Trong hóa học phân tích, để định tính và định lƣợng, nhất thiết phải có sẵn chất chuẩn đáp ứng các yêu cầu của quốc gia hoặc quốc tế. Để điều chế các chất chuẩn, có thể sử dụng tổng hợp hóa học hoặc chiết tách chất có mặt từ các cây thuốc (hay thảo dƣợc).
Song, cho dù vậy, thách thức lớn nhất là phải tính chế sao cho thu đƣợc chất có độ tinh khiết cao để thỏa mãn làm chất chuẩn. Các chất chuẩn thường có giá thành cao, đặc biệt là các hợp chất hữu cơ và chúng chỉ đƣợc một số hãng ở các quốc gia phát triển trên thế giới sản xuất, nên các phòng thí nghiệm (PTN) khó chủ động trong phân tích. Để chủ động cho nghiên cứu về các HCTN trong điều kiện PTN ở nước ta, nghiên cứu này tập trung tinh chế sao cho thu đƣợc các chất chuẩn phyllanthin, tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA và eurycomanone có độ tính khiết thỏa mãn yêu cầu, tức là phải đạt trên 95 % [3], [23].
54
3.2.1. Chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin
Từ hợp chất PU-1 (hypophyllanthin, 229 mg) và PU-2 (phyllanthin, 312 mg) chiết tách được từ cây Diệp hạ châu ở trên, tiến hành tinh chế tiếp theo bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế để thu đƣợc chất chuẩn có độ tinh khiết > 99,0 %.
- Trình tự tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế:
+ Sử dụng hệ thiết bị sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) với pha tĩnh và đặc điểm cột tách đã nêu ở bảng 2.1; Mẫu (hợp chất PU-1) đƣợc hòa tan trong hệ dung môi MeOH-H2O 70:30 (v/v); Thể tích tiêm mẫu 100 μL; Pha động MeOH : nước 70:30 (v/v) đi qua cột trong thời gian 5 phút với tốc độ dòng 15,0 mL/phút.
+ Chạy sắc ký điều chế ở điều kiện trên lặp đi lặp lại nhiều lần và thu toàn bộ dịch rửa giải; Đem cô bay hơi dung môi trong thiết bị cô quay chân không ở áp suất thấp để thu đƣợc chất chuẩn (chất tinh khiết). Số lần chạy lặp lại đƣợc xác định là số lần sao cho thu đƣợc khối lƣợng chất lớn nhất.
- Xác định độ tính khiết của chất: Chất tinh khiết thu đƣợc ở trên đƣợc đƣa vào hệ thiết bị UPLC-DAD với các điều kiện sắc ký tương tự như đối với sắc ký điều chế ở trên.
Độ tinh khiết của chất đƣợc đánh giá qua tỷ lệ giữa diện tích pic của chất và tổng diện tích của tất cả các pic.
Kết quả cho thấy, độ tinh khiết của hypophyllanthin và phyllanthin tương ứng là 99,8% và 99,5 % và nhƣ vậy, chúng hoàn toàn thỏa mãn làm chất chuẩn (sắc đồ đối với hypophyllanthin và phyllanthin đƣợc nêu ở hình 3.7 và hình 3.8). Có thể thấy rằng, các chất chuẩn thu được có độ tinh khiết tương đương các chất chuẩn đang bán trên thị trường thế giới. Dữ liệu về độ tinh khiết được nêu ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn hypophyllanthin và phyllanthin*
Hợp chất Tạp chất 1 Tạp chất 2 Chất chính Độ tinh khiết TB (%)
tR S tR S tR S
Hypophyllanthin 7,976 1.95 9,302 2,93 6,889 2433,43 99,8 Phyllanthin 6,902 6,36 9,251 10,75 8,001 3403,76 99,5
*tR: thời gian lưu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình
55
Hình 3.7. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của hypophyllanthin:
(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)
Hình 3.8. Sắc đồ xác định độ tinh khiết của phyllanthin:
(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị) 3.2.2. Chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone, tanshinone IIA
- Mô tả: Từ phân đoạn H2 (5,3 g), kết hợp chạy sắc ký cột silica gel (30 mm × 300 mm) với hệ pha động Hex-CH2Cl2 (1:1 v/v, 1500 mL) và sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm
× 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (4:1 v/v, 500 mL) thu đƣợc tanshinon IIA (bột màu đỏ, 275 mg). Tương tự, hợp chất cryptotanshinon (bột màu đỏ cam, 245 mg) được phân lập từ phân đoạn H6 (1,5 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với pha động MeOH-H2O (3:1 v/v, 400 mL). Cuối cùng, từ phân đoạn H4 (2,7 g) bằng sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với pha động MeOH-H2O (4:1 v/v, 450 mL) kết hợp tinh chế bằng kết tinh lại trong methanol thu đƣợc tanshinon I (bột màu nâu đỏ, 231 mg). Các hợp chất này đƣợc tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0 %) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System), pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH (A) – nước (B) trong thời gian 5 phút với tỉ lệ 7:3 v/v, tốc độ dòng 20,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung môi pha mẫu: MeOH-H2O (7:3 v/v).
