Ứng dụng phương pháp MABC marker assisted backcrossing nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn

LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng sâu sắc, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Lưu Minh Cúc, người tận tình hướng dẫn, ủng hộ trực tiếp hướng dẫn tơi hồn thành đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học, trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy dạy dỗ, hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị em Bộ môn Sinh học phân tử, Viện Di truyền Nông nghiệp, nhiệt tình hỗ trợ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn anh chị, thầy nhóm thực đề tài “Tạo giống lúa chịu ngập chìm chịu mặn thích nghi với điều kiện nước biển dâng cho vùng đồng ven biển Việt Nam” Viện Di truyền Nơng nghiệp, người tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ vật chất tinh thần cho thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô môn Di truyền học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ cổ vũ tinh thần để tơi hồn thành đề tài Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn từ đáy lịng tới gia đình, bạn bè, người ln bên tơi, cổ vũ cho suốt thời gian qua Học viên Trần Long MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hƣởng biến đổi khí hậu đến sản xuất nơng nghiệp giới Việt Nam 1.1.1 Ảnh hưởng biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp giới 1.1.2 Ảnh hưởng biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp Việt Nam .4 1.1.2.1 Các vùng nhiễm mặn Việt Nam 1.2 Những nghiên cứu tính chống chịu mặn lúa 1.2.1 Cơ chế chống chịu mặn lúa .8 1.2.2 Cơ chế di truyền tính chống chịu mặn 10 1.2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng tính chống chịu mặn 10 1.2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử tính chống chịu mặn .11 1.2.2.3 Sự biểu gen chống chịu mặn 11 1.3 Chỉ thị phân tử 12 1.3.1 Giới thiệu chung thị phân tử .12 1.3.2 Một số thị phân tử thường dùng .13 1.3.2.1 Chỉ thị dựa sở lai ADN: Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism- Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) 13 1.3.2.2 Chỉ thị phân tử dựa nguyên tắc nhân bội ADN PCR: Chỉ thị RAPD, thị AFLP, thị STS… 14 1.3.2.3 Chỉ thị dựa sở chuỗi có trình tự lặp lại 15 1.4 Một số ứng dụng thị phân tử 17 1.4.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền 17 1.4.2 Nghiên cứu lập đồ di truyền 17 1.4.3 Trong chọn giống trồng 18 1.4.4 Chọn giống thị phân tử lai trở lại (Marker Assited Backcrossing - MABC) .20 1.5 Một số kết chọn tạo giống lúa chịu mặn .22 1.5.1 Một số kết thành tựu chọn tạo lúa chịu mặn giới 22 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn Việt Nam tình hình chọn giống lúa chịu mặn 25 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Vật liệu nghiên cứu 27 2.2 Nội dung nghiên cứu 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu .28 2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 28 2.3.1.2 Phương pháp PCR với mồi SSR 28 2.3.1.3 Phương pháp điện di gel agarose 0,8% .29 2.3.1.4 Phương pháp điện di gel polyacrylamide .30 2.3.2 Phương pháp lai nhân tạo .31 2.3.3 Quy trình MABC (Marker Assisted Backcrossing) chọn tạo giống lúa chịu mặn 32 2.3.4 Phương pháp đánh giá mặn nhân tạo 33 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu .36 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Tách chiết tinh ADN tổng số 37 3.2 Khảo sát đa hình hai giống bố mẹ 38 3.3 Phân tích cá thể BC phƣơng pháp MABC 41 3.3.1 Phân tích kiểu gen cá thể thuộc hệ BC1F1 (AS996/FL478 x AS996) 41 3.3.2 Phân tích kiểu gen cá thể thuộc hệ BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) 44 3.3.3 Phân tích kiểu gen cá thể thuộc hệ BC3F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996/AS996 ) 45 3.3.4 Kết đánh giá tính chịu mặn dịng chọn lọc .47 3.3.5 Đánh giá tiêu