3.5. Áp dụng thực tế
3.5.1. Kiểm soát chất lượng của phương pháp phân tích
- Độ lặp lại của phương pháp đối với hypophyllanthin và phyllanthin
Để kiểm tra độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, tiến hành phân tích mẫu lặp lại 3 lần, (n 3) theo quy trình nêu ở mục 3.3. Mặt khác, để so sánh với phương pháp LC- MS/MS, phương pháp UPLC-DAD cũng được áp dụng để phân tích các mẫu thuốc trên. Chi tiết về chuẩn bị mẫu cho phân tích theo các phương pháp trên được nêu ở mục 3.3. Các kết quả phân tích đƣợc tính theo nồng độ chất trong dung dịch mẫu (àg/mL).
Các kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, cả 2 phương pháp LC-MS/MS và UPLC- DAD đều đạt đƣợc độ lặp lại tốt đối với cả 2 chất trong tất cả các mẫu: Các giá trị RSD đều < ẵ RSDH [107] (cỏc kết quả chi tiết đƣợc nờu ở phụ lục C12 đến C17.
Song, cũng cần thấy rằng, phương pháp LC-MS/MS đạt được độ lặp lại tốt hơn so với phương pháp UPLC-DAD: Đối với cả hypophyllanthin và phyllanthin, phương pháp LC-MS/MS đều đạt được RSD nhỏ hơn so với phương pháp UPLC-DAD.
80
Bảng 3.13. Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích Eurycomanone(*)
Chất phõn tớch Mẫu RSD (%) / ẵ RSDH (%); n 3
LC-MS/MS UPLC-DAD
Hypophyllanthin
DHC-VX 0,02 / 3,8 1,1 / 2,0
DHC-DH 1,0 / 3,9 0,8 / 1,9
DHC-PNC 1,0 / 3,9 0,8 / 1,9
DHC-PV 0,04 / 3,4 0,7 / 1,9
DHC-DD5 0,05 / 4,3 1,7 / 2,1
DHC-KH 0,01 / 3,0 0,2 / 1,8
Phyllanthin
DHC-VX 0,02 / 3,4 2,8 / 3,4
DHC-DH 0,03 / 4,0 3,2 / 4,0
DHC-PNC 0,01 / 3,2 1,2 / 3,2
DHC-PV 0,01 / 2,8 1,0 / 2,8
DHC-DD5 1,1 / 4,1 2,6 / 4,1
DHC-KH 0,01 / 2,6 0,6 / 2,6
Eurycomanone
Vũng Tàu 0,01 / 2,6
Đăk Nông 0,01 / 3,7
Hòa Bình 0,01 / 2,9
Nghệ An 0,01 / 3,4
Bắc Giang 0,01 / 2,4
Hà Giang 0,01 / 2,9
(*) Chi tiết về các mẫu được nêu ở 2.1, 2.2; Các giá trị đứng trước/sau trong bảng tương ứng là RSD và ẵ RSDH. ĐKTN: Nhƣ nờu ở mục 3.3
- Độ lặp lại của phương pháp đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA:
Phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong mỗi mẫu bằng 2 phương pháp (LC-MS/MS và UPLC-DAD) và mỗi mẫu được phân phân tích lặp lại 3 lần (n 3). Từ đó, tính RSD của mỗi phương pháp đối với mỗi chất, thu đƣợc các kết quả ở bảng 3.14 (các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C18 đến C23. Các kết quả cũng cho thấy, cả 2 phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD
81
đều đạt đƣợc độ lặp lại tốt đối với cả 3 chất trong tất cả các mẫu: Các giá trị RSD đều
< ẵ RSDH. Mặt khỏc, phương phỏp LC-MS/MS đạt được độ lại rất tốt (đối với cả 3 chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA), tốt hơn so với phương pháp UPLC-DAD, do nó có RSD nhỏ hơn đáng kể (đối với tất cả các mẫu).
Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ lặp lại của các PP LC-MS/MS và UPLC-DAD
Chất phõn tớch Mẫu RSD (%) / ẵ RSDH (%); n 3
LC-MS/MS UPLC-DAD
Tanshinone I
Sapa 0,01 / 2,5 0,5 / 2,5
Lâm Đồng 0,01 / 2,3 0,2 / 2,3
Hà Giang 0,01 / 2,3 0,4 / 2,3
Mộc Châu 0,01 / 2,4 1,1 / 2,4
Quảng Tây 0,01 / 2,6 1,3 / 2,6
Mường Lống 0,01 / 2,7 1,2 / 2,7
Tanshinone IIA
Sapa 0,01 / 2,0 0,3 / 2,0
Lâm Đồng 0,01 / 2,0 0,3 / 2,0
Hà Giang 0,01 / 1,9 0,5 / 1,9
Mộc Châu 0,01 / 2,1 0,6 / 2,1
Quảng Tây 0,11 / 2,2 0,6 / 2,2
Mường Lống 0,01 / 2,3 0,8 / 2,3
Cryptotanshinone
Sapa 0,01 / 2,2 0,4 / 2,2
Lâm Đồng 0,01 /2,1 0,2 / 2,1
Hà Giang 0,01/ 2,2 0,5 / 2,2
Mộc Châu 0,01 / 2,3 0,5 / 2,3
Quảng Tây 0,01 / 2,4 0,4 / 2,4
Mường Lống 0,01 / 2,3 0,8 / 2,3
(*) Chi tiết về các mẫu được nêu ở bảng 2.2; Các giá trị đứng trước/sau trong bảng tương ứng là RSD và ẵ RSDH. ĐKTN: Nhƣ nờu ở mục 3.3.
- Độ lặp lại của phương pháp đối với eurycomanone:
Theo cách tương tự như đối với phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin, và phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA ở trên, độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS khi phân tích eurycomanone
82
trong cỏc mẫu cũng đƣợc đỏnh giỏ qua RSD (n 3) và so sỏnh với ẵ RSDH.
Các kết quả cho thấy, phương pháp LC-MS/MS đạt được độ lặp tốt khi phân tớch eurycomanone trong tất cả cỏc mẫu: Cỏc giỏ trị RSD đều < ẵ RSDH (bảng 3.13;
các kết quả chi tiết được nêu ở phụ lục C24. Đối với tất cả các mẫu, phương pháp LC-MS/MS đều đạt đƣợc độ lại rất tốt đối với eurycomanone với RSD 0,01 % (n 3).
3.5.1.2. Độ đúng
Các kết quả kiểm tra độ lặp lại ở trên cho thấy, phương pháp LC-MS/MS đạt đƣợc độ lặp lại rất tốt và do vậy, ở đây chỉ kiểm tra độ đúng của nó, mà không kiểm tra độ lặp lại của phương pháp UPLC-DAD.
- Độ đúng của phương pháp phân tích hypophyllanthin và phyllanthin:
Độ đúng đƣợc đánh giá qua độ thu hồi (Rev) khi phân tích mẫu thực tế đƣợc thêm chuẩn. Tiến hành kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS ở 3 mức thêm chuẩn vào mẫu thực tế: Mức 1, mức 2 và mức 3 – ứng với 3 mức nồng độ chất thờm chuẩn vào mẫu thưc tế - cỡ ẵ, tương đương và gấp đụi so với nồng độ chất trong mẫu thực tế. Ở mỗi mức thêm chuẩn, tiến hành phân tích lặp lại 3 lần, rồi tính độ thu hồi (Rev) trung bình đối với cả 3 mức. Các kết quả ở bảng 3.15 cho thấy (các kết quả chi tiết được nêu ở phụ lục C27 và C28), phương pháp LC-MS/MS đạt được độ đúng tốt đối với cả hypophyllanthin và phyllanthin trong tất cả các mẫu với Rev trung bình 95 – 103 %. Các độ thu hồi đó hoàn toàn thỏa mãn yêu cầu của AOAC về độ đúng của một phương pháp phân tích [68], [88], [105].
