Luận văn Thạc sĩ Vật lý: Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử

Để nghiên cứu các thông số động học protein tế bào, phương pháp theo dõi đơn hạt hay đơn phân tử là ứng viên sáng giá cho lựa chọn này. Vì vậy trong luận văn này tác giả tập trung thực hiện: Nghiên cứu động học các phân tử protein trong tế bào sống bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ Thái Nguyên, năm 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ Chuyên ngành: Quang học Mã số: 8440110 LUẬN VĂN THẠC SĨ VẬT LÝ Cán hướng dẫn khoa học: TS VŨ XUÂN HÒA Thái Nguyên, năm 2018 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo, TS Vũ Xuân Hòa trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám hiệu Trường THPT Chuyên Hưng Yên, nơi công tác, tới Ban lãnh đạo trường Đại học khoa học thuộc Đại học Thái Nguyên tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho q trình học tập Cuối ,tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, người ln bên tơi, động viên khích lệ tơi trình thực đề tài nghiên cứu Mặc dù em cố gắng để hoàn thành đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót định Em mong đánh giá, nhận xét đóng góp ý kiến thầy giáo bạn để đề tài hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2018 Học viên NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG………………………………………………………………… DANH MỤC HÌNH………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT…………………………………………… CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Phân tử Poly-glycoprotein 1.2 Chuyển động dịch chuyển ngẫu nhiên (Brownian) 1.3.Kính hiển vi quang học[7] 1.3.1.Khái niệm kính hiển vi quang học 1.3.2 Cấu tạo chung kính hiển vi quang học 1.3.3 Nguyên lý hoạt động chung kính hiển vi quang học 1.3.3.1 Nguyên tắc phóng đại ảnh kính hiển vi 1.3.3.2.Khẩu độ số 12 1.4.2.3 Độ phóng đại 13 1.3.3.4.Độ phân giải 14 1.3.4 Một số loại kính hiển vi quang học 16 1.3.4.1 Kính hiển vi tương phản pha (Phase Contrast Microscopy[9] 16 1.3.4.2 Kính hiển vi huỳnh quang(Fluorescence microcope[10] 17 1.3.4.3 Kính hiển vi phản xạ nội tồn phần (total internal reflection microcope - TIRM ) 20 CHƯƠNG II .22 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ .22 2.1 Chuẩn bị mẫu 22 2.1.1 Nuôi cấy tế bào P-glycoprotein 22 2.1.2 Tổng hợp P-glycoprotein màng tế bào 23 2.2 Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần 24 2.3 Phương pháp theo dõi đơn phân tử P-glycoprotein tế bào MDCKII 24 2.3.1 Cách tiến cận 25 2.3.2 Quy trình theo dõi phân tử chất lỏng 25 2.3.2.1 Ghi video kính hiển huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (TIRFM) 26 2.3.2.2 Xác định vị trí PGP ảnh 27 2.3.2.3 Theo dõi dịch chuyển phân tử protein 27 2.3.2.4 Phân tích liệu 31 CHƯƠNG III .33 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên 3.1 Kết tổng hợp protein màng tế bào 33 3.2 Hình thái màng tế bào MDCKII 36 3.3 Đơn phân tử protein kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội tồn phần (TIRFM) 38 3.4 Các thông số động học protein PGP-GFP 39 3.4.1 Kết tế bào 40 3.4.1.1 Hệ số khuếch tán 40 3.4.1.2 Quãng đường dịch chuyển 42 3.4.1.3 Vận tốc dịch chuyển 44 3.4.2 Kết tế bào 45 3.4.3 Kết tế bào 47 KẾT LUẬN 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .51 