nông sinh học yếu tố cấu thành suất dòng chịu mặn 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphisms APS Ammonium Persulfate BC Backcross BĐKH Biến đổi khí hậu CAPS Cleaved Amplified Polymorphic Sequence cM centiMorgan CTAB Cetyl Trimethylammonium Bromide ĐBSCL Đồng Sông Cửu Long ĐBSH Đồng Sông Hồng dNTP Deoxynucleotide Triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization GDP Gross Domestic Product GGT Graphical Genotyper IRRI International Rice Research Institute LD-MAS Linkage Disequilibrium - MAS MABC Marker-assisted backcrossing MAS Marker-assisted selection NST Nhiễm Sắc Thể PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNAse Ribonuclease SSR Simple Sequence Repeat STR Short Tandem Repeats STS Sequence-Tagged Sites TBE Tris/Borate/EDTA TE Tris-EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Kịch nước biển dâng Việt Nam so với thời kỳ 1980 – 1999 Bảng Diện tích bị nhiễm mặn ĐBSCL tháng (1991 – 2000) Bảng Sự tương quan số thể hệ BCnF1 với tỷ lệ kiểu gen dòng ưu tú (nhận gen mong muốn) đưa vào lai BCnF1 20 Bảng Thành phần chất dùng cho phản ứng PCR với mồi SSR 28 Bảng Chương trình chạy phản ứng PCR 29 Bảng Thành phần dinh dưỡng môi trường Yoshida (Yoshida ctv, 1976) 34 Bảng Thang điểm Standard Evaluating Score (IRRI, 1997) 35 Bảng Tỷ lệ gen nhận 12 tái tổ hợp hệ BC1F1 43 Bảng Kết đánh giá mức chịu mặn dòng BC3F3 theo tiêu chuẩn IRRI, 1997 50 Bảng 10 Đặc tính nơng sinh học dòng AS996-Saltol (Vụ Xuân 2013) Hà nội 51 Bảng 11 Các yếu tố cấu thành suất suất cúa dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) Hà nội 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Diện tích nồng độ mặn vùng ĐBSCL, ứng với kịch nước biển dâng thêm 1,0 m so với Hình Bản đồ nguy ngập vùng đồng sông Hồng Quảng Ninh ứng với mực nước biển dâng cao 1m Hình 3: Sơ đồ phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử liên kết gen kết hợp lai trở lại (MABC) 36 Hình 4: Kết điện di kiểm tra ADN giống gel agarose 37 Hình Các thị liên kết gen Saltol nhiễm sắc thể số 38 Hình Đánh giá đa hình giống bố mẹ gel polyacrylamide 6% 39 Hình Đánh giá đa hình giống bố mẹ gel polyacrylamide 4.5% 39 Hình Bản đồ di truyền thị SSR sử dụng cho phân tích cá thể quần thể AS996/FL478 40 Hình Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng thị AP3206 41 Hình 10 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng thị RM10793 41 Hình 11 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng thị RM310 42 Hình 12 Sàng lọc cá thể BC1F1 (AS996/FL478) sử dụng thị RM5639 42 Hình 13 Bản đồ số BC1F1 (AS996/FL478/AS996) NST1, 3, 10 43 Hình 14 Sàng lọc cá thể BC2F1(AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng thị RM3412 44 Hình 15 Sàng lọc cá thể BC2F1 (AS996/FL478/AS996/ AS996) sử dụng thị RM10793, RM10711 44 Hình 16 Sàng lọc thể BC3F1 (AS996/FL478/AS996/AS996/AS996)sử dụng thị RM3412, RM10711, RM10793, AP3206 RM10694 45 Hình 17: Bản đồ BC3F1 - P284-112-291 phân tích phần mềm GGT2.0 46 Hình 18 Các dịng thí nghiệm BC3F3 trước thử mặn 47 Hình 19 Đánh giá tính chịu mặn dòng BC3F3 nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) 48 Hình 20 Kết thúc thí nghiệm thử mặn dịng BC3F3 nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00) 49 MỞ ĐẦU Lúa gạo cung cấp khoảng 32% tổng sản lượng lương thực Châu Á Mỗi năm toàn giới cung cấp khoảng 729 triệu gạo, tính riêng khu vực Châu Á 661 triệu [15] Biến đổi khí hậu tồn cầu mối đe dọa lớn an ninh lương thực giới Với 3000km bờ biển, hàng năm vùng trồng lúa ven biển Việt Nam chịu ảnh hưởng nhiều xâm thực biển Theo thống kê, diện tích đất ngập mặn năm 1992 494.000 ha, đến năm 2000 606.792 [1] năm 2013, tính riêng đồng song Cửu Long khoảng 740.000 Đồng sông Cửu Long vùng tạo 40% GDP nông nghiệp nước So với nước, sản lượng lương thực vùng chiếm 50%, thủy sản chiến 