Xây dựng quy trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus thuringiensis từ nguồn nước thải chế biến thủy sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA FÏG Là THÀNH NAM XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BACILLUS THURINGIENSIS TỪ NGUỒN NƯỚC THẢI CHẾ BIẾN THUỶ SẢN CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà Số: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP Hồ Chí Minh - tháng 12 năm 2008 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu Trường Đại Học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt giai đoạn thực đề tài tốt nghiệp, nhận giúp đỡ tận tình từ phía nhà trường, môn, quý Thầy, quý Cô tất bạn lớp Cao học CNSH - 05 Xin chân thành biết ơn Bộ môn Công Nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho học tập thực đề tài nghiên cứu Xin chân thành biết ơn Thầy Nguyễn Đức Lượng, Cô Nguyễn Thuý Hương tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên tơi suốt trình thực luận văn Cảm ơn giúp đỡ, góp ý chân thành tất bạn lớp cao học CNSH - 05 năm học tập nghiên cứu Mặc dù q trình thực hiện, tơi cố gắng hồn thành luận văn cách tốt chắn khơng tránh khỏi thiếu sót, tơi xin chân thành ghi nhận đóng góp quý báu tất quý thầy cô bạn Học viên: Lã Thành Nam TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ Một thành tựu to lớn việc sử dụng phương pháp sinh học chống sâu hại việc tạo chế phẩm sở Bacillus thuringiensis sử dụng chúng rộng rãi sản xuất Vi khuẩn Bacillus thuringiensis Tổ chức Y tế giới khuyến khích sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học dùng diệt muỗi sâu Việc sử dụng nước thải thủy sản nguyên liệu thô cho sản xuất thuốc diệt côn trùng sinh học dựa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phương pháp việc tận dụng nguồn nước thải thủy sản loại bỏ Việc sử dụng nguồn nước thải thủy sản cho sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis thuận lợi việc giảm sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học Nước thải thủy sản chứa chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển vi sinh vật Vì thế, nước thải thủy sản sử dụng nguyên liệu thô giảm đến mức tối thiểu chi phí sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis giảm số lượng nước thải thủy sản loại bỏ Với thành phần nước thải tối ưu hoá với nồng độ Glucose 1.9g/l, nồng độ Peptone 17.6g/l, pH = 6.4, nhiệt độ 30oC, chế độ lắc 200 rpm, thời gian lên men 24 giờ, thu dịch tế bào tối ưu 2.22 x 109 N/ml CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Cán chấm nhận xét : ( Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị chữ ký ) Cán chấm nhận xét : ( Ghi rõ họ tên, học hàm, học vị chữ ký ) Luận văn thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Ngày Tháng Năm 2008 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH ĐỘC LẬP- TỰ DO -HẠNH PHÚC Tp Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 12 năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Học tên học viên : Là THÀNH NAM Phái :Nam Ngày tháng năm sinh : 16 – 05 – 1967 Nơi sinh: Tp Hồ Chí Minh Chun ngành : Cơng Nghệ Sinh Học MSHV : 03105627 I - ĐỀ TÀI : “ Xây dựng qui trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bacillus thuringiensis từ nguồn nước thải chế biến thuỷ sản “ II - NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG : ™ Tìm hiểu đặc điểm sinh học Bacillus thuringiensis ™ Khảo sát trạng sản xuất thủy sản, lấy mẫu nước thải phân tích, đánh giá trạng chất lượng nước thải thủy sản ™ Tối ưu hóa nguồn nước thải thủy sản làm môi trường nuôi cấy Bacillus thuringiensis ™ Xây dựng qui trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis từ nguồn nước thải chế biến thủy sản III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 12/2006 IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 12/2007 V – HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM NGÀNH BỘ MƠN QUẢN LÍ CHUN NGÀNH Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng Chuyên ngành thơng qua PHỊNG ĐÀO TẠO SĐH CHỦ NHIỆM NGÀNH ОБОБЩЕНИЕ Одним из больших результатов при использовании биологических методов против насекомых является изготовление препаратов на основе Bacillus thuringiensis и их широкое применение в производстве Бакктерия Bacillus thuringiensis стимулируется Мировой Организацией по Медицине для использования в производстве биологических препаратов против насекомых и комаров Использование водянных отходов морских продуктов, как сырье для производства биологических препаратов против насекомых на основе Bacillus thuringiensis, является новым методом по применению выбросанных источников водянных отходов морских продуктов Использование водянных отходов морских продуктов для производства биологических препаратов против насекомых на основе Bacillus thuringiensis, также удобно при уменьшении доли химических препаратов против насекомых Водянные отходы морских продуктов содержат необходимые питательные вещества для развития бакктерии и микробов Поэтому, водянные отходы морских продуктов используются как сырье, то они помогают минимальное уменьшение расходов по производству препаратов против насекомых на основе Bacillus thuringiensis, уменьшение количества выбросанных водянных отходов морских продуктов Состав водянных отходов оптимальный причем содержание Glucose 1.9 g/l, содержание Peptone 17.6 g/l, pH = 6.4, температура 30оС, режим раскачивания 200 rpm, время формирования дрожжов 24 часов, оптмальное собирание растворов клетки 2.22 х 109 N/ml MỤC LỤC CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài 1.3 Mục tiêu đề tài .3 1.4 Phạm vi nghiên cứu 1.5 Nội dung đề tài CHƯƠNG II TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan Bacillus thringiensis 2.1.1 Lịch sử phát vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Phân bố 2.1.4 Đặc điểm hình thái, sinh học Bacillus thuringiensis .6 2.1.4.1 Vi thể (Quan sát kính hiển vi) 2.1.4.2 Đại thể (Quan sát mắt thường) 2.1.5 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.6 Đặc tính sinh hóa 2.1.7 Độc tố chế gây độc vi khuẩn B thuringiensis .9 2.1.7.1 Đặc điểm .9 2.1.7.2 Cơ chế gây độc Bacillus thuringiensis .13 2.1.7.3 Những loài sâu bị B thuringiensis giết hại .15 2.2 Phương pháp sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu B thuringiensis .15 2.2.1 Các phương pháp lên men 17 2.2.1.1 phương pháp lên men chìm 17 2.2.1.2 Lên men bề mặt không vô trùng 18 2.2.1.3 Lên men hai giai đoạn .19 2.2.1.4 Lên men xốp .20 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy qui mơ phịng thí nghiệm 25 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy B thuringiensis quy mô công nghiệp 25 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ 2.2.4 Môi trường nuôi cấy B thuringiensis 26 2.3 Các hướng phát triển thuốc trừ sâu B thuringiensis 26 2.4 Các chế phẩm sinh học .27 2.5 Thành tựu đạt 28 2.5.1 Nông nghiệp 28 2.5.2 Lâm nghiệp 30 2.5.3 Bảo vệ môi trường sức khoẻ người 31 2.6 Nguồn nước thải chế biến thủy hải sản 32 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu - Phương pháp nghiên cứu .37 3.1.1 Giống vi sinh vật 37 3.1.2 Dụng cụ hoá chất thí nghiệm 37 3.1.2.1 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm 37 