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Liệt kê kết hợp độ phóng đại độ số vật kính thị kính cho độ phóng đại nằm khoảng giới hạn cho phép……………………………………… 13 Bảng 1.2 Sự liên quan độ phân giải với độ số độ phóng đại……… 15 Bảng 2.1.Thời gian kích thích nồng độ BS dung tổng hợp protein……… 24 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Ngun DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh phân tử P-glycoprotein màng tế bào Hình 1.2 Cấu trúc P-glycoprotein Hình 1.3 Các thành phần cấu tạo bên kính hiển vi quang học Hình 1.4.Sơđồ tạo ảnh kính hiển vi Hình 1.5 Sơđồ kính hiển vi giới hạn chiều dài ống 10 Hình 1.6 Cấu hình tia truyền kính hiển vi hiệu chỉnh vơ 10 Hình 17 Sơđồ kiểu chiếu sáng Kohler 12 Hình 1.8 Khẩu độ số vật kính 12 Hình Khẩu độ số phụ thuộc tiêu cự vật kính 13 Hình 1.10 Giới hạn phân giải 15 Hình 1.11 Sự phụ thuộc đĩa Airy vào độ số 15 Hình 1.12 16 Hình 1.13 Ảnh qua kính hiển vi trường sáng (trái) tương phản pha (phải) 17 Hình 1.14 Đường ánh sáng kính thích phát xạ qua kính lọc lập phương kính hiển vi huỳnh quang 18 Hình 1.15 Cấu tạo kính hiển vi huỳnh quang 19 Hình 1.16.Ảnh tế bào qua kính hiển vi huỳnh quang 19 Hình 1.16.1 Ngun lý phản xạ nội tồn phần 20 Hình 1.16.2 Cấu hình kính hiển vi phản xạ nội tồn phần 20 Hình 1.16.3 Kính hiển vi phản xạ nội tồn phần 21 Hình 1.17 Hình ảnh bề mặt tế bào kính hiển vi phản xạ nội tồn phần 21 Hình 2.1 Ảnh chụp số đĩa thủy tinh dung để nuôi cấy tế bào 22 Hình 2.2 Cấu hình quang học kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần [10] 24 Hình 2.3 Sơ đồ minh họa quy trình theo dõi đơn phân tử 26 Hình 2.4 Video gồm 100 ảnh tế bào MDCKII kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội tồn phần Các PGP đốm sáng ảnh 26 Hình 2.5 Mở video 27 Hình 2.6 Ảnh PGP tế bào MDCKII kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội tồn phần với thông số: radius=3, cutoff=3, percentile=0,1 28 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Hình 2.7 Ảnh PGP tế bào MDCKII kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội tồn phần với thơng số: radius=3, cutoff=3, với percentile=0,1(trái) percentile=0,4 (phải) 28 Hình 2.8 Quan sát tất quỹ đạo PGP Phần đóng khung mầu xanh phóng to đến hình bên phải để thấy rõ quỹ đạo dịch chuyển PGP 29 Hình 2.9 Thơng tin quỹ đạo xuất từ thuật tốn Mosaictrong không gian chiều 30 Hình 2.10 Các tọa độ x y tạo thành điểm ảnh khung hình (frame)cho quỹ đạo phân tử 31 Hình 2.11 Quỹ đạo chuyển động PGP theo thời gian 31 Hình Một chuỗi ảnh tế bào MDCKII chụp vị trí (chồng nhau) kính hiển vi tương phản pha huỳnh quang tương ứng với thời điểm khác 1h; 12h; 18h 23h40 cho nồng độ BS khác nhau: a) 0,1 mM; b) 0,5 mM; c) 1mM d) 2mM 35 Hình Cường độ huỳnh quang tế bào MDCKII với nồng độ BS (0,1mM; 0,5mM; 1mM 2mM) thời điểm khác 36 Hình 3 Quy trình tổng hợp protein PGP-GFP màng tế bào MDCKII 36 Hình Hình thái màng tế bào MDCKII a) Ảnh chụp kính hiển vi huỳnh quang b) ảnh kính hiển vi tương phản giao thoa tương ứng, c) ảnh chụp kính hiển vi tương phản pha d) ảnh chụp kính hiển vi trường sáng 37 Hình Hình ảnh tế bào chồng khít kính hiển vi huỳnh quang (trái) TIRFM (phải) Các hạt PGP-GFP bộc lộ chi tiết bề mặt tế bào, phần phóng to bên