3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên
3.1.1. Chiết tách các HCTN từ cây Diệp hạ châu và đặc trƣng cấu trúc
Mẫu cây Diệp hạ châu (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với methanol ở 50 0C trong 3 h (lặp lại 3 lần). Dịch chiết thu đƣợc đƣợc lọc qua màng lọc rồi tiến hành cô quay chân không áp suất thấp thu đƣợc cao chiết methanol ban đầu (502 g). Phân bố cao methanol trong nước, sau đó chiết lỏng/lỏng lần lượt với hexan, cloroform và n-butanol. Dịch chiết thu đƣợc đƣợc lọc qua màng lọc rồi tiến hành cô quay chân không áp suất thấp thu đƣợc các cao chiết lần lƣợt là 124g, 255 g và 95 g.
Tiếp theo, các phần cao chiết đó (cao hexan, cloroform và n-butanol) đƣợc tách bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao cloroform chứa nhiều chất nhất và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao cloroform đƣợc chọn để khảo sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trước khi tiến hành sắc ký cột, cần khảo sát bằng phương pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho quá trình tách tiếp.
Kết quả khảo sát bằng phương pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:
hệ hexan : acetone (v/v 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1) và hệ dung môi cloroform : metanol (v/v 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1), cho thấy, hệ dung môi cloroform : metanol là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ dung môi này đƣợc chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.
Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:
- Cao cloroform (255 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều
36
dài 100 cm, đường kính 10 cm, khối lượng silicagel 500 g) với hệ dung môi rửa giải chloroform : methanol (sử dụng chế độ gradien dung môi theo thứ tự 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v), thu dịch rửa giải vào 100 lọ. Tiến hành TLC tất cả các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân đoạn nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 10 phân đoạn chính (từ H-1 đến H-10).
- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-4 ở điều kiện: cột silica gel (dài
đường kính trong 300 mm 30 mm) với 1.500 mL pha động (hệ dung môi cloroform: metanol 10:1, 5:1 (v/v); sau đó, thực hiện sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 8:1 (v/v), thu đƣợc hợp chất, đƣợc ký hiệu là PU-1 (229 mg). Mặt khác, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-5 ở điều kiện: cột silica gel (300 mm × 30 mm) với 1000 mL pha động cloroform : metanol 9:1, 5/1 (v/v) và tiếp theo là sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (5:1 v/v, 500 mL) thu đƣợc PU-2 (312 mg). Tiến hành sắc ký cột tương tự với một số phân đoạn khác cũng đã phân lập được các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc và tinh chế 2 hợp chất PU-1 và PU-2.
Quy trình chiết tách/phân lập các HCTN từ cây Diệp hạ châu đƣợc nêu ở hình 3.1.
37
Cao butanol (95 g)
Sơ đồ 3.1: Phân lập các hợp chất từ cây Diệp hạ châu Hypophyllanthin (229 mg)
CC, Silica gel CHCl3:MeOH (10:1)
Cao dịch nước (90 g) Cao methanol (502 g)
Chiết lần lƣợt với cloroform, butanol Cao cloroform (255 g)
H-2 ( 8,6
g)
H-3 ( g)
( 8,6 g)
H-4 (15g) (g) (8,6 g)
H-5 (27,5 g) (g) (8,6 g)
H-6 ( g)
( 8,6
g) C18
CHCl3:MeOH (5:1)
CC, Silica gel, CHCl3:MeOH 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v Diệp hạ châu (5,0 kg)
Ngâm chiết với methanol (3 x 1,5 L)
H-7 (g)
(8,6
g)
H-8 (g)
(8,6 Phyllanthin (212 mg) g)
C18 CHCl3:MeOH
(4:1)
Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích
H-1 ( 8,6 g)
H-9 (g)
(8,6
g)
H-10 (g)
(8,6
g) CC, Silica gel
CHCl3:MeOH (8:1)
HPLC điều chế, MeOH:H2O (7:3)
38 3.1.1.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN
Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất PU-1 và PU- 2 là hợp chất gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của chúng. Tiến hành phân tích mẫu (hợp chất PU-1 và PU-2) bằng các phương pháp NMR, MS và UV-Vis, thu đƣợc kết quả ở bảng 3.1 và 3.2. Các đặc trƣng hóa – lý khác của 2 hợp chất đo cũng đƣợc xác định. Việc khẳng định công thức cấu tạo của chất là dựa vào đặc trƣng cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so sánh với các kết quả đã công bố trước đây. Kết quả cho thấy:
(i) Hợp chất PU-1: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 128 – 130 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 230 và 280 nm (phụ lục A5); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z 453,3 [M+Na]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C24H30O7 (phụ lục A1). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.1 và phụ lục A2-A5. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-1 là hypophyllanthin với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.1. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [52], [101], [102].
Hợp chất hypophyllanthin cũng đã đƣợc công bố là đƣợc phân lập từ cây Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria và nó có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh [7], [95], [102].
