Để phân tích cấu trúc các HCTN nói riêng và các hợp chất hữu cơ nói chung, người thường sử dụng các phương pháp phổ khác nhau như quan phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại (IR), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)...
Dưới đây sẽ giới thiệu sơ lược về các phương pháp GC, LC.
1.2.1. Phương pháp sắc ký khí
Trong thảo dƣợc cũng tồn tại nhiều thành phần, trong đó có thành phần rất dễ bay hơi. Các thành phần rất dễ bay hơi này có những đặc tính riêng biệt của từng loài thảo dƣợc, chính những tính riêng biệt này tạo ƣu thế cho việc xây dựng sắc ký dấu vân tay của các thảo dược theo phương pháp sắc ký khí. Phân tích bằng GC thu đƣợc sự chính xác và độ nhạy cao cho các thành phần hóa học dễ bay hơi. Tuy nhiên, phương pháp phân tích này cũng gặp khó khăn khi các mẫu thảo dược ở dạng phân cực và không phải là thành phần dễ bay hơi.
Trong phương pháp sắc ký khí ghép nối detector khối phổ (GC-MS), mẫu đƣợc tiêm vào cổng bơm của thiết bị GC, đƣợc làm bay hơi, và đƣợc tách trong cột GC, sau đó đƣợc phân tích bởi detector MS và ghi phổ. Thời gian từ lúc tiêm mẫu và rửa giải ra khỏi cột được gọi là thời gian lưu (tR). Các thiết bị sử dụng cho GC- MS thông thường bao gồm một cổng tiêm ở một đầu của một cột kim loại (thường đƣợc đóng gói với một loại vật liệu nhƣ silicagel để thúc đẩy quá trình tách tối đa) và một máy dò (MS) ở đầu kia của cột. Một khí mang (có thể là argon, heli, nitơ, hydro, hay một vài khí khác) đẩy mẫu xuống cột. Trong lúc GC phân tách các hợp chất trong hỗn hợp, các detector MS cung cấp thông tin hỗ trợ trong việc xác định cấu trúc của mỗi hợp chất. Các cột sử dụng trong GC-MS có thể là hai loại sau: cột
12 mao quản và cột nhồi [25].
Các bộ ghép nối hay đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong GC-MS là các kiểu ion hóa va chạm electron (EI) và ion hóa hoá học (CI). Tuy nhiên, trong hệ thống GC- MS hiện đại, có thể sử dụng nhiều kiểu khác nhau để phát hiện các ion phân tử. Ví dụ, khối phổ TOF kết hợp trục giao với GC đƣợc sử dụng để xác định độ tinh khiết và nhận danh các hợp phần bằng cách đo và tính toán chính xác khối lƣợng của các thành phần nguyên tố. Ngày nay, một máy GC-MS đƣợc tích hợp trực tuyến với cơ sở dữ liệu MS khác nhau của một số hợp chất tham khảo để tìm kiếm các phổ phù hợp cho các hợp chất tách đƣợc [25], [38]. Hệ khối phổ là hệ có độ nhạy cao, đƣợc sử dụng để phân tích khối lƣợng. Thông tin mang lại là khối lƣợng phân tử cũng nhƣ các thông tin có liên quan đến cấu trúc của phân tử. GC-MS, đó là một kỹ thuật ghép nối phát triển từ việc kết hợp kỹ thuật GC và MS, là loại hình ghép nối đầu tiên trở nên hữu ích cho mục đích nghiên cứu và phát triển. GC-MS đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc phân tích tinh dầu có mặt trong thảo dƣợc. Với GC-MS người ta biết được những thông tin liên quan đến định tính và định lượng các thành phần có mặt trên bản sắc ký, những thông tin này rất hữu ích trong các nghiên cứu đánh giá mối tương quan giữa thành phần hóa học và hoạt tính của thảo dược [38], [104]. Với MS, phương pháp phát hiện hay được sử dụng là quang phổ khối lượng bẫy ion, tứ cực (một hoặc ba tứ cực) và thời gian bay (TOF) là những công cụ đƣợc dùng thường xuyên nhất, ngày nay cả LC-MS và GC-MS cũng là các kỹ thuật ghép nối đƣợc sử dụng phổ biến nhất [111]. Khối phổ thu đƣợc bằng kỹ thuật ghép nối này cung cấp thông tin về cấu trúc dựa trên việc giải thích của các phân mảnh. Độ phong phú tương đối của các mảnh ion có thể được so sánh với thư viện phổ. Các hợp chất rất dễ bay hơi, kích thước nhỏ, và bền vững ở nhiệt độ cao trong điều kiện GC có thể dễ dàng phân tích bằng GC-MS. Đôi khi, một số hợp chất phân cực mà đặc biệt khi chúng có chứa nhóm hydroxyl thì cần phải đƣợc dẫn xuất hoá để phân tích GC-MS. Kỹ thuật dẫn xuất phổ biến nhất là sự chuyển hóa chất phân tích thành dẫn xuất trimetylsilyl của nó [38].
