Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác nhau để kiểm tra chất lượng của thuốc như phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học. Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết. Một số dược phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học. Đại cương: 1. Nguyên tắc của phương pháp sinh học: Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng hoặc các đặc tính riêng của chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm được áp dụng nhiều nhất là: - Kiểm nghiệm thuốc bằng phương pháp thử trên động vật - Kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật.
Trường Cao đẳng Y Dược Tuệ Tĩnh-Hà Nội KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC Giảng viên: Bùi Thu Phương I MỞ ĐẦU Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác để kiểm tra chất lượng thuốc phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, xác áp dụng với chất thành phần hoá học biết Một số dược phẩm có yêu cầu hiệu lực tác dụng, tính chất riêng biệt độ an tồn vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt số loại thuốc…Những tiêu chuẩn xác định phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học Mục tiêu học Nêu vai trò PP sinh học KN chất kháng sinh, TB thử nghiệm ĐL chất KS PP khuếch tán TB mục đích, nguyên tắc, PP thử vô khuẩn đếm SL VSV g(1ml) DP Biết KT làm môi trường nuôi cấy VSV nêu PP tiệt trùng Nắm đđ hình thái, tính chất ni cấy VK, vi nấm để áp dụng thử nghiệm VSV Nội dung học I Đai cương II Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật III Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử vi sinh vật Đại cương vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Thử vô khuẩn Thử giới hạn vi sinh vật Xác định hoạt lực kháng sinh phương pháp thử vi sinh vật I Đại cương Nguyên tắc phương pháp sinh học: -Phương pháp sinh học dựa nguyên tắc: -So sánh hiệu lực tác dụng đặc tính riêng chất thử với chất chuẩn tương ứng điều kiện thời gian thí nghiệm -Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm áp dụng nhiều là: Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật Kiểm nghiệm thuốc thử nghiệm vi sinh vật I Đại cương Chất chuẩn: - Chất chuẩn yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng chất thử Chất chuẩn chia làm hai loại: Chất chuẩn gốc Chất chuẩn thứ cấp Chất chuẩn phải bảo quản ống thuỷ tinh nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường nhiệt độ < 50C) điều kiện khô, tránh ánh sáng Đánh giá kết quả: - Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài phụ thuộc vào nhiều yếu tố tính chất đáp ứng sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, điều kiện thử nghiệm - Các yếu tố thường khơng ổn định Vì kết thử nghiệm sinh học phải đánh giá tốn thống kê Độ xác phép thử thể giới hạn tin cậy II Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật Nguyên tắc: - Dựa đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đưa vào thể (liều lượng theo quy định thí nghiệm) để đánh giá chất lượng chế phẩm cần thử Kiểm nghiệm thuốc phép thử động vật dựa đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đưa vào thể liều lượng theo qui định thí nghiệm để đánh giá chất lượng chế phẩm cần thử II Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật Động vật thí nghiệm: - Phải đồng đều, khiết nòi giống - Khoẻ mạnh, khơng nhiễm bệnh - Khơng có thai - Được nuôi dưỡng đầy đủ II Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật Thử in vivo in vitro: -Thử in vitro: tiến hành quan cô lập động vật, tim, tử cung, ruột, máu… -Thử in vivo: thực thể động vật sống, dựa vào kết đánh giá qua thông số để tác dụng chất lượng thuốc Liều: - Là lượng chế phẩm thử đưa vào thể động vật lần cho mục đích thí nghiệm II Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật Các thử nghiệm ĐV áp dụng KNT: - Thử độc tính bất thường - Thử chất hạ huyết áp - Thử chất gây sốt - Định lượng hormon: gonadorelin, corticotrophin,insulin, oxytocin, menotrophin - Kiểm tra tính an tồn vaccin sinh phẩm - Xác định hiệu lực vaccin antitoxin 10 Thử giới hạn vi sinh vật Chuẩn bị mẫu thử: - Rắn: hòa tan trực tiếp nghiền mịn với dung môi -Lỏng (dung dịch thực, nhũ dịch nước, chất rắn hòa tan dễ dàng nước ): dùng đệm phosphat pH 7,2 dung dịch natri % để hịa lỗng -Lỏng khơng hòa lẫn nước (dầu, kem, sáp): thêm chất nhũ hóa, khuấy trộn học làm nóng nhẹ 45 °C → tạo nhũ dịch -Dạng khí dung - lỏng: Làm lạnh bình để khí hóa lỏng,mở nắp lấy lượng thích hợp để thử clorid 0,9 Thử giới hạn vi sinh vật Kiểm tra chất ức chế: - Nuôi cấy VSV thị 18 - 24 (vi khuẩn) 24 - 48 (vi nấm) → nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ ml Cách tiến hành: Đĩa thử : Cho 1ml chất thử nồng độ thích hợp Đĩa thử : ml chất thử + 1ml nhũ dịch VSV Đĩa chứng: 1ml nước cất vô trùng + 1ml nhũ dịch VSV - Cho vào đĩa 15 - 20 ml môi trường nguội 45 oC - Ủ 30-35oC/24-48 (vi khuẩn) 25-28oC/48-72 (vi nấm) Thử giới hạn vi sinh vật Kiểm tra chất ức chế: Nhận xét kết quả: - Đếm số khuẩn lạc VSV đĩa thí nghiệm Gọi A số khuẩn lạc đĩa Gọi B số khuẩn lạc đĩa Gọi Clà số khuẩn lạc đĩa chứng • Nếu B ≈ A + C→ mẫu thử khơng có chất ức chế • Nếu B ≈ A B