70% Tuy nhiên, Đồng sông Cửu Long lại xem vùng phải chịu tác động biến đổi khí hậu nhiều tác động ảnh hưởng lớn đến an ninh lương thực Đặc biệt, điều kiện khí hậu tồn cầu thay đổi, tượng băng tan hai cực, hệ lụy nước biển dâng lên đe dọa vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn yếu tố gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo ảnh hưởng xa mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực khó hồn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại nhiễm mặn đến suất lúa gạo vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Theo kịch biến đổi khí hậu năm 2012, mực nước biển dâng 1m, có khoảng 39% diện tích đồng sơng Cửu Long, 10% diện tích vùng đồng sông Hồng Quảng Ninh, 2,5% diện tích thuộc tỉnh ven biển miền Trung 20% diện tích Thành phố Hồ Chí Minh có nguy bị ngập; gần 35% dân số thuộc tỉnh vùng đồng sông Cửu Long, 9% dân số vùng đồng sông Hồng Quảng Ninh, gần 9% dân số tỉnh ven biển miền Trung khoảng 7% dân số Thành phố Hồ Chí Minh bị ảnh hưởng trực tiếp; 4% hệ thống đường sắt, 9% hệ thống quốc lộ khoảng 12% hệ thống tỉnh lộ Việt Nam bị ảnh hưởng [2] Để giải khó khăn này, việc chọn tạo giống lúa chịu mặn cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, tiến hành đề tài: “Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn” Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử kết hợp với lai trở lại quy tụ gen chịu mặn Saltol xác định trước giống lúa FL478 vào giống lúa AS996 trồng phổ biến Việt Nam để tạo dòng AS996 – Saltol đáp ứng nhu cầu giống chịu mặn sản xuất lúa gạo CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hƣởng biến đổi khí hậu đến sản xuất nơng nghiệp giới Việt Nam 1.1.1 Ảnh hƣởng biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp giới Biến đổi khí hậu (BĐKH) biến động trạng thái trung bình khí hậu tồn cầu hay khu vực theo thời gian từ vài thập kỷ đến hàng triệu năm Nguyên nhân biến đổi trình động lực trái đất, xạ mặt trời, gần có thêm hoạt động tác động người Biến đổi khí hậu ngày khơng vấn đề quốc gia hay khu vực mà vấn đề toàn cầu Biến đổi khí hậu tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống mơi trường phạm vi tồn giới Nhiệt độ tăng, mực nước biển dâng cao, gây tượng ngập lụt, gây nhiễm mặn nguồn nước, ảnh hưởng đến nông nghiệp, gây rủi ro lớn công nghiệp hệ thống kinh tế xã hội tương lai (Ứng phó với biến đổi khí hậu biển dâng, 2009) Những thách thức biến đổi khí hậu sản xuất lúa gạo vô quan trọng Phần lớn lúa gạo mà giới sử dụng trồng vùng đất thấp vùng đồng quốc gia Việt Nam, Thái lan, Bangladesh, Ấn Độ Những khu vực lại có nguy bị xâm nhập mặn mực nước biển dâng cao, cho thấy cần thiết giống lúa có khả chịu đựng tình trạng ngập nước lẫn độ mặn cao Theo báo cáo FAO (2010), 800 triệu đất toàn giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng muối khoảng 20% diện tích tưới (khoảng 45 triệu ha) ước tính bị vấn đề xâm nhập mặn theo mức độ khác [15] Điều nghiêm trọng kể từ khu vực tưới tiêu có trách nhiệm bảo đảm phần ba sản xuất lương thực giới Ở Châu Á nước biển dâng lên 1m, khoảng 25.000km2 rừng đước bị ngập, 10.000km2 đất canh tác diện tích ni trồng thủy sản trở thành đầm lầy ngập mặn, 21,5 triệu đât canh tác phải đối mặt với vấn đề nhiễm mặn, ước tính gây thiệt hại lên tới 50% đất trồng trọt toàn cầu vào khoảng kỷ 21 [28] Ở hạ lưu sông Nil (Ai Cập), triệu người phải di dời 4.500km2 đất nông nghiệp bị ngập nhiễm mặn Ở Bangladesh 18% diện tích đất nơng nghiệp bị ngập, ảnh Hình 18 hình ảnh dịng lúa chọn lọc BC3F3có mang gen kháng gieo khay nuôi môi trường dinh dưỡng Yoshida trước lọc mặn Sau bổ sung muối vào mơi trường, ghi nhận triệu chứng mặt hình thái dịng/giống Đối với FL478, sau bổ sung muối dấu hiệu tượng cháy đầu mức độ nghiêm trọng so với giống IR29, sau tượng quăn đầu 1-2 già số có tượng chết Trong trình