3.1. Chiết tách và xác định cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên
3.1.2. Chiết tách các HCTN từ cây Đan sâm và đặc trƣng cấu trúc
Mẫu rễ cây Đan sâm (đã đồng hóa) đƣợc ngâm chiết siêu âm có gia nhiệt với dung môi ethanol 80% 3 lần (mỗi lần 1500 mL) sử dụng thiết bị chiết siêu âm gia nhiệt ở 40oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu đƣợc đƣợc lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm cho 488 g cao chiết tổng ethanol.
Hòa tan cao chiết thu được trong nước cất (500 mL) và chiết phân bố bằng hexan, etyl axetat và butanol (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL). Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng hexan (54,4 g), etyl axetat (105,6 g) và butanol (68,8 g).
Tiếp theo, các phần cao chiết đó (hexan, etyl axetat và butanol) đƣợc tách bằng phương pháp TLC và HPLC. Kết quả cho thấy, cao hexan chứa nhiều chất nhất và các chất tách ra khỏi nhau khá tốt và do vậy, cao hexan đƣợc chọn để khảo sát quá trình tách bằng sắc ký cột tiếp theo. Song, trước khi tiến hành sắc ký cột, cần khảo sát bằng phương pháp TLC để lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho quá trình tách tiếp.
Kết quả khảo sát bằng phương pháp TLC đối với các hệ dung môi khác nhau:
hệ hexan : acetone (v/v 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 0:1), hệ dung môi cloroform : metanol (v/v 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1) và hệ dung môi hexan : etyl axetat (v/v 20:1, 10: 1, 5:1, 2:1) cho thấy, hệ dung môi hexan : etyl axetat là thích hợp, vì nó cho phép tách các chất tốt hơn. Hệ dung môi này đƣợc chọn cho giai đoạn sắc ký cột tiếp theo.
43 Tiến trình chiết tách bằng sắc ký cột:
- Cao hexan (54,4 g) đƣợc phân lập bằng sắc ký cột nhồi silicagel (chiều dài 300 mm, đường kính 50 mm, khối lượng silicagel 500 g) với 2500 mL hệ dung môi rửa giải hexan : etyl axetat (5:1 v/v), thu dịch rửa giải vào 80 lọ. Tiến hành TLC tất cả các lọ đó để nhận biết các phân đoạn có thành phần nhƣ nhau và gộp các phân đoạn nhƣ nhau lại, cuối cùng thu đƣợc 7 phân đoạn chính (từ H-1 đến H-7).
- Tiếp theo, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-2 (5,3 g) ở điều kiện: cột silica gel (dài đường kính trong 300 mm 30 mm) với 1.500 mL pha động (hệ dung môi Hexan:CH2Cl2 (1:1 v/v); sau đó, thực hiện sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 500 mL pha động MeOH:H2O 4:1 (v/v), thu đƣợc hợp chất, đƣợc ký hiệu là SM-1 (275 mg). Mặt khác, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-6 (1,5 g) ở điều kiện: cột sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 400 mL hệ pha động MeOH:H2O (4:1 v/v,) thu đƣợc SM-2 (245 mg). Cuối cùng, tiến hành sắc ký cột phân đoạn H-4 (2,7 g) ở điều kiện: cột sắc ký cột pha đảo C18 (400 mm × 20 mm) với 450 mL hệ pha động MeOH:H2O (4:1 v/v,) kết hợp tinh chế bằng kết tinh lại trong methanol thu được SM-3 (231 mg). Tiến hành sắc ký cột tương tự với một số phân đoạn khác cũng đã phân lập đƣợc các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên ở đây chỉ tập trung vào nghiên cứu đặc trƣng cấu trúc và tinh chế 3 hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3.
Tiến hành sắc ký cột tương tự với một số phân đoạn khác và cao chiết khác cũng đã phân lập đƣợc các hợp chất khác nhƣng khối lƣợng nhỏ hơn nên nghiên cứu này tập trung vào nghiên cứu làm sạch 3 hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3.
Quy trình phân lập các HCTN từ cây Đan sâm đƣợc nêu ở sơ đồ 3.2.
