc trƣng hóa – lý) bằng các phương pháp phân tích NMR, MS, UV-Vis;
(3). Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố (dung dịch đệm và pH, dung môi/pha động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng…) để xây dựng quy trình phân tích các HCTN quan tâm bằng phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD, bao gồm:
phyllanthin, hypophyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone;
(4). Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích qua độ ổn định, độ đặc thù, độ lặp lại, khoảng tuyến tính (đối với chất chuẩn).
(5). Áp dụng quy trình phân tích xây dựng đƣợc vào thực tế:
- Kiểm soát chất lƣợng của PPPT qua độ lặp lại, độ đúng, LOD (đối với mẫu thực tế).
- Phân tích đồng thời cho các hợp chất hypophyllanthin và phyllanthin trong các mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu bằng LC-MS/MS và UPLC-DAD.
24
- Phân tích đồng thời cho các hợp chất hypophyllanthin và phyllanthin từ các bộ phận của cây Diệp hạ châu thu hái ở Nghệ An bằng LC-MS/MS.
- Phân tích đồng thời cho các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong mẫu dược liệu Đan sâm thu hái ở Sa Pa, Mộc Châu, Mường Lống, Hà Giang, Quảng Tây và Lâm Đồng bằng LC-MS/MS và UPLC-DAD.
- Phân tích eurycomanone trong mẫu dƣợc liệu Mật nhân đƣợc thu hái tại Bắc Giang, Nghệ An, Đắk Nông, Hòa Bình, Vũng Tàu và Hà Giang bằng LC-MS/MS.
(6). Tách chiết và phân tích dịch chiết từ lá Mãng cầu xiêm chứa nhóm acetogenin bằng phương pháp ghép nối kết hợp qNMR và HPLC-PDA-HRMS.
(7). Phân tích tinh dầu từ các bộ phân của cây Riềng đuôi nhọn bằng phương pháp GC-MS.
2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT
- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ hexan (Hex), methanol (MeOH), ethanol (EtOH), chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), butanol (BuOH) đều là loại tinh khiết dùng cho nghiên cứu chiết tách các HCTN (đƣợc chƣng cất từ các hóa chất đạt tiêu chuẩn công nghiệp).
- Nước dùng để tráng rửa chai lọ và các dụng cụ, pha chế hóa chất là nước cất 2 lần Genpure UV - Thermo, Đức.
- Các dung môi dùng cho phân tích đều là loại tinh khiết dùng cho phân tích các chất hữu cơ (Merck, Đức) gồm: methanol, acetonitrile, acid formic., (Merck).
- Vật liệu (hay pha tĩnh) nhồi cột dùng cho sắc ký cột (CC): silica gel (Kieselgel 60, 70-230 mesh và 20-400 mesh, Merck). Sắc ký lớp mỏng (TLC) sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60 F254 (1.05554, Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng chất hiện màu là hơi iot. Các thiết bị, dụng cụ chính đƣợc nêu ở bảng 2.3.
25
Bảng 2.1. Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu
Tên thiết bị Kiểu thiết bị
(model)
Hãng sản xuất (quốc gia)
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-MS/MS
Agilent Technologies
6420 Triple Quad Agilent (USA) Hệ thống sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC-DAD) Agilent 1290 Agilent (USA) Cột sắc ký EC-C18 (100 × 2,1 mm,
2,7 μm) Agilent (USA)
Hệ thống sắc ký lỏng điều chế
Agilent 218 Purification
System Agilent (USA)
Cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x
21,2 mm, 5,0 μm) G Agilent (USA)FL (Đức) Máy đo năng suất quay cực đo Jasco DIP-360 digital
polarimeter Sanyo, Nhật Bản Máy lọc nước siêu sạch Genpure UV Thermo, Đức
Cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500MHz Mỹ
Máy ly tâm Vortex Mỹ
Cân phân tích 4 số OHAUS PA214 Mỹ
Máy đo khối phổ ESI-MS micr OTOF-Q II 10187 Mỹ
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1. Thông tin về mẫu
Các loại mẫu đầu dùng cho nghiên cứu trong đề tài này đều đƣợc cung cấp bởi các cơ sở chuyên nghiên cứu về các HCTN ở nước ta. Các mẫu đều được lấy theo kiểu lấy mẫu tổ hợp để thu đƣợc mẫu đại diện cho vùng nghiên cứu và đƣợc sơ chế,
26
bảo quản theo đúng quy định về bảo quản mẫu cho nghiên cứu về các HCTN. Mặt khác, các mẫu đó đều là các mẫu phù hợp với các đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu nêu trên.