lọc, chịu mặn phát triển bình thường Những nhiễm mặn bị héo quăn phát triển chậm (giống IR29) Hình 19 Đánh giá tính chịu mặn dịng BC3F3 nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00 ) Trên khay thử: hàng 1: FL478; hang 10: IR29; Các hàng 2-9: Các dịng BC3F3 mang vùng gen Saltol 48 Hình 20: Kết thúc thí nghiệm thử mặn dịng BC3F3 nồng độ muối EC=12dSm (NaCl=60/00) Trên khay thử: hàng 1: AS996; hàng 2: FL478; hàng 10: IR29; Các hàng 3-9: Các dòng BC3F3 mang vùng gen Saltol Ở hình 3.17, sau 14 ngày lọc mặn, có khác biệt rõ ràng giống bố mẹ: giống gốc AS996 nhiễm mặn bị héo quắt, chết giống FL478 sinh trưởng tốt Giống chuẩn nhiễm IR29 chết hết Các dòng chọn từ dòng B291 cho phản ứng chống chịu tốt với mặn Kết đánh giá bảng cho thấy, mức chống chịu mặn dịng cho thấy dịng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478 Chỉ có dịng B291-1-9 mức nhiễm vừa Kết đánh giá ghi nhận lại bảng 3.2 49 Bảng Kết đánh giá mức chịu mặn dòng BC3F3 (AS996xFL478) theo tiêu chuẩn IRRI, 1997 STT Dòng Điểm Mức chống chịu B291-1-1 KC B291-1-2 KC B291-1-3 KC B291-1-4 KC B291-1-5 KC B291-1-6 KC B291-1-7 KC B291-1-8 KC B291-1-9 NV 10 B291-1-10 KC 11 B291-1-11 KV 12 B291-1-12 KC 13 FL478 (ĐC kháng) KC 14 AS996 N 15 IR29 (ĐC nhiễm) N Kết đánh giá mức chống chịu mặn dòng cho thấy dòng BC3F3 có mức chống chịu cao tương đương giống cho gen FL478 Chỉ có dịng B291-1-9 mức nhiễm vừa 3.3.5 Đánh giá tiêu nông sinh học yếu tố cấu thành suất dòng chịu mặn Các dòng lúa chọn lọc gieo trồng ruộng để đánh giá đặc tính nơng sinh học: thời gian sinh trưởng, chiều cao cây, số bchiều dài địng, chiều dài 50 cổ bơng yếu tố cấu thành suất số khóm/bơng, số hạt/bơng, tỉ lệ số hạt chắc/bông; khối lượng 1000 hạt, suất Các số liệu ghi nhận lại tiến hành theo phương pháp hệ thống đánh giá chuẩn IRRI Số liệu phân tích xử lý chương trình tính Excel IRRISTART 5.0 Bảng 10 Đặc tính nơng sinh học dịng AS996-Saltol (Vụ Xn 2013) Hà nội Chiều TT Tên dòng Chiều dài TGST Chiều cao dài (ngày) cây(cm) đòng (cm) 88,2±4,7 34,4±2,7 3,6 ± 1,4 23,6±0,9 23,2±2,7 7,2±1,2 20,4±0,8 cổ bông(cm) Chiều dài bông(cm) B291-1 125 B291-2 125 B291-13 125 81,0±3,0 25,1±2,6 7,0±1,4 21,9±1,4 B291-2-5 125 86,0±1,6 22,5±3,5 5,3±0,6 19,1±0,6 B291-1-10 125 99,6±2 26,1±2,5 4,7±0,4 25,8±1,4 B291-1-3 125 98,9±1,7 28,5±4,8 7,7±2,8 24,1±1,5 B291-2-2 125 104±3,1 31,2±2,6 6,2±1,6 24,1±1,3 B291-2-8 125 89,3±2,2 22±3,6 8,0±1,3 19,8±0,8 B291-2-7 125 96,3±2,3 27,1±4,8 5,8±1,9 22,5±0,6 10 B291-1-1 128 87,3±3,1 23,1±3,7 5,2±1,4 23,6±1,0 11 B291-2-15 125 89,8±5,0 22,7±3,2 3,6±0,9 20,3±1,6 12 B291-2-1 125 87,8±3,3 25,8±3,1 6,3±1,8 23,5±1,5 13 B291-2-3 125 85,8±1,7 23,2±3,9 5,5±2,2 20,1±0,9 14 B291-16 125 88,5±1,2 23,3±4,0 4,3±1,1 21,5±1,5 15 B291-1-9 130 92,7±1,5 26,2±2,1 5,2±1,3 23,8±0,9 83,4±3,6 51 16 B291-2-10 125 84,6±0,8 24,4±3,3 5,3±1,3 20,3±0,7 17 B291-14 125 85,4±1,1 26,7±3,3 5,1±1,1 20,8±0,9 18 B291-1-3 125 104,2±1,0 26,0±2,5 4,0±0,8 24,0±1,1 19 AS996 125 91,0±0,8 28,6±0,7 5,9±0,6 22±0,8 20 FL478 132 87,3±2,2 33,1±4,8 3,6±1,1 21±0,7 Bảng 11 Các yếu tố cấu thành suất suất cúa dòng AS996 – Saltol (Vụ Xuân 2013) Hà nội TT Tên dòng Số Số hạt/ Tỉ lệ P1000 NSLT NSTT bơng/khóm bơng lép(%) hạt(g) tạ/ha (tạ/ha) B291-1 5,1 ± 0,7 147,2±36,1 3,27 27,03 88,20 53,37 B291-2 5,5±0,5 148,7±20,1 19,3 28,30 84,22 61,0 B291-13 5,4±0,5 144,8±23,4 25,3 26,60 70,01 58,0 B291-2-5 4,8±0,5 154,7±24,9 20,9 27,54 72,93 64,2 B291-1-10 5,0±0,7 171,1±34,4 18,16 25,50 64,23 51,13 B291-1-3 4,8±0,8 172,2±49,5 3,5 26,80 96,08 65,71 B291-2-2 5,8±0,9 155,7±51,5 4,2 24,28 94,09 63,26 B291-2-8 5,1±0,8 111,0±26,8 20,9 29,65 65,53 48,17 B291-2-7 4,0±0,9 129,2±60,6 1,9 26,13 59,52 43,12 10 B291-1-1 4,6±0,9 144,6±40,2 2,9 28,05 81,75 59,43 11 B291-2-15 4,3±0,5 133,3±20,7 23,2 27,30 53,95 40,21 12 B291-2-1 4,3±0,5 144,2±15,1 14,5 26,98 64,27 