83
Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với hypophyllanthin và phyllanthin(*)
Chất phân tích Mẫu
Rev (%)
Rev trung bình (%)
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Phyllanthin
DHC-VX 97/95/96 98/98/100 99/100/100 95 - 100 DHC-DH 97/95/95 99/98/99 100/99/99 95 - 100 DHC-PNC 96/97/97 98/98/100 99/99/100 96 - 100 DHC-PV 95/101/99 98/101/100 99/99/100 95 - 101 DHC-DD5 97/102/96 99/99/100 99/100/100 97 - 102 DHC-KH 95/97/99 99/100/100 99/99/100 95 - 100
Hypophyllanthin
DHC-VX 97/97/98 97/95/99 99/99/100 95 - 100 DHC-DH 95/99/103 98/100/99 99/101/100 95 - 103 DHC-PNC 96/96/101 100/97/99 99/99/100 96 - 101 DHC-PV 97/103/97 99/99/101 99/99/100 97 - 103 DHC-DD5 96/95/101 96/102/100 99/99/100 95 - 102 DHC-KH 94/96/101 97/101/97 99/100/99 94 - 101
Eurycomanone
Vũng Tàu 97/99/100 99/98/101 101/100/99 97 - 101 Đắk Nông 99/97/99 99/99/100 100/99/100 97 - 100 Hòa Bình 98/99/99 99/98/99 98/101/100 98 - 101 Nghệ An 97/99/101 99/98/100 100/99/102 97 - 102 Bắc Giang 99/98/99 100/99/101 99/101/99 98 - 101 Hà Giang 99/98/98 99/98/100 98/99/101 98 - 101
(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở bảng 2.1, 2.2; Các giá trị Rev trong bảng lần lƣợt là các giá trị Rev xác định lặp lại lần 1/2/3. ĐKTN: Nhƣ ở mục 3.3.
- Độ đúng của phương pháp phân tích tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA:
Theo cách tương tự trên, độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA cũng đƣợc kiểm tra bằng cách phõn tớch mẫu thực tế được thờm chuẩn – thờm 3 mức (cỡ ẵ, tương đương và gấp đôi so với nồng độ chất trong mẫu thực tế), rồi tính Rev và Rev trung bình đối với
84
cả 3 mức. Kết quả ở bảng 3.16 cho thấy (các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C29, C30, C31), phương pháp cũng đạt được độ đúng tốt đối với cả 3 chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA trong tất cả các mẫu với Rev trung bình 96 – 104 %, thỏa mãn về độ đúng của một phương pháp phân tích theo yêu cầu cảu AOAC [88], [68], [105].
Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA(*)
Chất PT Mẫu
Rev(%) Rev
trung bình
(%)
Mức 1 Mức 2 Mức 3
Tanshinone I
Sapa 100/98/103 102/98/103 103/100/97 97 - 103 Lâm Đồng 95/96/97 102/98/99 102/101/96 96 - 102 Hà Giang 96/98/97 102/100/98 98/102/97 96 - 102 Mộc Châu 96/98/97 103/101/98 99/103/102 96 - 103 Quảng Tây 98/96/96 102/100/98 98/100/101 96 - 102 Mường Lống 98/97/97 101/99/100 103/99/101 97 - 103
Cryptotanshinone
Sapa 97/100/97 102/97/100 98/102/97 97 - 102 Lâm Đồng 97/98/97 98/103/98 99/101/97 97 - 103 Hà Giang 96/103/98 99/103/99 97/101/97 96 - 103 Mộc Châu 97/103/101 98/101/103 98/96/102 97 - 103 Quảng Tây 97/99/96 103/101/98 104/101/97 96 - 104 Mường Lống 97/97/96 101/97/102 98/100/101 96 - 102
Tanshinone IIA
Sapa 98/97/98 102/97/98 100/102/100 97 - 102 Lâm Đồng 97/98/99 100/97/97 98/100/101 97 - 101 Hà Giang 98/96/99 101/97/101 101/99/102 97 - 102 Mộc Châu 98/97/98 101/97/102 99/100/102 97 - 102 Quảng Tây 96/96/97 102/98/97 99/101/102 96 - 102 Mường Lống 96/98/99 99/102/98 99/98/101 96 - 102
(*) Chi tiết về các mẫu đƣợc nêu ở bảng 2.2; Các giá trị Rev trong bảng lần lƣợt là các giá trị Rev xác định lặp lại lần 1/2/3. ĐKTN: Nhƣ ở mục 3.3.
85
- Độ đúng của phương pháp phân tích eurycomanone:
Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS đối với eurycomanone theo cách tương tự như trên cho thấy, phương pháp cũng đạt được độ đúng tốt đối với eurycomanone trong tất cả các mẫu với Rev trung bình 97 – 102
% (bảng 3.15; các các kết quả chi tiết đƣợc nêu ở phụ lục C32).