Có 2 nhóm mẫu: (i) Nhóm mẫu sử dụng cho chiết tách, phân lập tạo chất chuẩn phân tích (cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm và cây Mật nhân); (ii) Nhóm mẫu sử dụng cho phân tích hàm lƣợng (cây Diệp hạ châu, thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu, cây Đan sâm, cây Mật nhân thu hái ở các vùng dƣợc liệu khác nhau, cây Mãng cầu xiêm và cây Riềng đuôi nhọn).
Bảng 2.2. Thông tin mẫu thực phẩm chức năng bào chế từ cây Diệp hạ châu(*)
STT Ký hiệu Công ty sản xuất NSX HSD Số lô
1 DHC-VX CT TNHH
Vạn Xuân 24/12/2016 24/12/2018 061216C 2 DHC-DH
CT CP phát triển thương mại và dịch vụ DH Việt Nam
03/01/16 03/01/19 -
3 DHC-PNC
CT TNHH dƣợc phẩm AHEPRO Việt Nam
28/03/2017 27/03/20 012017
4 DHC-PV CT cổ phần dƣợc
phẩm DANAPHA 12/4/2017 11/04/20 0117
5 DHC-DD5
CT CP dƣợc phẩm Đông Dƣợc 5 FIDOPHARM
21/04/2016 21/04/19 010416
6 DHC-KH CT CP dƣợc VTYT
Khải Hà 03/05/17 02/05/19 010517
(*) NSX: thời gian sản xuất; HSD: thời hạn sử dụng.
Bảng 2.3. Thông tin về các mẫu cây
STT Ký hiệu Tên mẫu Thời gian thu
mẫu Địa điểm thu mẫu
1 DS-SP(*)
Rễ cây Đan sâm 10/2016
Sapa – Lào Cai
2 DS-LD Lâm Hà – Lâm Đồng
3 DS-HG Quản Bạ - Hà Giang
4 DS-MC Mộc Châu – Sơn La
5 DS-QT Quảng Tây – Trung Quốc
27
6 DS-ML Mường Lống – Nghệ An
7 MN-VT
Rễ cây Mật nhân 10/2017
Phú Mỹ - Vũng Tàu
8 MN-DN Krông Nô - Đắk Nông
9 MN-HB Lạc Sơn - Hòa Bình
10 MN-ML Mường Lống – Nghệ An
11 MN-BG(*) Sơn Động - Bắc Giang
12 MN-HG Quản Bạ - Hà Giang
13 DHC-La(*) Lá cây DHC 10/2017 Nam Đàn – Nghệ An 14 DHC-
Than(*) Thân cây DHC 10/2017 Nam Đàn – Nghệ An 15 DHC-Re(*) Rễ cây DHC 10/2017 Nam Đàn – Nghệ An
16 AM Mãng cầu xiêm 10/2014 Nam Đàn – Nghệ An
17 RDN-La Lá cây RDN
10/2016 Vườn quốc gia Pù Mát – Nghệ An
18 RDN-Than Thân cây RDN 19 RDN-Re Rễ cây RDN 20 RDN-Hoa Hoa cây RDN 21 RDN-Qua Quả cây RDN
(*) Mẫu sử dụng cho chiết tách, phân lập tạo chất chuẩn; DHC: Diệp hạ châu; RDN: Riềng đuôi nhọn
2.4.2. Phương pháp chiết tách/phân lập (i) Chiết tách các hợp phần từ cây khảo sát:
Tiến hành sử dụng 10 L dung môi (MeOH đối với mẫu Diệp hạ châu và EtOH đối với mẫu Đan sâm và Mật nhân) ngâm 2-5 kg mẫu kết hợp chiết siêu âm trong 2h. Sau đó lọc lấy dịch chiết thu đƣợc. Lặp lại quá trình 3 lần. Tất cả dịch chiết thu đƣợc loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không. Phần cao chiết thu được tiếp tục phân bố trong 5L nước cất và tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (hexan, etyl axetat, cloroform, butanol). Mỗi loại dung môi tiến hành 3 lần, gom dịch chiết của mỗi loại dung môi sau đó tiến hành loại bỏ dung môi bằng máy cô quay chân không, ghi lại kết quả thu đƣợc.