phải cho thấy chi tiết hơn protein 38 Hình Phân biệt phân tử protein PGP-GFP nhóm phân tử a) tín hiệu phát quang phân tử b) tín hiệu nhóm phân tử c) d) giản đồ họa cho hai loại phân tử tương ứng 39 Hình Theo dõi phân tích phân tử PGP-GFP (a) Quỹ đạo dịch chuyển (x(t), y(t)) thời gian giây (b) cường độ tương ứng khoảng thời gian (c) 40 Hình Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) đơn phân tử PGP-GFP theo thời gian 41 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Hình Hai phân bố hệ số khuếch tán tương ứng với loại phân tử: đơn phân tử PGP-GFP (màu đỏ) nhóm phân tử PGP-GFP (màu xanh) 42 Hình 10 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) nhóm phân tử PGPGFP theo thời gian Sử dụng phương trình (2.2 chương 2) để làm khớp số liệu thực nghiệm, ta thấy MSD gồm phân đoạn tương ứng với giá trị hệ số khuếch tán 𝐷1 = 0,057 ± 0,00628 𝜇𝑚2/𝑠và𝐷2 = 0,495 ± 0,0934 𝜇𝑚2/𝑠 42 Hình 11 Hai quỹ đạo chuyển động PGP-GFP tương ứng đơn phân tử (mầu đỏ) nhóm phân tử (mầu xanh) chuyển động mặt phẳng (x,y) thời gian t=1,05s 43 Hình 12 Hai phân bố dịch chuyển tương ứng với hai loại phân tử tế bào: đơn phân tử (mầu đỏ) nhóm phân tử (mầu xanh) 44 Hình 13 Phân bố vận tốc hai loại phân tử tế bào Kết vận tốc trung bình đơn phân tử 1,33 𝜇𝑚 𝑠và nhóm phân tử 1,14 𝜇𝑚/𝑠 44 Hình 14 Kết thông số động học phân tử protein tế bào thứ 2đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang màng tế bào ảnh TIRFM với nhiễu thấp a).Các phân bố động học hệ số khuếch tán quãng đường dịch chuyển thể hình b c 46 Hình 15 Kết thông số động học phân tử protein tế bào thứ xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang màng tế bào ảnh TIRFM với nhiễu thấp a).Các phân bốđộng học hệ số khuếch tán quãng đường dịch chuyển thể hình b c) d)-phân bố vận tốc 47 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Ký hiệu Tên đầy đủ PGP P-glycoprotein MDCKII Madin Darby Canine Kidney GFP Green fluorescent protein TIRFM Total internal reflection Kính hiển vi huỳnh quang fluorescence microscopy phản xạ nội toàn phần MSD Mearn square displacement Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Tên tiếng Việt Tế bào ung thư thận chó Protein phát sáng huỳnh quang Bình phương dịch chuyển trung bình Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Bên cạnh đó, nhóm phân tử GFP quan sát Nhóm phân tử GFP liên kết với nhóm phân tử PGP với nguyên tắc 1-1 (tức phân tử GFP liên kết với phân tử PGP) Để phân biệt đơn phân tử với nhóm phân tử, dựa vào cường độ phát quang thời gian sống phát quang chúng Trên hình 3.6 tín hiệu phân tử PGP-GFP (hình a) nhóm phân tử PGP-GFP (hình b) Đối với phân tử nhất, thời gian ảnh (hay thời gian sống phát quang) thường ngắn (quãng 1-2 giây) nhấp nháy sau bị dập tắt huỳnh quang nhanh Đối với nhóm phân tử protein có cường độ phát quang mạnh thời gian sống huỳnh quang lâu so với phân tử Hình 3.6 Phân biệt phân tử protein PGP-GFP nhóm phân tử a) tín hiệu phát quang phân tử b) tín hiệu nhóm phân tử c) d) giản đồ họa cho hai loại phân tử tương ứng 3.4 Các thông số động học protein PGP-GFP Hình Phân biệt phân tử protein PGP-GFP nhóm phân tử a) tín hiệu phát quang phân tử b) tín hiệu nhóm phân tử c) d) giản đồ họa cho hai loại phân tử tương