1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một công cụ phân tích hiện
13
đại, đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu các HCTN hiện nay. Lợi thế của việc sử dụng công cụ HPLC trong việc phân tích các thảo dƣợc bởi vì các thiết bị này rất dễ sử dụng và không bị hạn chế bởi các thành phần bay hơi hay không bay hơi cũng nhƣ độ bền, độ phân cực của mẫu nghiên cứu. Thông thường hệ HPLC thường được sử dụng để phân tích hầu hết các hợp chất có mặt trong thảo dƣợc. Các hợp chất có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector UV- Vis hoặc detector hấp thụ huỳnh quang Fluorescene detector, đối với các hợp chất không có khả năng hấp thụ quang thì sử dụng detector tán xạ ánh sáng ELSD (Evaporative Light Scattering Detector) [91], [111]. Sự phát triển của kỹ thuật ghép nối LC với các detector khác nhau đã giúp nâng cao hiệu quả tách và phân tích và do vậy, trong 20 năm qua đã ra đời các hệ thống thiết bị hiện đại nhƣ LC/UV, LC/UV- DAD, LC/MS và gần đây là LC/NMR. Với các hệ thiết bị đó, không chỉ thuận lợi trong phân tích (định tính, định lƣợng) các HCTN, mà còn cho phép phân tích cấu trúc và nhận dạng chất, đồng thời lưu trữ dữ liệu phổ của các hợp chất mới để ngày càng bổ sung vào thƣ viện phổ của các HCTN trong các phần mềm đi kèm các hệ thiết bị đó. Mặt khác, các hệ thiết bị đó còn hỗ trợ thuận lợi việc nghiên cứu và phân tích các loại mẫu phức tạp nhƣ các mẫu thực vật thô, các hợp phần tách chiết từ các mẫu thực vật... (các mẫu phức tạp đó có thể chứa đến hàng trăm thành phần khác nhau) [72], [73], [74].