(ii) Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) để lựa chọn dung môi:
Đối với các mẫu sử dụng tách chiết và phân lập các HCTN, trước hết cần thực hiện sắc ký lớp mỏng (TLC) để lựa chọn phân đoạn chứa nhiều hợp chất dễ tách và lựa chọn dung môi thích hợp cho giai đoạn tách chiết tiếp theo bằng phương pháp sắc ký cột [19], [20].
28
Phương pháp TLC được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm. Hiện màu bằng phun hơi iot và chiếu xạ UV ở bước sóng 254 nm [109].
Trình tự các bước thực hiện TLC:
- Lấy 0,005 gam (5 mg) các mẫu cao chiết tách đƣợc ở trên hòa tan vào 5 mL dung môi MeOH, sau đó chấm một giọt dung dịch mẫu lên bản mòng silicagel dài rộng 5 1 cm, đƣợc đặt trong bình triển khai TLC, chứa dung môi khảo sát (5 mL) sao cho phần ngập trong dung môi là 0,5 cm; Thực hiện triển khai TCL trong 5 phút; Lấy bản mỏng ra, sấy khô và hiện màu bằng hơi iot.
- Tính hệ số lưu giữ (Rf) đối với chất cần chiết tách (chất thử), nhận giá trị từ 0 đến 1 – là đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển của chất phân tích trong dung môi xác định. Rf bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử (dR) và khoảng dịch chuyển của dung môi hay pha động (dM).
Cuối cùng, so sánh các giá trị Rf để chọn dung môi thích hợp – là dung môi cho giá trị Rf nằm trong khoảng 1/3 – 2/3.
(iii) Tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột:
Sau khi đã lựa chọn đƣợc dung môi thích hợp từ khảo sát ở trên, tiến hành sắc ký cột tiếp theo để thu đƣợc hợp phần chứa các chất quan tâm và tinh chế các chất đến tinh khiết. Phương pháp chiết tách bằng sắc ký cột được thực hiện với pha động (dung môi thích hợp) và cột chứa các pha tĩnh khác nhau: Silica gel, sử dụng silicagel với cỡ hạt 230 - 400 mesh; pha tĩnh là pha đảo C18; pha tĩnh Sephadex LH-20. Trong một số trường hợp, có thể sử dụng các cột liên tiếp chứa các pha tĩnh khác nhau. Từ đó, chọn pha tĩnh phù hợp cho sắc ký cột để tách chiết và tinh chế.
Trình tự thực hiện phương pháp sắc ký cột: Lấy 10 g mẫu cao chiết đƣợc lựa chọn cho sắc ký cột đƣợc hòa tan vào trong 50 mL dung môi methanol (MeOH) chứa 50 gam silicagel, tạo thành thể huyền phù; Sau đó, sấy khô ở nhiệt độ phòng (dùng máy sấy chuyên dụng thổi trên bề mặt), rồi nghiền nhỏ bằng chày cối sứ và nạp toàn bộ lên cột có kích thước khác nhau (20 – 80 cm, đường kính 1 – 5 cm, tùy thuộc đối tượng mẫu và chất cần tách) đã được nhồi trước các hạt silicagel (chiếm 1/3 – 2/3 chiều cao cột tùy thuộc vào đối tƣợng mẫu và chất cần tách). Tiếp theo,
29
cho dung môi qua cột (dung môi thích hợp đã lựa chon từ khảo sát trong phương pháp TLC ở trên) với tổng thể tích dung môi 200 mL – 2000 mL với tốc độ chảy tự nhiên ở áp suất thường, sẽ thu được các phân đoạn khác nhau, mỗi phân đoạn 50 mL.