Hình 3.1. Công thức cấu tạo của hypophyllanthin
39
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của PU-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [101](*)
Thứ tự C δC* δH* δC δH
1 131,8 131,7
2 106,5 6,31 (1H, s) 106,7 δ 6,45 (1H, s)
3 142,1 141,7
4 133,3 132,8
5 147,0 146,5
6 115,1 114,5
7 33,3 2,79 (1H, dd, J = 15.9, 5.4 Hz)
2,71 (2H, dd, 15.9, 10.8 Hz)
32,7 2,78 (2H, dd, 16.0, 4.5 Hz) 2,61 (1H, dd, J = 15.5, 11.0 Hz)
8 35,9 1,94 (1H, m) 36,6 1,85 (1H, m) 9 75,5 3,41 (1H, dd, J =
9.6, 4.2 Hz)
3,36 (1H, dd, J = 9.6, 6.2 Hz)
74,7 3,18 (1H, dd, J = 9.5, 6.2 Hz)
3,27 (1H, dd, J = 9.5, 4.2 Hz)
3-OCH3 56,4 3,85 (3H, s) 56,1 3,78 (3H, s) O-CH2-O 101,1 5,63 (1H, d, J = 1.4
Hz)
5,71 (1H, d, J = 1.4 Hz)
100,6 5,69 (1H, d, J = 1.4 Hz) 5,71 (1H, d, J = 1.4 Hz)
9- OCH3 58,9 3,31 (3H, s) 58,3 3,25 (3H, s)
1’ 138,1 137,9
2’ 111,9 6,65 (1H, d, J = 2.0 Hz)
112,1 6,63 (1H, d, J = 2.0 Hz)
3’ 148,6 148,3
4’ 147,1 147,0
5’ 110,7 6,72 (1H, d, J = 8.0 Hz)
111,6 6,80 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6’ 120,4 6,62 (1H, dd, J =
8.0, 2.0 Hz)
119,9 6,65 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz)
7’ 41,9 4,07 (1H, d, J = 7.8 Hz)
41,1 3,95 (1H, d, J = 7.5 Hz) 8’ 45,4 1,87 (1H, m) 44,7 1,77 (1H, m)
9’ 71,8 3,22 (1H, dd, J = 71,6 3,16 (1H, dd, J = 9.5, 3.5
40 9.6, 3.5 Hz)
3,34 (1H, dd, J = 9.6, 1.0 Hz)
Hz)
3,29 (1H, dd, J = 9.5, 1.0 Hz)
3’-OCH3 55,8 3,78 (3H, s) 55,4 3,67 (3H, s) 4’- OCH3 55,9 3,82 (3H, s) 55,5 3,70 (3H, s) 9’- OCH3 58,9 3,29 (3H, s) 58,4 3,21 (3H, s)
(*) H, C và H*, C*: Tương ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu được từ nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [101]; Trong đó, H đƣợc đo ở 500 MHz trong dung môi DMSO; H*
đƣợc đo ở 300 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong DMSO; C* đƣợc đo ở 75,6 MHz trong CDCl3.
(ii) Hợp chất PU-2: Dạng tinh thể hình kim, màu trắng; Nhiệt độ nóng chảy 94 - 96oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 230 và 280 nm (phụ lục A10); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z
= 419 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C24H34O6 (phụ lục A6). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.2 và phụ lục A8, A9. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất PU-2 là phyllanthin với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.2. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [52], [101], [102].
Hợp chất phyllanthin cũng đã đƣợc công bố là đƣợc phân lập từ cây Phyllanthus niruri và Phyllanthus urinaria và nó có hoạt tính kháng virut viêm gan B mạnh [7], [95], [102].
Hình 3.2. Công thức cấu tạo của phyllanthin
41
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của PU-2 và so sánh với công bố ở tài liệu [101](*)
Thƣ tự C δC* [101] δH* [101] δC δH
1 133,6 133,7
2 112,2 6,59 (1H, d, J =1.8 Hz)
112,3 6,63 (1H, br s)
3 148,7 148,8
4 147,1 147,3
5 111,0 6,73 (1H, d, J = 8.1 Hz)
111,2 6,76 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6 121,0 6,61 (1H, dd, J =
8.1, 1.8 Hz)
121,3 6,65 (1H, br d, J = 8.0 Hz) 7 34,9 2,66 (1H, dd, J =
13.8, 7.5 Hz)
34,7 2,64 (1H, m) 8 40,8 2.01 (1H, m) 40,9 2,05 (1H, m) 9 72,8 3,25 (1H, dd, J =
13.8, 7.8 Hz)
72,7 3,31 (1H, m) 3-OCH3 55,9 3,78 (3H, s) 55,8 3,82 (3H, s) 4- OCH3 55,7 3,82 (3H, s) 55,7 3,87 (3H, s) (9- OCH3). 57,8 3,27 (3H, s) 58,9 3,31 (3H, s)
1’ 133,6 133,7
2’ 112,2 6,59 (1H, d, J = 1.8 Hz)
112,3 6,63 (1H, br s)
3’ 148,7 148,8
4’ 147,1 147,3
5’ 111,0 6,73 (1H, d, J = 8.1 Hz)
111,2 6,76 (1H, d, J = 8.0 Hz) 6’ 121,0 6,61 (1H, dd, J =
8.1, 1.8 Hz)
121,3 6,65 (1H, br d, J = 8.0 Hz) 7’ 34,9 2,66 (1H, dd, J =
13.8, 7.5 Hz)
34,7 2,64 (1H, m) 8’ 40,8 2,01 (1H, m) 40,9 2,05 (1H, m) 9’ 72,8 3,28 (1H, dd, J =
13.8, 5.4 Hz)
72,7 3,31 (1H, m) 3’-OCH3 55,9 3,78 (3H, s) 55,8 3,82 (3H, s) 4’- OCH3 55,7 3,82 (3H, s) 55,7 3,87 (3H, s) 9’- OCH3 57,8 3,27 (3H, s) 58,9 3,31 (3H, s)
(*) H, C và H*, C*: Tương ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu được từ
42
nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [101]; Trong đó, H đƣợc đo ở 500 MHz trong dung môi CDCl3; H* đƣợc đo ở 300 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong CDCl3; C*
đƣợc đo ở 75,6 MHz trong CDCl3
+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết cloroform từ cây Diệp hạ châu có chứa hợp chất hypophyllanthin và hợp chất phyllanthin. Tuy vậy, để thu đƣợc HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp tục tinh chế chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).