47,31 13 B291-2-3 4,5±0,5 160,2±25,4 25,1 29,00 69,61 49,23 14 B291-16 4±0,4 118,2±30,4 8,7 29,10 56,43 42,81 15 B291-1-9 4,1±0,7 154±35,3 15,9 29,98 71,63 66,32 52 16 B291-2-10 4,3±0,5 160,3±29 19,2 28,50 71,29 66,00 17 B291-14 4,4±0,8 110,7±30,4 13,5 28,40 53,99 40,62 18 B291-1-3 4,9±0,8 123,9±21,6 6,4 30,78 78,77 67,20 19 AS996 4,7±0,6 145,2±21,9 23,6 26,60 62,32 51,30 20 FL478 4,6±0,5 140,7±24 9,0 28,63 75,50 60,45 CV% 1,50 LSD0,5 2,22 Kết bảng 3.4, 3.5 cho thấy thời gian sinh trưởng dòng biến động từ 125 ngày đến 132 ngày vụ xuân 2013 Chiều cao thay đổi từ 81,0 đến 104 cm Chiều dài thay đổi từ 19,1 đến 25,8 cm Số bơng/khóm thay đổi từ 4,1 đến 5,8 bơng/khóm Số hạt/bông biến động từ 110,7 đến 193,3 hạt/bông Tỉ lệ lép biến động từ 2,5% đến 25,94% Năng suất thực tế giống tham gia thí nghiệm nói chung khá, khoảng 40,21 đến 67,2 tạ/ha.Trong đó, dịng có suất cao B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-25 tiếp tục đánh giá tính chịu mặn phát triển dòng chọn giống hệ 53 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Sàng lọc đa hình giống cho gen nhận gen tiến hành 500 thị SSR, xác định 63 thị Kết cho thấy tỉ lệ đa hinh ADN hai giống AS996/FL478 thấp sử dụng thị phân tử SSR Hai cá thể hệ BC1F1 P284 P307, có hàm lượng gen nhận cao từ 89.06 đến 86.36% tương ứng, cao so với chọn giống MAS chọn giống truyền thống 16-19% Hai cá thể sử dụng cho việc thiết lập hệ BC2F1 Trong hệ BC2F1, ba thể có hàm lượng hệ gen giống nhận gen đến 93,18 đến 94,03 % xác định cách sàng lọc ADN sử dụng cho việc thiết lập quần thể BC3F1 Cá thể P284-112-291 tốt hệ BC3F1 sàng lọc mang gần 100% hàm lượng hệ gen nhận gen khảo sát 63 thị cho đa hình Đánh giá tính chịu mặn nhân tạo hệ BC3F2 BC3F3 cho thấy dòng phát triển từ cá thể P284-112-291 có tính chịu mặn tương đương giống cho gen kháng FL478 Đánh giá đặc tính nông sinh học yếu tố cấu thành suất cho thấy dòng phát triển từ cá thể P284-112-291, có suất cao B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-2, B291-1-3a, B291-2-5 tiếp tục đánh giá tính chịu mặn phát triển dòng chọn giống hệ Đề nghị Các dịng có tính chịu mặn cao, chứa locut gen Saltol có đặc tính nơng sinh học tốt tiếp tục nghiên cứu thị phân tử, đánh giá mặn nhân tạo, kết hợp với chọn giống truyền thống để tạo dòng AS996-Saltol góp phần vào cơng tác chọn tạo giống lúa chiụ mặn cho các vùng đồng thường xuyên bi ̣ xâm nhập mặn góp phần tạo giống lúa chịu mặn để ứng phó với biến đổi khí hậu 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Hữu Ất (2005), “Ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tạo giống lúa chịu mặn cho vùng đồng ven biển Bắc bộ”, TT Khoa học Công nghệ Hạt nhân, 4/2005, Tr 28-30 Bộ Tài nguyên Môi trường (2012), Kịch Biến đổi khí hậu nước biển dâng cho Việt Nam Tăng Thị Hạnh, Dương Thị Hồng Mai, Trần Văn Luyện, Phạm Văn Cường, Lê Khả Tường, Phan Thị Nga (2011), “Nghiên cứu khả chịu mặn số nguồn gen lúa lưu giữ ngân hàng gen trồng quốc gia” Lê Sâm (2003), Xâm nhập mặn đồng Sông Cửu Long, NXB Nông Nghiệp Lê Duy Thành (1999), “Kỹ thuật PCR ứng dụng chọn giống thực vật”, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, Tr 156-158 Nguyễn Thị Tâm cs (2008), “Đánh giá khả chịu mặn giống lúa OM4498, VND 95-20, IR64, CR203 mức độ mô sẹo phương pháp ni cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Lê Thị Thu Trang (2011), “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen liên quan đến tính chịu mặn lúa Việt Nam”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ Tài liệu tiếng Anh Awala, S.K., Nanhapo P.I., Sakagami, J., Kanyomeka, L., and Iijima, M (2010), “Differential salinity tolerance among Oryza glaberrima, Oryza sativa and their Interspecies including NERICA”, Plant Prod Sc 13 (1), pp 3-10 Aslam, M., Qureshi R H., and Ahmad (1993), “Mechanisms of salinity tolerance in rice (Oryza sativa L.)”, Department of soil science and physiology, University of Agriculture, Pakistan 10 Bonille P., Dvorak J., Mackill D.J., Deal K and Gregorio G.