(iv) Tinh chế tiếp tục để thu được chất tinh khiết:
Lựa chọn một hoặc một vài phân đoạn chứa chất quan tâm (thu đƣợc từ sắc ký cột) để lặp lại tiến trình theo phương pháp TLC, rồi sắc ký cột theo cách tương tự nhƣ trên để sao cho thu đƣợc chất tính khiết cỡ 95 % (độ tinh khiết của chất đƣợc xác định qua dữ phân tích dữ liệu phổ NMR, kết hợp với sắc đồ HPLC của nó).
Nơi thực hiện: Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm – Trường Đại học Vinh 2.4.3. Phương pháp xác định cấu trúc và đặc trưng hóa - lý của HCTN
- Phương pháp phân tích cấu trúc: Các chất tính khiết thu đƣợc ở trên đƣợc đem phân tích cấu trúc bằng các phương pháp được dùng phổ biến như phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), nhằm khẳng định chắc chắn về cấu trúc của hợp chất tinh chế đƣợc.
Điều kiện ghi phổ NMR: Hòa tan mẫu chứa chất tinh khiết (độ tinh khiết cỡ 95
%) vào dung môi CD3OD và đem đo phổ 1H-NMR ở bước sóng 400 và 500 MHz, đo phổ 13C-NMR ở bước sóng 100 và 125 MHz.
Nơi thực hiện: Phòng NMR - Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phương pháp xác định đặc trưng hấp thụ phân tử: Áp dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis để xác định đặc trƣng hấp thụ phân tử của chất tinh khiết thu đƣợc ở trên: Quét phổ của dung dịch chất tinh khiết (đƣợc hòa trong MeOH) trong khoảng bước sóng 190 nm – 900 nm và xác định bước sóng hấp thụ cực đại.
Nơi thực hiện: Trung tâm Thực hành – Thí nghiệm – Trường Đại học Vinh 2.4.4. Phương pháp tinh chế HCTN để tạo ra chất chuẩn
Theo yêu cầu của AOAC và Dƣợc điển Việt Nam, một chất đƣợc xem là chất chuẩn (hay chất đối chiếu) phải thỏa mãn các yêu cầu sau: Độ tinh khiết trên 95 %;
Chất phải bền với ánh sáng và nhiệt độ phòng, và có thể lưu giữ được trong thời gian tối thiểu 1 – 3 năm [1], [4], [3], [58].
30
Phương pháp tinh chế: Để thu đƣợc chất tinh khiết thỏa mãn yêu cầu của một chất chuẩn, tiến hành tinh chế chất có độ tinh khiết cỡ 95 % thu đƣợc ở trên bằng 2 phương pháp khác nhau:
- Phương pháp sắc kí cột: Tiến hành tương tự như giai đoạn chiết tách/phân lập, nhưng ở đay thay đổi kiểu pha tĩnh và kỹ thuật sắc ký: Trước hết, thực hiện sắc kí hấp phụ pha thuận với pha tĩnh silicagel, tiếp theo thực hiện sắc kí phân bố pha đảo với pha tĩnh C18 hoặc sắc kí thấm gel với pha tĩnh Sephadex LH-20.
- Phương pháp HPLC điều chế: Sử dụng phương pháp HPLC với dung môi, tỷ lệ dung môi và tốc độ dòng pha động thích hợp.
2.4.5. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn và dữ liệu chất chuẩn Để khẳng định hợp chất tinh khiết thu đƣợc đạt yêu cầu của một chất chuẩn, cần kiểm tra độ tinh khiết của nó bằng các phương pháp sau:
- Sắc kí lớp mỏng (TLC): Một chất đƣợc coi là tinh khiết khi trên bản mỏng silicgel chỉ có mặt một vết duy nhất của chất và không có các vết phụ hoặc các vết phụ không đáng kể [5], [5].