ứng Trong đề tài nghiên cứu thông số động học protein số tế bào đơn lẻ MDCKII Bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử, tập hợp phân tử PGP-GFP phân tích thống kê để đánh giá quy luật phân bố protein Dưới đây, báo cáo trình bày chi tiết kết phân tích số tế bào lựa Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 39 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên chọn thông qua đại lượng: hệ số khuếch tán, quãng dịch chuyển vận tốc dịch chuyển 3.4.1 Kết tế bào 3.4.1.1 Hệ số khuếch tán Tế bào thứ lựa chọn nghiên cứu chụp ảnh kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội tồn phần (hình 3.7a) Một video gồm 100 ảnh ghi lại camera EM-CCD nhanh nhạy, từ cho phép quan sát theo dõi dễ dàng protein màng nội bào Các quan sát phân tích cho thấy rằng, màng tế bào đồng thời tồn đơn phân tử PGP-GFP nhóm phân tử PGP-GFP Hình Theo dõi phân tích phân tử PGP-GFP (a) Quỹ đạo dịch chuyển (x(t), y(t)) thời gian giây (b) cường độ tương ứng khoảng thời gian (c) Hình 3.7 cho thấy kết đơn phân tử PGP-GFP màng plasma Tín hiệu phát quang phân tử bị dập tắt sau khoảng giây Từ hình c ta thấy tín hiệu quan sát có “nhấp nháy” khoảng thời gian giây này, sau bị dập tắt hồn tồn Hình 3.7b cho thấy quãng đường dịch chuyển tối đa tương ứng khoảng 0,72μm Bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử tính tốn bình phương dịch chuyển trung bình từ thực nghiệm (〈𝑟 (𝑡)〉 = 〈𝑥 (𝑡 )〉 + 〈𝑦 (𝑡)〉) trình bày kết hợp với làm khớp số liệu từ (〈𝑟 (𝑡)〉 = 4𝐷𝜏), ta dễ dàng tính hệ số khuếch tán dịch chuyển D Từ hình 3.8 cho thấy MSD đơn phân tử Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 40 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên gồm phân đoạn ứng với giá trị hệ số khuếch tán 𝐷1 = 0,04 ± 0,00354 𝜇𝑚2 /𝑠và𝐷2 = 0,55 ± 0,238 𝜇𝑚2 /𝑠 Chúng ta nhận xét rằng, có chuyển tiếp từ khuếch tán chậm đến khuếch tán nhanh (từ D1đến D2) Điều có nghĩa là, tế bào có phân tử GFP ảnh mức thấp phân tử theo dõi bộc lộ tính chất khơng đồng mơi trường tế bào- từ mơi trường có hệ số nhớt cao đến mơi trường có hệ số nhớt thấp Hay tính không đồng lần cho chứng chuyển động phân tử từ môi trường bị giam giữ mạnh sang môi trường “tự do” màng tế bào Các kết phù hợp với số công bố trước [16] Hình 3.8 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) đơn phân tử PGPGFPtheo thời gian Sử dụng phương trình (2.2 chương 2) để làm khớp số liệu thực nghiệm, ta thấy MSD gồm phân đoạn tương ứng với giá trị hệ số khuếch tán D1 = 0.04 ± 0.00354 μm2 /svà D2 = 0.55 ± 0.238 μm2 /s Hình Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) đơn phân tử PGP-GFP theo thời gian Đối với nhóm phân tử PGP-GFP, tính chất khơng đồng môi trường khuếch tán cho kết tương tự Kết thể hình 3.9.Các giá trị hệ số khuếch tán tương ứng D1 = 0,057 ± 0,00628 μm2 /svàD2 = 0,495 ± 0,0934 μm2 /s Trong tế bào này, 42phân tử PGP-GFP phân tích, tính tốn MSD từ tính hệ số khuếch ta D cho phân tử Hình 3.10 biểu diễn biểu đồ kết phân tích thống kê hệ số khuếch tán phân tử protein tế bào MDCK II Dựa vào cường độ phát quang phân tử, ta thấy rõ ràng có hai phân bố vùng hệ số khuếch tán tương ứng với hai loại phân tử: đơn phân tử PGP-GFP nhóm phân tử PGP-GFP Hai phân bố cho kết trung bình hệ số khuếch tán tương ứng: 〈D(đơn)〉 = 0,23 μm2 /svà〈D(nhóm)〉 = 0,15 μm2 /s Nhận xét rằng, hệ số khuếch tán trung bình 42 phân tử đơn phân tử (〈D(đơn)〉 lớn nhóm phân tử 〈D(nhóm)〉 Điều có nghĩa tính chất động học đơn phân tử PGP-GFP lớn nhóm phân tử Hay nói cách khác đơn phân tử “linh động” nhóm phân tử.