(2002), “RFLP and SSLP mapping of salinity tolerance genes in chromosome of rice (Oryza sativa L.) using recombinant inbred lines”, Philipp Agric Sci, 85, pp 64–76 11 Akbar M, GS Khush, D HilleRisLambers (1985), “Genetics of salt tolerance”, Rice Genetics, IRRI Philippines, pp 399-409 55 12 Collar BCY, amd DJ Mackill (2008), “Marker-aided selection: an approach for precision plant breeding in the twenty first century”, Philos Trans R Soc Lond.B Biol.Sci 363, pp 557-572 13 Dat J, S Vandenabeele, E Vranova, M Van Montagu, D Inze, F Van Breusegem (2000) “Dual ction of the active oxygen species during plant stress responses”, Cell Mol Life Sci 57, pp 779-795 14 Bert Collard & David Mackill (1998), “Conserver AND drives polymorphirm(CDDP): A simple and novel method for generating AND marker in plant”, Journal plant Biology (27), pp 558-562 15 FAO (Food and Agriculture Organization) (2010), “Report of salt affected agriculture Link access”, (http://www.fao.org/ag/agl/agll/spush/, latest verified October 2011) 16 FAO (2012), “FAO says rice production outpacing consumption”, (http://www.fao.org/news/story/en/item/164713/icode/ Accessed on 17 Nov 2014.) 17 Glenn Gregorio (2010), “Rice breeding and genetics for salinity and problem soils tolerance for Asia and Africa”, October 2010- present 18 Glenn B Gregorio, Dharmawansa Senadhira, and Rhulyx D Mendoza, “Screening Rice for Salinity Tolerance”, IRRl DISCUSSION PAPER SERIES No 22 19 Gregorio G.B, Senadhira D., Mendoza R.D, NL Manigbas, JP Rosxas, CQ Guerta (2002), “Progress in breeding for salinity tolerance and associated abiotic stresses in rice”, Field crio Research Elsevier 20 Gregorio GB (1997), “Tagging salinity tolerance gene in rice (Oryza sativa) using amplified fragment length polymorphism (AFLP)”, PhD dissertation, University of the Philippines Los Banos 21 Haque QA, D HilleRisLambers, NM Tepora, QD de la Cruz (2010), “Inheritance of submergence tolerance in rice”, Euphytica 41, pp 247-251 22 Islam, M.R., Salam, M.A., Hassan L., Collard B.C.Y singh R.K and Gregorio G.B (2011) “QTL mapping for salinity tolerance at seedling stage in rice”, Emir.J.Food Agric, 23 (2): pp 137-146 56 23 Jena KK, Mackill DJ (2008), “Molecular markers and their use in marker-assisted selection in rice”, Crop Sci 48, pp 1266-1276 24 Kim, D M., Ju, H G., Kwon, T R., Oh, C S., and Ahn, S N (2009), “Mapping QTLs for salt tolerance in an introgression line population between japonica cultivars in rice”, J Crop Sci Biotech 12, pp 121–128 25 La Hoang Anh, Nguyen Kien Quoc, Hoang Thi Hue and ,La Tuan Nghia (2014), "Dentification of QTLS Tolerance to salinity in rice (ORYZA SATIVA L.)”, International Journal of Development Research Vol 4, Issue, 10, pp 2113-2118 26 M A Saghai-Maroof, K M Soliman, R A Jorgensen, and R W Allard (1984), “Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics,”Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol 81, no 24, pp 8014–8018 27 M.Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D (1989), “A common language for physical mapping of the human genom”, Science 245, pp 1434–1435 28 Maas EV, GJ Hoffman (1977), “Crop assessment”, ASCE J Irrig and 29 salt tolerance current Drainage Div 103, pp 115-134 Mishra B, M Akbar, DV Seshu, D Senadhira (1998), “Genetics of salinity tolerance and ion uptake in rice” IRRN 21, pp 38-39 30 Mishra, B., M Akbar and D.V Sashu (1990), “Genetic studies on salinity tolerance in rice towards better productivity in salt-affected soils”, Proceedings of the Rice Research Seminar, Jul 12-12, IRRI, Los Ba Laguna, pp: 25-25 31 Mohan, M., S Nair, A Bhagwat, T.G