Cuối cùng, các kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp LC-MS/MS và UPLC-DAD, và kiểm tra độ đúng của phương pháp LC-MS/MS cho phép khẳng định rằng, hoàn toàn có thể áp dụng chúng để phân tích đồng thời các HCTN hoặc phân tích riêng eurycomanone trong các mẫu thực tế, bao gồm: các mẫu cây thuốc (Diệp hạ châu, Đan Sâm, Mật Nhân) và các mẫu thực phẩm chức năng đƣợc bào chế từ cây Diệp hạ châu. Mặt khác, các kết quả kiểm tra độ lặp và độ đúng cũng cho phép khẳng định – các chất chuẩn điều chế đƣợc hoàn toàn có thể sử dụng trong phân tích định tính và định lượng các HCTN quan tâm bằng phương pháp LC-MS/MS, UPLC-DAD và có thể cả cá phương pháp phân tích khác.
3.5.1.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Có nhiều cách xác định giá trị LOD và LOQ. Ở đây chúng tôi tiến hành phân tích mẫu thực ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 3-4 lần. Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền. Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của píc, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của píc tại nửa chiều cao. LOD đƣợc chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy S/N =3.
Giới hạn định lƣợng (LOQ / Limit of Quantitation) là thông số thể hiện khả năng định lượng của phương pháp phân tích. LOQ được định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất trên một đường chuẩn tin cậy và nó được tính toán từ LOD [88]:
LOQ (3 - 4) LOD
Đối với cả 2 phương pháp đó, phương pháp đường chuẩn đều được dùng để định lượng. Để xác định LOD của phương pháp LC-MS/MS đối với các chất phân tích, lựa chọn một mẫu ngẫu nhiên trong toàn bộ lô mẫu:
- Khi phân tích đồng thời hypophyllanthin và phyllanthin: Chọn mẫu DHC- VX (mẫu thực phẩm chức năng); và mẫu lá Diệp hạ châu (mẫu cây).
- Khi phân tích đồng thời tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA:
86
Chọn mẫu Đan sâm Sapa (cây Đan Sâm thu hái ở Sapa);
- Khi phân tích eurycomanone: Chọn mẫu Mật nhân Bắc Giang (cây Mật nhân thu hái ở Bắc Giang).
Các kết quả xác định LOD của phương pháp LC-MS/MS đối với 06 chất phân tích cho thấy phương pháp đạt được LOD khá thấp (hay đạt được độ nhạy cao). Từ LOD, tính toán đƣợc LOQ.
- Đối với hypophyllanthin và phyllanthin: LOD tương ứng là 0,1 và 0,15 ppb (ứng với các giá trị LOQ là 0,3 và 0,5 ppb) (bảng 3.17 và phụ lục B1, B2);
Bảng 3.17. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất hypophyllanthin, phyllanthin và eurycomanone
Hợp chất hypophyllanthin phyllanthin eurycomanone
Nồng độ (ng/mL) 0,1 0,15 0,1
S/N 5/1,3 200/50 0,32/0,09
- Đối với tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA: LOD tương ứng là 0,39, 0,4 và 0,35 ppb (ứng với các giá trị LOQ là 1,3, 1,4 và 1,2 ppb) (bảng 3.18 và phụ lục B3, B4, B5);
Bảng 3.18. Dữ liệu xác định giá trị LOD của các hợp chất tanshinone I, cryptotanshinone và tanshinone IIA
Hợp chất tanshinone I cryptotanshinone tanshinone IIA
Nồng độ (ng/mL) 0,39 0,4 0,35
S/N 95/20 95/35 90/22
- Đối với eurycomanone: LOD 0,1 ppb (ứng với LOQ 0,4 ppb) (bảng 3.17 và phụ lục B6).
Với các giá trị LOD và LOQ đó, phương pháp LC-MS/MS hoàn toàn có thể phân tích trực tiếp những hàm lƣợng/nồng độ cỡ 1 ppb trong mẫu hay nói cách khác, phương pháp cho phép phân tích những lượng vết (< ppm) chất phân tích trong các mẫu khảo sát.