Điều Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 41 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên thấy trường hợp tính tốn vận tốc dịch chuyển phân tử Trong trường hợp đơn phân tử phân tử GFP mà chúng đánh dấu bề mặt PGP, hệ số khuếch tán đơn phân tử GFP thường có giá trị vài μm2 /s[17] Hình 10 Bình phương dịch chuyển trung bình (MSD) nhóm phân tử PGP-GFP theo thời gian Sử dụng phương trình (2.2 chương 2) để làm khớp số liệu thực nghiệm, ta thấy MSD gồm phân đoạn tương ứng với giá trị hệ số khuếch tán 𝐷1 = 0,057 ± 0,00628 𝜇𝑚2 /𝑠và𝐷2 = 0,495 ± 0,0934 𝜇𝑚2 /𝑠 Hình Hai phân bố hệ số khuếch tán tương ứng với loại phân tử: đơn phân tử PGP-GFP (màu đỏ) nhóm phân tử PGP-GFP (màu xanh) 3.4.1.2 Quãng đường dịch chuyển Trong nghiên cứu động lực học protein màng tế bào, dịch chuyển thông số quan trọng cần xem xét Sự dịch chuyển xác định phương trình: Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 42 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên r(t) = √x (t) + y (t) (3.1) Trong đó, x(t) y(t) tọa độ tâm protein theo trục x trục y thời điểm t Từ phân tích phần mềm ImageJ/plugin/Mosaic cho phép dễ dàng xác định tọa độ nối điểm (thơng qua ảnh) tương ứng Hình 11 Hai quỹ đạo chuyển động PGP-GFP tương ứng đơn phân tử (mầu đỏ) nhóm phân tử (mầu xanh) chuyển động mặt phẳng (x,y) thời gian t=1,05s Từ hình 3.11 cho thấy, đơn phân tử tìm thấy có trọng lượng nhẹ nhóm phân tử số lượng phân tử GFP phân tử PGP (hoặc phân tử PGP đơn) số lượng phân tử GFP nhóm phân tử PGP Thêm vào nữa, màng plasma tế bào mơi trường khơng đồng Hình 3.12 phân bố thống kê quãng đường dịch chuyển 42 phân tử tế bào phân tích kết hệ số khuếch tán phần trước Chúng ta thấy rõ hình gồm hai phân bố tương ứng với đơn phân tử nhóm phân tử PGP-GFP Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 43 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Hình 12 Hai phân bố dịch chuyển tương ứng với hai loại phân tử tế bào: đơn phân tử (mầu đỏ) nhóm phân tử (mầu xanh) 3.4.1.3 Vận tốc dịch chuyển Vận tốc đơn phân tử nhóm phân tử tínhtheo cơng thức: 𝑣(𝑡) = 𝑟(𝑡) 𝑡 = √𝑥 (𝑡)+𝑦 (𝑡) 𝑡 (3.1) Hình 13 Phân bố vận tốc hai loại phân tử tế bào Kết vận 𝜇𝑚 tốc trung bình đơn phân tử 1,33 nhóm phân tử 1,14 𝜇𝑚/𝑠 𝑠 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 44 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Từ hình 3.13 cho kết vận tốc trung bình 35 đơn phân tử 1,33𝜇𝑚/𝑠 40 nhóm phân tử 1,14 𝜇𝑚/𝑠.Các kết hoàn toàn phù hợp với phân tích hệ số khuếch tán quãng đường dịch chuyển loại phân tử phần 3.4.2 Kết tế bào Trong tế bào thứ này, phân tích tập trung vào thông số (hệ số khuếch tán, quãng đường dịch chuyển vận tốc dịch chuyển) phương pháp theo dõi đơn phân tử Ảnh tế bào chụp kính hiển vi phản xạ nội tồn phần thể hình 3.14 a Từ hình cho thấy phân tử protein tách biệt nhâu rõ ràng, điều kiện thuận lợi để phân tích phân tử riêng rẽ Trên 50 phân tử phân tích kết cho thấy hệ số khuếch