Krishna, Y Masohiro, C.R Bhatia and T Sasaki (1997), “Genome mapping, molecular markers and marker assisted selection in crop plants”, Mol Breed., 3, pp 87-103 32 Napvi N I., Bonman J.M., Mackil D J., Nelson F J .and Chattoo B B (1995), “Identification of RAPD markers linded to a major blast resistance gene in rice”, Mol Breed 1, pp 341 – 348 57 33 Negrao S., Courtois B., Ahmadi N., Abreu I., Saibo N and Oliveira M.M (2011), “Recent updates on salinity stress in rice: from physiological to molecular response”, Crit Rev Plant Sci, 30, pp 329-377 34 Nguyen thi Lang, Bui Chi Buu, Ismail A.M (2011), "Enhancing and stabilizing the productivity of salt - affected areas by incoporating nenes for tolerance of abiotics stresses in rice", Omonrice 18, pp 41-49 35 Niones JM (2004), “Fine mapping of the salinity tolerance gene on chromosome of rice (Orysa sativa) using near-isogenic lines”, MSc thesis, University of the Philippines Los Banos 36 Ponnamperuma, F N (1984), “Role of cultivar tolerance in increasing rice production on saline lands Strategies for crop improvement”, John Wiley and sons, New York, pp 443 37 Ranawake, A., & Nakamura, C (2013), “Assessment Of Salinity Tolerance In An Inbred Population Of Rice (Oryza Sativa L) Derived From A Japonica X Indica Cross”, Tropical Agricultural Research and Extension [Online] 15:3 38 Sarkar P, Bosneaga E, Auer M (2009), “Plant cell walls throughout evolution: towards a molecular understanding of their design principles”, J Exp Bot 60, pp 3615–3635 39 Shahbaz a & M Ashrafa (2013), “Improving Salinity Tolerance in Cereals”, Department of Botany, University of Agriculture, Faisalabad, Pakistan 27 Published online: 20 Feb 2013 Plant Sciences, pp 237-249 40 Thomson MJ., Ocampo M., Egdane J., Rahman M.A., Saiise AG., Adorada DL., Raiz E.T (2010), “Characterizing the Saltol quantitative trait locus for salinity tolerance in rice”, Rice, 3, pp 148-160 41 Van Berloo R (2008), GGT 2.0: versatile software for visualization and analysis of genetic data, J Hered 99, pp 232–236 42 Yeo A.R and Flowers, T.J (1996), “Salinity resistance in rice and a pyramyding approach to breeding varieties for saline soils In: Plant growth, Drought and salinity”, ED By NC Tuner and JB Passioura CSIRO, pp 161-173 Melbourn, Australia 58 PHỤ LỤC Danh sách trình tự thị cho đa hình giống FL478 AS996 Tt Tên mồi Ch Mb RM10287 G11A 9.3 RM10694 11 AP3206 11.2 RM3412 11.5 RM10711 11.2 RM493 12.3 RM10793 12.5 RM562 14.6 10 RM7075 15.1 11 RM11125 20.5 12 RM7643 31.1 13 SO1132A 32 14 RM3482 39.7 15 RM300 13.2 16 M13197 16.5 17 RM341 19.2 18 RM6318 24.4 Mồi xuôi Mồi ngƣợc GTATTCCTTGCTGCTGCTG GACTGGAGATGTGAT ATGG CGGAAACC AGCTGGTAGGAAGGCTGA TGCCAGCAGCTCAGTAG AAG AAG TTTCCCTGGTTTCAAGCTTA AGTACGGTACCTTGAT CG GGTAGAAAGG GGAGGAGGAGAGGAAG GCAAGAATTAATCCA AAG TGTGAAAGA TGATGGATCTCTGAGGT TGCACTAATCTTTCTG GTAAAGAGC CCACAGC GCTTCGATCGATGAGAA GAATCTCCCATCCTTC AGTAGAGG CCTTCC GTACGTAAACGCGGAAG CGACGTACGAGATGC GTGACG CGATCC GACTTGCCAACTCCTTCA TCGTCGAGTAGCTTCC ATTCG CTCTCTACC GGAAAGGAAGAATCAGA GTACCGTTCCTTTCGT CACAGAGC CACTTCC GCGTTGCAGCGGAATTT CCCTGCTTCTCTCGTG GTAGG CAGTCG CCAAGAACCCTAGCTCC TCGACGAGATCCTCCT CTCTCC CGTAAACC AAACCGCCGTCCTCCTAT CTTGAGCGCACCAAC TCG GAAATACC CAATGACGACGCATGTA TGCTTGAATGTTTTTC TGT GAGGA GCCGCTAATGTTGTTGTC CGAAGCCAACGTAGT AAGC CCAATCC GGGCTTAAGGACTTCTG AGCGATCCACATCATC CGAACC AAATCG AAACCCTCCGGCTCATTC ACTCGAATCGTATCGG TTGC CTTGAGG CAAGAAACCTCAATCCG CTCCTCCCGATCCCAA AGC TC AAGTGCCTCGAATTACA GCTGCTTCTGTCCAGT 59 Kích thƣớc To 184 60 250 57 195 60 180 60 215 55 173 60 178 55 124 60 126 55 376 55 212 60 178 55 180 55 173 55 162 55 183 60 200 55 188 55 Tt Tên mồi Ch Mb 19 RM13628 25.1 20 RM231 2.5 21 RM3297 13.4 22 SO3065 15 23 SO3068 17 24 SO3072 19 25 RM7097 26.7 26 RM518 27 RM5639 8.1 28 R4M17 11.5 29 RM307 12.9 30 