44
Cao ethanol (488 g)
Chiết lần lƣợt với Hexane, Ethyl acetat, Butanol Cao ethyl acetat (105,6 g) Cao butanol (68,8 g)
H-1 (8,6 g)
Sơ đồ 3.2. Phân lập các hợp chất từ rễ cây Đan sâm H-2 (5,3 g)
(g) (8,6 g)
H-3 (g) (8,6 g)
H-4 (2,7 g) (g) (8,6 g) Cao hexane (54,4 g)
H-5 (g) (8,6 g) Tanshinon IIA
(275 mg) (13mg)
(1g)
CC, C18 MeOH:H2O
(4:1)
CC, Silica gel, Hex:EtOAc (20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1 v:v)
CC, Silica gel hex:CH2Cl2
(1:1)
Rễ cây Đan sâm (2,0 Kg)
Ngâm chiết với ethanol (3 x 1,5 L)
Cao dịch nước (40 g)
H-6 (1,5 g) (g)
(8,6 g)
H-7 (g)
(8,6 g) Tanshinon I
(231 mg) (1g)
Cryptotanshinon (245 mg)
(1g)
CC, C18 MeOH:H2O
(3:1) CC, C18
MeOH:H2O (4:1)
Tinh sạch (độ tinh khiết > 99,0%), Sử dụng làm chất chuẩn phân tích hex:acetone
(5:1)
CC, Silica gel hex:EtOAc
(4:1)
HPLC điều chế MeOH:H2O (7:3)
45 3.1.2.2. Đặc trưng cấu trúc của các HCTN
Mục đích của nghiên cứu này là nhằm xác định xem – hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3 là hợp chất gì dựa trên đặc trƣng cấu trúc và phổ của chúng. Tiến hành phân tích mẫu (hợp chất SM-1, SM-2 và SM-3) bằng các phương pháp NMR, MS và UV-Vis, thu đƣợc kết quả ở bảng 3.3 và 3.4. Các đặc trƣng hóa – lý khác của 3 hợp chất đó cũng đƣợc xác định. Việc khẳng định công thức cấu tạo của chất là dựa vào đặc trƣng cấu trúc (phổ NMR), phổ MS, phổ UV và so sánh với các kết quả đã công bố trước đây. Kết quả cho thấy:
(i) Hợp chất SM-1:: Dạng bột màu đỏ; [α]25D= 90o (c 1,0, CHCl3); Nhiệt độ nóng chảy 182 – 183 oC; Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 220 và 270 nm (phụ lục A18); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z 297 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C19H20O3 (hình 3.17, phụ lục A19). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.3 và phụ lục A16, A17. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-1 là cryptotanshinone với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.3. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [27], [82].
Hình 3.3. Công thức cấu tạo của cryptotanshinone
46
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của SM-1 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82](*)
STT δC(*) δH(*) δC δH
1 29,6 3,22 (1H, t, J = 5.1 Hz) 29,7 3,40 (1H, m) 3,13 (1H, m)
2 19,0 1,80 (1H, m) 19,1 1,76 (1H, m)
1,68 (1H, m)
3 37,8 1,66 (1H, m) 37,8 2,16 (1H, m)
1,74 (1H, m)
4 34,8 34,9
5 143,6 143,7
6 132,5 7,64 (1H, d, J = 8.1 Hz) 132,6 7,75 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7 122,5 7,49 (1H, d, J = 8.1 Hz) 122,5 7,46 (1H, d, J = 7.6 Hz)
8 128,4 128,4
9 126,2 126,3
10 152,3 152,4
11 184,0 184,3
12 175,7 175,7
13 118,3 118,3
14 170,8 170,8
15 81,4 4,37 (1H, dd, J = 9.3, 6.0 Hz) 4,89 (1H, t, J = 9.6 Hz)
81,5 3,49 (1H, dd, J = 9.6, 6.4 Hz)
16 34,6 3,60 (1H, m) 34,6 4,89 (1H, J = 9.6 Hz) 4,35 (1H, dd, J = 9.2, 6.4 Hz)
17 18,8 1,36 (3H, d, J = 6.6 Hz) 18,9 1,24 (3H, d, J = 6.8 Hz)
18 31,9 1,31 (3H, s) 31,9 1,30 (3H, s)
19 31,9 1,31 (3H, s) 32,0 1,32 (3H, s)
(*) H, C và H*
, C*: Tương ứng là độ dịch chuyển hóa học (đối với H và C) thu được từ nghiên cứu này và đã đƣợc công bố ở tài liệu [27], [82]; Trong đó, H đƣợc đo ở 400 MHz trong dung môi CD3OD; H* đƣợc đo ở 500 MHz trong CDCl3; C đƣợc đo ở 100 Hz trong CD3OD; C* đƣợc đo ở 125 MHz trong CDCl3.