tán gồm phân bố tách biệt hình 3.14b Hai phân bố trình bày gồm phân bố thứ (mầu xanh) đại diện cho nhóm phân tử PGP-GFP có giá trị trung bình 〈D(nhóm)〉 = 0,064 μm2 /s, phân bố thứ nhóm phân tử PGPGFP có 〈D(nhóm)〉 = 0,29 μm2 /s Hai giá trị trung bình hệ số khuếch tán hồn tồn phù hợp với giá trị tìm tế bào thứ Điều thể rõ phân tích quãng đường dịch chuyển vận tốc dịch chuyển loại phân tử thể hình 3.14c d Các giá trung trung bình tìm cho đại thơng số 〈r(đơn)〉 = 0,68 μm, 〈r(nhóm)〉 = 0,27 μm〈v(nhóm)〉 = 1,45 μm/s 〈v(nhóm)〉 = 0,4 μm/s Tuy nhiên, phân bố đơn phân tử (mầu đỏ) hình 3.14b c gồm vùng tách biệt rõ nét nhất.Chúng ta suy luận phân bố thứ (đỉnh 1) phân đơn phân tử GFP đánh dấu số (nhóm) phân tử PGP, phân bố thứ (đỉnh 2) đơn phân tử GFP đánh dấu phân tử PGP Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 45 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên Hình 14 Kết thông số động học phân tử protein tế bào thứ 2đã xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang màng tế bào ảnh TIRFM với nhiễu thấp a).Các phân bố động học hệ số khuếch tán quãng đường dịch chuyển thể hình b c Hoặc giả thiết khác là: loại đơn phân tử PGP-GFP chúng chuyển động từ vùng sang vùng khác màng tế bào (chuyển động từ vùng “tự do” sang vùng bị “giam giữ” mạnh mơi trường màng plasma tế bào không đồng nhất) Bằng cách làm khớp với hàm Gauss, giá trị trung bình hệ số khuếch tán tương ứng với phân bố 0,17 μm2 /svà 0,4 μm2 /svà giá trị trung bình quãng đường dịch chuyển tương ứng 0,3 μm 1,1 μm Các phân bố lần chứngminh tế bào tồn hai loại phân tử PGP-GFP môi trường màng tế bào plasma môi trường không đồng (môi trường nhớt đàn hồi) Các đơn phân tử hoạt động ngẫu nhiên nhanh (hay tự hơn) nhóm phân tử môi trường màng plasma Các phân bố chứng minh tế bào tồn hai loại phân tử PGPGFP môi trường màng tế bào plasma môi trường không đồng (môi trường nhớt đàn hồi) Các đơn phân tử hoạt động ngẫu nhiên nhanh (hay tự hơn) nhóm phân tử môi trường màng plasma Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 46 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên 3.4.3 Kết tế bào Đề tài báo cáo số liệu phân tích cho tế bào thứ 3.Các bước xử lý số liệu giống phần trình bày chương phân tích tế bào trên.Kết nhận thông số động học trình bày hình 3.15.Các giá trị trung bình hệ số khuếch tán vận tốc đơn phân tử nhóm phân tử thu 0,23μm2 /s 0,036 μm2 /s; 1,01 μm/s 0,3 μm/s Hình 15 Kết thông số động học phân tử protein tế bào thứ xử lý.Các phân tử protein PGP-GFP phát huỳnh quang màng tế bào ảnh TIRFM với nhiễu thấp a).Các phân bốđộng học hệ số khuếch tán quãng đường dịch chuyển thể hình b c) d)-phân bố vận tốc Như vậy, qua phân tích thơng kê phân tử protein PGP-GFP màng tế bào MDCKII cho thấy chúng tồn hai loại phân tử đôn phân tử nhóm phân tử.Các đơn phân tử ln hiểu có phân tử GFP đánh dấu bề mặt phân tử PGP nhóm PGP, cịn nhóm phân tử hiểu nhóm phân tử GFP đánh dấu bề mặt nhóm PGP theo nguyên tắc 1-1 (1 GFP với PGP).Tuy nhiên, từ kết phân tích làm bộc lộ tính chất khơng đồng tế bào.