RM5626 31 RM6329 32 RM3867 33 RM127 34 RM437 3.8 35 RM122 6.3 36 RM249 10.7 4.7 8.7 1.5 4.8 Mồi xuôi Mồi ngƣợc CATCTCC GAGACC TATGCCACGAATGACCC CTCCATATGCAGCGAC TAACC AATCG CCAGATTATTTCCTGAGG CACTTGCATAGTTCTG TC CATTG TGCACGTGATCTCTTGTA GGAGAGGGCCTTGTT ACCTAGC CTTGAGG TTTCGTGCGGGGATATA GCAAGATAACTCAAA GAG ATCAAAAGC TTGACAAGTTTTGGAAAT TTGTTGTGCCATTGGA TGGA GAAA TTTCGTGCGGGGATATA GCAAGATAACTCAAA GAG ATCAAAAGC GGCCATTATGTGCATCTC GGATCGATCGACATC TCAGC AATCTTGG AAGACACAAGCAAACAG AAGCTTGCTTGGTTCA CTCAACC AGAGAGG AGGAGGAAGGAAGAAC CTGAGTGCGTGCCATT AGAGTTGC TATTTCC AGTGCTCGGTTTTGTTTT GTCAGATATAATTGAT C GGATGTA GTACTACCGACCTACCGT CTGCTATGCATGAACT TCAC GCTC GGACGCCACCTTCCTCTT CGGTCATAAACGCCA CTGC TTAGACCAAGC CAGCAGAGACTATAGAC TGCCTAGCTACTCTAG ACTCAAGC GTGAAACC TCCTCCTCACTCGATCAT TTCTCCTACTTGACTG AATGC GAACATCG CGAAGCTTTCGGTGGGA ACCTTGAGCGAGTCCT TAGC TGAACG ATCCCTCCTCTGCTCAAT TCAGGGAGGGTCCTA GTTGG GCTACTGG GAGTCGATGTAATGTCA GAAGGAGGTATCGCT TCAGTGC TTGTTGGAC GGCGTAAAGGTTTTGCA TGT ATGATGCCATGAAGG TCAGC 60 Kích thƣớc To 200 60 170 55 298 55 180 55 195 55 167 55 177 55 193 55 139 55 220 55 290 55 97 55 344 55 187 55 195 55 183 55 200 55 135 55 Tt Tên mồi Ch Mb 37 RM163 18.9 38 RM18877 23.5 39 RM510 2.8 40 RM585 3.2 41 SO6065A 16.5 42 RM3635 11.1 43 SO 7053 15.3 44 RM455 22.3 45 RM337 0.1 46 RM152 0.6 47 RM310 48 RM547 5.5 49 RM23877 6.5 50 R9M30 14.6 51 RM215 20.9 52 RM171 10 2.6 53 RM 25022 10 3.6 54 R10M10 10 4.9 55 RM25271 10 10.7 Mồi xuôi Mồi ngƣợc CGCCTTTATGAGGAGGA AAACTCTTCGACACGC GATGG CTTGC ACCACTGCTGCAAAGAA GCGAGAATAAGATGA CATTGG GACACAAGAGG GTTTGACGCGATAAACC ATGAGGACGACGAGC GACAGC AGATTCC CTAGCTAGCCATGCTCTC CTGTGACTGACTTGGT GTACC CATAGGG CCCCTTCATCATTGCAAC AGTCTCTCCATCACCC TT GTCT GAGAGACAGTGGAAGGG GTTCCCTCCCTCCTCC AAGACG TAGTTCG CGAAACTTTGGGACGAA CGTCCACCATTCACTG ATG TCAC CCACAAATTAATCCGGA AGCATTGTGCAATCAC TCACACC GAGAAGG GTAGGAAAGGAAGGGCA CGATAGATAGCTAGA GAG TGTGGCC AAGGAGAAGTTCTCGCC GCCCATTAGTGACTGC CAGTGC TCCTAGTCG GACTTGTGGTTGTTGCTT ACTGCCATATGCATTT GTTGG CCCTAGC TTGTCAAGATCATCCTCG GTCATTCTGCAACCTG TAGC AGATCC TGCCACATGTTGAGAGT TACGCAAGCCATGAC GATGC AATTCG CTCACCTACCTAAAACCC CCACCCAAATCTGATA AAC CTG GAGCAGCAAGAGCAGCA CATGCTCGACTTCAGA GAGG AGCTTGG AACGCGAGGACACGTAC ACGAGATACGTACGC TTAC CTTTG ACATTCCGCGTTTGTGTG GCTTGGTAGTTGGGCT TAGC GATGG GAATACAACCCCCTAAA ATGGACCGTTGAGGA AAC GAC AGACGCTACTCCCACCT ATATCATTGCCGCAAC GTAACC ACAAGC 61 Kích thƣớc To 179 55 191 60 193 174 55 90 90 55 210 55 175 55 200 55 160 55 176 55 283 55 328 60 170 55 174 55 360 55 200 60 200 55 186 60 Tt Tên mồi Ch Mb 56 RM21 11 19.1 57 RM206 11 21.8 58 RM224 11 27.1 59 S11117C 11 60 RM7102 12 13.3 61 S12055 12 15.2 62 RM28746 12 26.4 63 RM17 12 26.9 9.5 Mồi xuôi Mồi ngƣợc ACAGTATTCCGTAGGCA GCTCCATGAGGGTGG CGG TAGAG ATCGATCCGTATGGGTTC GTCCATGTAGCCAATC TAGC TTATGTGG ATCGATCGATCTTCACGA TGCTATAAAAGGCATT GG CGGG CAACCATGTCTATGATCG ATGT GGCTGTCTCCATGTTG AGGT GGGCGTTCGGTTTACTTG GGCGGCATAGGAGTG GTTACTCG TTTAGAGTGC AAACGGATTAGAGGGGA TCG GAAGAAAGAAGACGCCA AAGAAAGTTCCTTCAT GAGGCTAT CATTCCATTCCCTTCC AGAAACG TCTTCG TGCCCTGTTATTTTCTTC GGTGATCCTTTCCCAT TCTC TTCA 62 Kích thƣớc To 160 55 200 55 220 55 180 60 212 55 160 55 160 55 300 55 ... chống chịu mặn giống [25] Đề tài ? ?Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn? ?? tiến hành khuôn khổ dự án hợp tác quốc tế VN-Đan Mạch nhằm ? ?tạo giống lúa chịu ngập chìm chịu mặn thích... việc chọn tạo giống lúa chịu mặn cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, tiến hành đề tài: ? ?Ứng dụng phương pháp MABC nhằm chọn tạo giống lúa chịu mặn? ?? Mục tiêu nghiên cứu đề tài: Sử dụng phương pháp. .. chịu mặn lúa [20, 35] 1.5.2 Giống lúa chống chịu mặn Việt Nam tình hình chọn giống lúa chịu mặn Việt Nam có nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn Một số giống lúa chịu mặn trồng vùng ven biển Việt