Để tiến hành phân tích, trước hết mẫu được ly trích bằng một dung môi hữu cơ và đƣợc làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn (nếu cần). Sau đó, dịch chiết đƣợc làm sạch và đƣợc hòa tan trong dịch pha động tiêm vào hệ thống HPLC với các detector UV, PDA, FLD hoặc MS, MS/MS. Detector huỳnh quang (FLD) – một trong những detector có độ nhạy cao – cũng thường được sử dụng, song trước khi qua detetor FLD, chất phải đƣợc dẫn qua cột DA (để nó phản ứng với một chất chọn lọc, tạo dẫn xuất huỳnh quang). Nguyên lý tách trong phương pháp LC nói chung và HPLC nói riêng là dựa vào ái lực của các cấu tử với 2 pha (khi dòng mẫu đi qua cột tách) - pha tĩnh (có thể là dạng pha đảo hoặc pha thuận), thường là pha rắn và pha động (lỏng) và do vậy, mỗi cấu tử sẽ đƣợc rửa giải ra khỏi cột ở các thời gian khác nhau (được gọi là thời gian lưu) theo một trình tự xác định. Cấu tử ra khỏi cột
14
đƣợc đƣa vào detector UV, PDA/DAD (Photo Diot Array detecter) hoặc detector khối phổ MS/MS. Với detector UV hay DAD, cấu tử đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ quang của nó ở một bước sóng lựa chọn xác định. Khi sử dụng detector MS, trước hết cấu tử (sau khi ra khỏi cột tách) được ion hóa (trong nguồn ion hóa) tạo thành các ―mảnh‖ (fragment) khác nhau và tiếp theo, chúng đƣợc tách ra khỏi nhau (trong bộ phận phân tích khối lƣợng) dựa vào thông số m/z. Phổ khối lƣợng của tất cả các mảnh đƣợc ghi bởi detector MS và từ đó, cho phép phân tích định tính và định lƣợng một cách thuận lợi và chính xác. Hiện nay, GC-MS, GC-MS/MS và HPLC-MS, HPLC-MS/MS được xem là những phương pháp phân tích hiệu quả và đạt đƣợc độ nhạy cao nhất trong lĩnh vực phân tích hữu cơ [47]. Mặt khác, để cải thiện độ nhạy và khả năng phân tách các mảnh một cách chính xác, người ta còn sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau nhƣ ES (phun mù electron), APCI (ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển), TSP (nhiệt phun), CFFAB (dòng bắn phá nguyên tử nhanh liên tục... và kỹ thuật phân tách khối lƣợng khác nhau nhƣ hệ tứ cực (Quardrupole / Q), bẫy ion (CNTT), thời gian bay (TOF)... [72].
Phổ LC/MS/MS đƣợc sử dụng cơ sở dữ liệu MS/MS của sản phẩm tự nhiên có thể đƣợc xem xét cho sàng lọc nhanh. Nhƣ vậy, LC/MS có thể là một kỹ thuật cực kỳ mạnh mẽ để sàng lọc chiết xuất thực vật thô, nhƣng các điều kiện ion hoá phải đƣợc tối ƣu hóa cẩn thận [47]. Việc sử dụng LC-MS-MS ngày càng gia tăng. Kỹ thuật ghép nối giữa HPLC với UV và khối phổ (LC-UV-MS) đã mang lại nhiều thuận lợi khi kết hợp với sàng lọc sinh học để tăng nhanh tốc độ điều tra các sản phẩm thiên nhiên.
Trong số các kỹ thuật quang phổ có sẵn cho đến nay, có lẽ NMR có độ nhạy kém nhất, nhƣng nó cung cấp thông tin cấu trúc hiệu quả nhất cho việc làm sáng tỏ cấu trúc của hợp chất thiên nhiên. Sự phát triển của kỹ thuật cho phép ghép nối trực tiếp giữa các hệ thống HPLC với NMR, dẫn đến làm phát sinh các kỹ thuật thực nghiệm mới HPLC-NMR hoặc LC-NMR, các kỹ thuật này đã từng đƣợc phát triển rộng rãi hơn 15 năm qua. Kỹ thuật HPLC-NMR đầu tiên sử dụng nam châm siêu dẫn đã đƣợc báo cáo trong những năm đầu thập niên 1980. Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật ghép nối này trong các phòng thí nghiệm phân tích chỉ bắt đầu vào cuối
15
những năm 1990. LC-NMR hứa hẹn mang lại giá trị to lớn trong việc phân tích các hỗn hợp phức tạp của tất cả các loại hợp chất, đặc biệt là phân tích hợp chất thiên nhiên và các chất chuyển hóa có liên quan đến chất làm thuốc trong dung dịch sinh học. Kỹ thuật LC- NMR có thể đƣợc thực hiện trong cả hai chế độ dòng chảy liên tục và dòng chảy dừng. Một loạt các vấn đề phân tích sinh học có thể đƣợc giải quyết bằng cách sử dụng hệ thống 500, 600, và 800 MHz với detector 1H, 13C, 2H,
19F, và 31P.