Điều có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu môi trường phức hợp (complex) tế bào sống.Hiểu Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 47 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên linh động đại phân tử PGP màng tế bào giúp cho nhà y-sinh học có chế vận chuyển thơng tin khả ức chế kháng thuốc của nó[18] Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 48 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên KẾT LUẬN Các cơng việc thực hiện: • Tìm hiểu nguyên lý hoạt động số loại kính hiển vi quang học (kính hiển vi tương phản pha, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi tương phản giao thoa kính hiển vi huỳnh quang phản xạ nội toàn phần để ứng dụng quan sát tế bào, tổ chức sinh học • Ni cấy tế bào tổng hợp protein PGP-GFP màng tế bào MDCKII • Đo đạc quan sát tế bào kính hiển vi quang học • Xây dựng phương pháp theo dõi đơn phân tử • Viết chương trình matlab để phân tích tính tốn phương pháp theo dõi đơn phân tử • Tính tốn thơng số động học như: hệ số khuếch tán, quãng đường dịch chuyển vận tốc dịch chuyển phân tử Các kết thu được: • Hiểu biết nguyên lý hoạt động loại kính hiển vi nêu • Tìm quy trình tối ưu để tổng hợp protein PGP-GFP màng tế bào MDCKII Tìm thời gian cần thiết tính từ lúc thêm sodium butyrate để kích thích tế bào đến lúc quan sát kính hiển vi TIRFM 18h Nồng độ sodium butyrate tối ưu cho phép làm thí nghiệm 0,5mM • Xây dựng thành công phương pháp theo dõi đơn phân tử theo thuật tốn nhóm Mosaic • Tính tốn thành công thông số động học hệ số khuếch tán, quãng đường dịch chuyển vận tốc dịch chuyển đơn phân tử nhóm phân tử PGP-GFP Qua phân tích gần 200 phân tử tế bào độc lập cho thấy tồn đồng thời loại phân tử màng tế bào Kết rằng, đơn phân tử có trọng lượng nhẹ nhóm phân tử nên chúng linh động đơn hay “tự do” màng tế bào Từ phân bố hệ số khuếch tán, quãng đường dịch chuyển vận tốc dịch chuyển làm bộc lộ tính khơng đồng mơi trường màng tế bào Khi phân tử chuyển động từ môi trường tự sang môi trường giam giữ hệ số khuếch tán bị giảm xuống đáng kể.Chính lý mà chúng ảnh hưởng đến tính chất động học protein q trình truyền thơng tin tế bào Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 49 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên • Kết nghiên cứu động học protein đóng góp quan trong việc chế kháng thuốc PGP Đây tượng phổ biến bệnh ung thư mà nhà y-sinh học đặc biệt quan tâm DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Xuan Hoa VU, Nguyen Vu Anh Tuyet, Nguyen Vu Anh Nguyet, Pham Thi Thu Ha and Emmanuel Fort, Thermal local translation remotely control with single gold nanocrescent, The 5th ASEAN conference, Da Lat City, Vietnam 4-7 October 2017 PROCEEDINGS, ISBN: 978-604-913-088-5 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 50 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Thiebaut F., Tsuruo T., Hamada H., Gottesman MM., Pastan I., Willingham MC., Cellular localisation of the multidrug resistance gene product Pglycoprotein in normal human tissues Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84, 7735-8 [2] Fromm MF.,Importance of P-glycoprotein at blood-tissue barriers, Trends Pharmacol Sci., 2004, 25, 424-9 [3] Konig J., Muller F., Fromm MF.,Transporters and drug-drug interactions: Important determinants of drug disposition and effects, Pharmacol Rev., 2013, 65, 944-66 [4] Igel S, Drescher S, Murdter T, Hofmann