- Mẫu sau khi đã tinh chế được chạy UPLC-DAD: Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các píc phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ và tính độ tinh khiết. Phân tích định tính chất dựa vào thời gian lưu (so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn). Xác định
Phyllanthin
(a) (b)
(a) hypophyllanthin (b)
56
độ tinh khiết của HCTN bằng cách so sánh diện tích pic của chất với tổng diện tích pic của tất cả các chất có mặt trong mẫu (ở cùng điều kiện sắc ký hay trên cùng sắc đồ):
Độ tinh khiết của chất (%) Diện tích pic của chất * 100/tổng diện tích các pic trên sắc đồ.
Từ sắc đồ thu đƣợc, xác định đƣợc độ tính khiết của hợp chất tanshinone I là 99,8%, hợp chất cryptotanshinone 99,5 %, hợp chất tanshinone IIA là 99,6%, phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu (hình 3.9-3.11 và bảng 3.8). Các píc phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi píc chất phân tích.
Bảng 3.8. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn tanshinone I, cryptotashinone và tanshinone IIA
Hợp chất Tạp chất 1 Tạp chất 2 Chất chính Độ tinh khiết TB (%)
tR S tR S tR S
Tanshinone I 5,10 1,46 8,62 2,51 7,78 1971,19 99,8 Cryptotashinone 5,17 2,68 7,84 3,73 8,65 1275,13 99,5 Tanshinone IIA 8,69 3,81 12,79 4,66 15,19 2108,23 99,6
*tR: thời gian lưu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình
Hình 3.9. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone I:
(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)
Hình 3.10. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của cryptotanshinone:
(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)
Tanshinone I
Cryptotanshinone (a)
(a)
(b)
(b)
57
Hình 3.11. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh sạch của tanshinone IIA (a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)
Nhƣ vậy, với quá trình tinh sạch bằng sắc ký lỏng điều chế ở trên, đã tạo ra đƣợc chất chuẩn tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA.
3.2.3. Chất chuẩn eurycomanone
- Mô tả: Từ phân đoạn E5 (2,1 g), tiến hành sắc ký cột pha đảo C18 (20 mm × 400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (1:2 v/v) sau đó kết tinh lại bằng MeOH thu đƣợc eurycomanone (bột trắng, 235 mg). Hợp chất này đƣợc tinh sạch (độ tinh khiết > 99,5
%) bằng hệ thống sắc ký lỏng điều chế (Agilent 218 Purification System) pha tĩnh cột sắc ký ZORBAX SB-C18 (100 x 21,2 mm, 5,0 μm), pha động: MeOH (A) – nước (B) trong thời gian 5 phút với tỉ lệ 50:50 v/v, tốc độ dòng 15,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 100,0 μL; dung môi pha mẫu: MeOH-H2O (50:50 v/v).
- Mẫu sau khi đã tinh chế được chạy UPLC-DAD: Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các píc phụ (tạp chất) trên sắc ký đồ và tính độ tinh khiết bằng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) Agilent 1290. Phân tích định tính chất dựa vào thời gian lưu (so sánh với thời gian lưu của chất chuẩn). Xác định độ tinh khiết của HCTN bằng cách so sánh diện tích pic của chất với tổng diện tích pic của tất cả các chất có mặt trong mẫu (ở cùng điều kiện sắc ký hay trên cùng sắc đồ):
Độ tinh khiết của chất (%) Diện tích pic của chất * 100/tổng diện tích các pic trên sắc đồ.
Từ sắc đồ thu đƣợc, xác định đƣợc độ tính khiết của chất eurycomanone là 99,4%, phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu (hình 3.12 và bảng 3.9). Các píc phụ (tạp chất) đều tách rõ ràng khỏi píc chất phân tích.
Bảng 3.9. Dữ liệu đánh giá độ tinh khiết của chất chuẩn eurycomanone
Hợp chất Tạp chất 1 Tạp chất 2 Chất chính Độ tinh khiết TB (%)
tR S tR S tR S
Eurycomanone 0,97 3,51 1,22 7,59 1,46 1839,25 99,4
*tR: thời gian lưu của các chất, S: diện tích của pic, TB: giá trị trung bình
Tanshinone IIA
(a) (b)
58
Hình 3.12. Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất eurycomanone:
(a) Sắc đồ; (b) Độ tinh khiết (đƣợc xác định trên thiết bị)
Nhƣ vậy, với quá trình tinh sạch bằng sắc ký lỏng điều chế ở trên, đã tạo ra đƣợc chất chuẩn eurycomanone.