Ngoài các thiết bị đo đạc NMR và HPLC, điều kiện tiên quyết chính cho LC- NMR trực tuyến là detector dòng chảy liên tục và cài đặt một van trước khi detector ghi phổ NMR kiểu dòng chảy liên tục hoặc dòng chảy dừng [40]. Một máy dò UV- Vis cũng đƣợc sử dụng nhƣ là một detector sơ cấp đối với hoạt động của LC. Sử dụng cường độ từ trường cao hơn 9,4 T được áp dụng, ví dụ, cộng hưởng 1H-NMR tần số 400MHz cho ghép nối HPLC-NMR chuẩn. Bộ cảm biến phân tích dòng chảy được xây dựng trước tiên để thu được NMR dòng chảy liên tục. Tuy nhiên, yêu cầu để xác định đầy đủ cấu trúc của các hợp chất chƣa biết, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên mới, đƣa đến việc ứng dụng kiểu dòng chảy dừng. Trong thực tế, những lợi ích của vòng tuần hoàn từ chu trình kín của việc tách-nhận dạng, cùng với tiềm năng của việc sử dụng tất cả các kỹ thuật NMR-2D và NMR-3D sẵn có hoàn toàn tự động, đã thúc đẩy việc áp dụng chế độ dòng chảy dừng, ví dụ, chế độ khoảng thời gian [39], [83].
Nói chung, trong hệ thống LC-NMR, thiết bị LC bao gồm bộ bơm mẫu tự động, bơm LC, cột, và một máy dò không NMR (ví dụ, UV, DAD, EC, chỉ số khúc xạ, hoặc tính phóng xạ). Từ detector này, dòng chảy đƣợc dẫn vào thiết bị ghép nối LC-NMR, có thể đƣợc trang bị với các vòng bổ sung cho bộ nhớ trung gian của các đỉnh LC đƣợc chọn. Dòng chảy từ thiết bị ghép nối LC-NMR sau đó đƣợc đƣa vào detector NMR cảm biến dòng chảy hoặc vào vùng chứa dung dịch thừa. Dòng chảy sau khi đi qua detector nó đƣợc chuyển đến bể chứa phân đoạn để thu hồi và tiếp tục khảo sát các phân đoạn khác nhau đƣợc phân tích bằng NMR. Một khối phổ kế cũng có thể đƣợc gắn vào hệ thống thông qua một thiết bị tách ở đầu ra của thiết bị ghép nối LC-NMR [40].
16
LC-NMR đại diện cho một kỹ thuật bổ sung hứa hẹn đầy tiềm năng cho kỹ thuật LC-UV-MS để phân tích chi tiết cấu trúc trực tuyến. Trên thực tế, những tiến bộ gần đây trong công nghệ NMR đã cải tiến kỹ thuật LC-NMR trở thành một công cụ phân tích mạnh mẽ. Sự phát triển của các kỹ thuật thu hồi dung môi hiệu quả cho phép đo phổ LC-1H-NMR hiệu quả cao, cả chế độ dòng chảy liên tục và dòng chảy dừng trong điều kiện HPLC pha đảo. Các dung môi không đƣợc đơteri hoá nhƣ MeOH hoặc MeCN có thể được sử dụng trong khi đó, nước được thay thể bằng D2O.
Những kết quả đạt đƣợc trong việc sử dụng LC/NMR trong những năm gần đây là rất ấn tƣợng và kỹ thuật này cung cấp vô giá thông tin trực tuyến trong phân tích chiết xuất thực vật thô [47].