(ii) Hợp chất SM-2: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 202 – 204 oC;
Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 225 và 270 nm (phụ lục A22); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z = 295 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C19H18O3 (hình 3.18 và phụ lục A23).
47
Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.4. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-2 là tanshinon IIA với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.4.
Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [18], [27], [82].
Hình 3.4. Công thức cấu tạo của tanshinon IIA
Bảng 3. 4 Dữ liệu phổ NMR của SM-2 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82](*)
STT δC(*) δH(*) δC δH
1 29,9 3,19 (2H, t, J = 6.5 Hz) 29,9 3,19 (2H, t, J = 6.4 Hz)
2 19,1 1,79 (2H, m) 19,2 1,79 (2H, m)
3 37,9 1,66 (2H, m) 37,9 1,66 (2H, m)
4 34,7 34,7
5 150,1 150,2
6 133,5 7,63 (1H, d, J = 8.0 Hz) 133,5 7,63 (1H, d, J = 8.0 Hz) 7 119,9 7,55 (1H, d, J = 8.0 Hz) 120,3 7,56 (1H, d, J = 8.0 Hz)
8 127,5 127,5
9 126,5 126,5
10 144,5 144,5
11 183,7 183,7
12 176,0 175,8
13 121,2 121,2
14 161,7 161,8
15 141,3 7,22 (1H, d, J = 1.0 Hz) 141,3 7,23 (1H, d, J = 1.2 Hz)
16 120,3 120,3
17 8,8 2,26 (3H, s) 8,8 2,27 (3H, d, J = 1.2 Hz)
18 31,8 1,31 (6H, s) 31,8 1,31 (3H, s)
19 31,8 1,31 (6H, s) 31,8 1,31 (3H, s)
H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3
48
(iii) Hợp chất SM-3: Dạng bột màu đỏ; Nhiệt độ nóng chảy 232-234 oC;
Dung dịch methanol có hấp thụ cực đại trong miền UV ở bước sóng 250 nm (phụ lục A14); Mảnh phân tử trong phổ khố (ESI-MS) có m/z = 277 [M+H]+ và mảnh này phù hợp với công thức phân tử C18H12O3 (phụ lục A11). Dữ liệu phổ NMR nêu ở bảng 3.5 và phụ lục A12, A13. Các kết quả thu đƣợc cho phép khẳng định rằng, hợp chất SM-3 là tanshinon I với công thức cấu tạo đƣợc nêu ở hình 3.5. Công thức cấu tạo này cũng phù hợp với công bố ở [18], [27], [82].
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của Tanshinon I
Bảng 3.5. Dữ liệu phổ NMR của SM-3 và so sánh với công bố ở tài liệu [27], [82](*)
STT δC(*) δH(*) δC δH
1 124,8 9,26 (1H, d, J = 9.0 Hz) 124,7 9,26 (1H, d, J = 9.2 Hz) 2 130,7 7,56 (1H, dd, J = 9.0, 7.0 Hz) 130,7 7,54 (1H, dd, J = 9.2, 7.2
Hz)
3 128,4 7,36 (1H, d, J = 7.0 Hz) 128,4 7,35 (1H, d, J = 7.2 Hz)
4 135,2 135,2
5 133,7 133,7
6 133,0 8,32 (1H, d, J = 9.0 Hz) 133,0 8,31 (1H, d, J = 8.8 Hz) 7 118,8 7,83 (1H, d, J = 9.0 Hz) 118,7 7,82 (1H, d, J = 8.8 Hz)
8 129,7 129,7
9 123,3 123,2
10 132,8 132,8
11 183,6 183,6
12 175,8 175,7
13 121,8 121,8
14 161,3 161,3
15 142,1 7,31 (1H, d, J = 0.5 Hz) 142,0 7,30 (1H, br s)
16 120,6 120,5
49
17 8,8 2,30 (3H, d, J = 1.0 Hz) 8,8 2,29 (3H, d, J = 1.2 Hz)
18 19,9 2,70 (3H, s) 19,9 2,71 (3H, s)
H , H*, C , C*: Nhƣ mô tả ở bảng 3.3
+ Nhƣ vậy, có thể khẳng định phần cao chiết hexan từ cây Đan sâm có chứa hợp chất cryptotanshinone, tanshinon IIA và hợp chất tanshinon I. Tuy vậy, để thu được HCTN có độ tính khiết cao hơn, cần tiếp tục tinh chế chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng điều chế (HPLC điều chế).