U, Heinkele G, Tegude H et al Increased absorption of digoxin from the human jejunum due to inhibition of intestinal transporter- mediated efflux, Clin Pharmacokinet, 2007, 46, 777-85 [5] Ho RH., Kim RB., Transporter and drug therapy: implications for drug disposition and disease Clin Pharmacol Ther 2005;78:260-77 [6] Giacomini KM, Huang SM, Tweedie DJ, Benet LZ, Brouwer KL, et al Membrane transporters in drug development Nat Rev Drug Discov 2010;9:215-36 [7] Lê Thế Thơng, Kính hiển vi quang học, Khóa luận tốt nghiệp đại học, Trường Đại học Công nghệ-ĐHQG HN, 2009 [8] Marcelina Cardoso Dos Santos, Régis Déturche, Cyrille Vézy, and Rodolphe Jaffiol, Axial nanoscale localizati on by normal ized total internal reflect ion fluorescenc e microscopy, 2014 / Vol 39, No / OPTICS LETTERS 869 [9] M Abramowitz, Contrast Methods in Microscopy: Transmitted Light Olympus America, Inc., Melville, New York, 1987, 31 pp [10] F W D Rost, Fluorescence Microscopy.Cambridge University Press, New York, 1992; vol., 256 pp.; vol.2, 456 pp [11] S H Madin and Jr Darby N B., Established kidney cell lines of normal adult bovine and ovine origin Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine Society for Experimental Biology and Medicine, 98(3) :574–576, July 1958 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 51 Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên [12] Saxton M J 2008 Single-particle tracking: connecting the dots Nat Methods 671–2 [13] Saxton M J 2014 A particle tracking meet Nat Methods 11 247–8 [14] C J Behrend et al (2004), Brownian modulated optical nanoprobes, Vol 84, No App Phy Lett [15] I F Sbalzarini and P Koumoutsakos (2005), Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology, 151(2): 182–195, J Struct Biol [16] Treanor B, Lanigan PM, Suhling K, Schreiber T, Munro I, Neil MA, Phillips D, Davis DM, French PM Imaging fluorescence lifetime heterogeneity applied to GFP-tagged MHC protein at an immunological synapse, J Microsc 2005, 217, pp 36-43 [17] Conrad W Mullineaux, Anja Nenninger, Nicola Ray and Colin Robinson Diffusion of Green Fluorescent Protein in Three Cell Environments in Escherichia Coli, J Bacteriol 2006 May; 188(10): 3442–3448 [18] H S Chan, G Haddad, P S Thorner, G DeBoer, Y P Lin, N Ondrusek, H Yeger, and V Ling, P-glycoprotein expression as a predictor of the outcome of therapy for neuroblastoma, N Engl J Med, vol 325, pp 1608-14, Dec 1991 Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt 52 Luận văn Thạc sĩ Học viên: Nguyễn Vũ Ánh Nguyệt Trường Đại học Khoa Học Thái Nguyên 53 ... phương pháp theo dõi đơn hạt hay đơn phân tử ứng viên sáng giá cho lựa chọn Vì luận văn tập trung thực hiện: nghiên cứu động học phân tử protein tế bào sống phương pháp theo dõi đơn phân tử Ngoài...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN VŨ ÁNH NGUYỆT NGHIÊN CỨU ĐỘNG HỌC CÁC PHÂN TỬ PROTEIN TRONG TẾ BÀO SỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP THEO DÕI ĐƠN PHÂN TỬ Chuyên ngành: Quang học Mã... ứng Trong đề tài nghiên cứu thông số động học protein số tế bào đơn lẻ MDCKII Bằng phương pháp theo dõi đơn phân tử, tập hợp phân tử PGP-GFP phân tích thống kê để đánh giá quy luật phân bố protein