3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên
3.1.3. Chiết tách các HCTN từ cây Mật nhân và đặc trƣng cấu trúc
Mẫu rễ cây Mật nhân E. longifolia (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với dung môi ethanol 95 % (4 x 1500 mL) ở 40oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 62,5 g cao chiết tổng ethanol. Cao chiết được hòa tan trong nước cất (500 mL) và chiết phân bố lần lƣợt với EtOAc và BuOH (3 x 500 mL). Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được các phân đoạn tương ứng EtOAc (16,0 g) và BuOH (19,0 g).
Tiếp theo, các phần cao chiết đó (etyl axetat và butanol) đƣợc tách bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao etyl axetat chứa nhiều chất nhất và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao etyl axetat đƣợc chọn để khảo sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trước khi tiến hành sắc ký cột, cần khảo sát bằng phương pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho quá trình tách tiếp.
Kết quả khảo sát bằng phương pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:
hệ hexan : acetone (v/v 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1), và hệ dung môi cloroform : metanol (v/v 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1) cho thấy, hệ dung môi CHCl3:MeOH là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ dung môi này đƣợc chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.
Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:
- Cao EtOAc (16,0 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều dài 300 mm, đường kính 50 mm, khối lượng silicagel 500 g) với 2500 mL hệ dung môi
50
rửa giải CHCl3-MeOH (15:1 v/v), thu dịch rửa giải vào 70 lọ. Tiến hành TLC tất cả các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân đoạn nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 7 phân đoạn chính (từ E-1 đến E-7).
- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn E5 (2,1 g) ở điều kiện: sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 1:2 (v/v), sau đó kết tinh lại bằng MeOH thu đƣợc hợp chất, đƣợc ký hiệu là EL-1 (235 mg). Tiến hành sắc ký cột tương tự với một số phân đoạn khác cũng đã phân lập được các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc và tinh chế hợp chất EL-1.
Quy trình chiết tách/phân lập các HCTN từ cây Mật nhân đƣợc nêu ở sơ đồ 3.3.
51 Cao ethanol (62,5 g)
Chiết lần lƣợt với Ethyl acetat, Butanol
Cao ethyl acetat (16,0 g) Cao butanol (19,0 g)
E-1 (8,6 g)
Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ rễ cây Mật nhân E-2
(g) (8, 6 g)
E-3 (g) (8,6 g)
E-4 (g) (8,6 g)
E-5 (2,1 g) (g) (8,6 Eurycomanone g)
(235 mg)
(1g)
CC, C18
MeOH:H2O (2:1) CC, Silica gel, CHCl3:H2O (20:1, 15:1, 10:1, 5:1)
Hexane:EtOAc (5:1)
Rễ cây Mật nhân (2 Kg)
Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L)
Cao dịch nước (12 g)
E-6 (g)
(8,6 g)
E-7 (g)
(8,6 g)
Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%); Sử dụng làm chất chuẩn phân tích HPLC điều chế, MeOH:H2O (1:1)
52 3.1.3.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN
Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất EL-1 là hợp chất gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của nó. Tiến hành phân tích mẫu (hợp chất EL-1) bằng các phương pháp NMR, MS và UV-Vis, thu được kết quả ở bảng 3.3 và 3.4. Các đặc trƣng hóa – lý khác của 3 hợp chất đó cũng đƣợc xác định. Việc khẳng định công thức cấu tạo của chất là dựa vào đặc trƣng cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so sánh với các kết quả đã công bố trước đây. Kết quả cho thấy:
Hợp chất EL-1: Dạng bột màu trắng; [α]25D +26 (c 0,30, MeOH); Nhiệt độ nóng chảy 254 - 255 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 255 và 360 nm (phụ lục A27); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z 409,1 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C20H24O4 (phụ lục A24). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.6 và phụ lục A25, A26. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất EL-1 là eurycomanone với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.6.
Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [81].
Hình 3.6. Công thức cấu tạo của Eurycomanone
Bảng 3.6. Dữ liệu phổ NMR của EL-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [81] (*)
δC*[81] δH*[81] δC δH
1 84,8 4,53 (1H, s) 84,3 4,56 (1H, s)
2 197,9 198,8
3 126,4 6,06 (1H, brs) 125,9 6,01 (1H, s)
4 162,9 165,2
5 42,6 3,26 (1H, brd, J = 12.6 Hz) 42,8 3,02 (1H, s) 6 26,1 2,33 (1H, td, J = 2.4, 14.4 Hz)
2,03 (1H, ddd, J = 2.4, 13.3,
26,1 2,30 (1H, m) 2,10 (1H, m)
53 14.4 Hz)
7 72,1 5,26 (1H, t, J = 2.4 Hz) 71,7 4,77 (1H, s)
8 53,0 53,1
9 48,1 3,82 (1H, s) 48,0 3,95 (1H, s)
10 46,3 46,5
11 109,9 109,2
12 81,4 4,81 (1H, s) 80,8 4,92 (1H, s)
13 148,3 146,1
14 79,7 79,3
15 76,3 5,66 (1H, d, J = 1.5 Hz) 77,1 5,68 (1H, s)
16 174,3 174,5
18 22,8 22,9
19 10,7 1,80 (3H, brs) 10,1 1,98 (3H, s)
20 68,1 4,02 (1H, d, J = 8.8 Hz) 4,55 (1H, d, J = 8.8 Hz)
68,0 3,84 (1H, d, J = 9.6 Hz) 3,68 (1H, d, J = 9.6 Hz) 21 119,8 6,12 (1H, d, J = 1.5 Hz)
5,67 (1H, s)
121,5 5,50 (1H, s) 5,39 (1H, s)
H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3
+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết etyl axetat từ cây Mật nhân có chứa hợp chất eurycomanone. Tuy vậy, để thu đƣợc HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp tục tinh chế chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).