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC): Từ sắc đồ HPLC thu đƣợc, xác định tỷ lệ phần trăm diện tích pic của chất tinh khiết với tổng diện tích tất cả các pic. Tỷ lệ này đƣợc tính toán tự động trên hệ thiết bị và phải đạt trên 95 % [3], [48], [92].
Khi đã khẳng rằng, chất tính khiết thu đƣợc là chất chuẩn, cần thiết lập các dữ liệu kèm theo của một chất chuẩn và so sánh chúng với dữ liệu chất chuẩn đã công bố trước đây [3], bao gồm:
- Dữ liệu phổ H1-NMR, phổ C13-NMR;
- Dữ liệu phổ UV-Vis, phổ MS.
- Ngoài ra, cần có thêm thông tin về đặc trƣng hóa – lý khác nhƣ: Điểm chảy, điểm sôi, góc quay phân cực…
2.4.6. Phương pháp phân tích các HCTN
Trong nghiên cứu luận án, các phương pháp phân tích sau đây được sử dụng để phân tích các HCTN trong các mẫu nghiên cứu. Chất chuẩn cho phân tích định tính và định lƣợng là các chất chuẩn thu đƣợc ở trên.
- Phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD: Hai phương pháp này được áp
31
dụng để phân tích đồng thời các chất hợp chất phân lập đƣợc: Hợp chất phyllanthin, hypophyllanthin phần lập từ cây Diệp hạ châu; Hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA phân lập từ cây Đan sâm và hợp chất eurycomanone phân lập từ cây Mật nhân. Song, trước khi phân tích, cần khảo sát để tìm đƣợc các điều kiện thí nghiệm thích hợp về thành phần pha động (hay dung môi rửa giải), tốc độ dòng pha động, áp suất và nhiệt độ cột. Các điều kiện thích hợp của detector MS/MS đƣợc chọn tự động nhờ phần mềm cài đặt sẵn trong máy. Điều kiện thích hợp của detector DAD là bước sóng mà ở đó độ hấp thụ quang của các chất phân tích đủ lớn. Từ các sắc đồ thu đƣợc, tiến hành định tính dựa vào thời gian lưu (so sánh với thời gian lưu trên sắc đồ của chất chuẩn), định lượng theo phương pháp đường chuẩn.
- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân định lượng (qNMR) và phương pháp HPLC-PDA/MALD-TOF-MS: Trước hết, áp dụng phương pháp qNMR để xác định các phân đoạn giàu nhóm hợp chất acetogenin trong mẫu (mẫu ở đây là các phân đoạn chiết tách từ cây Mãng cầu xiêm bằng các dung môi khác - mẫu AMF1, AMF2, AMF3, AMF4); Tiếp theo, chọn mẫu giàu acetogenin đem phân tích bằng phương pháp HPLC-PDA/MALD-TOF-MS, trong đó, PDA cho phép nhận biết các pic xuất hiện ở những thời gian lưu nào (mỗi pic chứa một nhóm các chất), tiếp theo các nhóm chất ứng với các pic đó đƣợc đƣa qua MALD-TOF-MS để định tính các chất có mặt trong mỗi nhóm. Song, trước khi phân tích, cần khảo sát để tìm các điều kiện sắc ký thích hợp nhƣ thành phần và tốc độ dòng pha động, áp suất và nhiệt độ cột. Từ dữ liệu phổ MS thu đƣợc, tiến hành phân tích định tính (dựa vào mảnh đặc trưng, thường là mảnh phân tử); định lượng bằng phương pháp đường thêm chuẩn.
- Phương pháp GC-MS: Phương pháp này được áp dụng để phân tích các hợp chất trong các mẫu tinh dầu chiết tách từ các bộ phận khác nhau của cây Riềng đuôi nhọn (RDN-La, RDN-Than, RDN-Re, RDN-Hoa, RDN-Qua). Từ dữ liệu phổ MS, tiến hành định tính dựa vào mảnh đặc trƣng và bán định lƣợng dựa vào tỷ lệ phần trăm diện tích pic của chất so với tổng diện tích tất cả các pic.
- Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu – phương pháp khối lượng [4] : Hàm lƣợng tinh dầu X (%) (tính theo khối lƣợng khô) trong các bộ phận khác