3.1.2.2 Hoá chất mơi trường thí nghiệm 37 3.2 Phương pháp nghiên cứu 38 3.2.1 Phương pháp huấn luyện thích nghi 38 3.2.2 Phương pháp đếm khuẩn lạc .38 3.2.3 Phương pháp đo độ đục .39 3.2.4 Đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu 40 3.2.5 Phương pháp xây dựng đuờng cong tăng trưởng .41 3.2.6 Kiểm tra tính khiết chủng phân lập 42 3.3 Xác định tính chất sinh hóa 43 3.3.1 Thử nghiệm tính di động .43 3.3.2 Thử nghiệm khả lên men glucose 43 3.3.3 Thử nghiệm khả khử nitrate .44 3.3.4 Thử nghiệm catalase 44 3.3.5 Thử nghiệm VP (Voges proskauer) 45 3.3.6 Thử nghiệm khả làm tan máu .45 3.3.7 Thử nghiệm khả phân huỷ Tyrosine 45 3.4 Bố trí thí nghiệm 46 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ 3.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 46 3.4.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu pH 46 3.4.3 Bố trí thí nghiệm tối ưu peptone 47 3.4.4 Bố trí thí nghiệm tối ưu glucose 48 3.5 Quy hoạch hố thí nghiệm 48 3.6 Phương pháp đông khô 51 3.6.1 Chuẩn bị giống 51 3.6.2 Chuẩn bị dịch nhũ hóa 51 3.6.3 Thực sấy khô 52 3.7 Kiểm tra khả diệt sâu B thuringiensis 52 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thành phần nước thải thuỷ sản phân tích viện Pasteur, Trung tâm phân tích thí nghiệm viện Vệ sinh y tế cơng cộng thành Tp Hồ Chí Minh 53 4.2 Xây dựng đường tương quan tuyến tính OD600 N/ml .54 4.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng 55 4.4 Huấn luyện giống thích nghi 56 4.5 Kết phân lập .57 4.6 Kết sinh hoá 57 4.7 Xác định pH tối ưu 58 4.8 Xác định nồng độ peptone tối ưu .59 4.9 Xác định nồng độ glucose tối ưu 60 4.10 Quy hoạch hố thí nghiệm 61 4.11 Khả diệt sâu 66 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận .68 5.2 Đề nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ I Những loài sâu bị bacillus thuringiensis giết hại 73 II Môi trường thuốc thử 74 Môi trường Nutrient Broth (NB) 74 Môi trường thạch dinh dưỡng NA 74 Môi trường bán lỏng test khả di động .74 Môi trường Phenol Red Glucose Broth 75 Môi trường Clark – Lubs ( thử VP) 75 Môi trường dịch thể nitrate 75 Thuốc thử để xác định khả khử Nitrate 75 III Một số hình ảnh kết sinh hóa .76 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 64 ™ Phương trình hồi quy trở thành: Y =1,17.109 - 4,43.107X1 + 1,3.108X2 - 4,38.107X3 - 2,3.107X13 - 3,48.107X23 + 2,25.107 X123 Từ phương trình tốn học ta thấy muốn tăng giá trị thơng số tối ưu hóa cần tăng giá trị x2 (nồng độ peptone), giảm giá trị x1 (giá trị pH môi trường) x3 (nồng độ glucose) Điều phù hợp với thực tế ngồi việc tạo sinh khối q trình phát triển B thuringensis cần nguồn protein để hình thành tinh thể độc tố đề tài trước cơng bố Đánh giá tính thích ứng phương trình hồi quy dựa vào tiêu chuẩn Fisher: Tính Sdu2 công thức sau: N Sdu2 = ∑( y i i =1 − yˆi ) N −l N: Số thí nghiệm l: hệ số hồi quy có ý nghĩa Kết Sdu2 tính 1,877.1015 Fthực nghiệm = S2dư / S2th = 18,77 Flý thuyết (0,99, f1 = 1, f2 = 2) = 98,5 f1 hiệu số thí nghiệm hệ số hồi quy có ý nghĩa f2 số lần lặp lại thí nghiệm Kết Fthực nghiệm < Flý thuyết nên phương trình hồi quy mơ tả thí nghiệm với p = 0,01 ™ Tìm điều kiện tối ưu theo phương pháp đường dốc Sau xác định mức độ ảnh hưởng ba yếu tố (nồng độ peptone, nồng độ glucose giá trị pH môi trường), sử dụng phương pháp đường leo dốc để tìm điều kiện tối ưu tiến hành số thí nghiệm bảng 19 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 65 Bảng 19: Bố trí thí nghiệm áp dụng phương pháp đường dốc Điều kiện thí nghiệm X1 X2 X3 Y Mức sở 14 2,5 9,1.108 - 4,43.107 1,3.108 - 4,38.107 0,5 0,5 Tích số bi * Δxj - 2,21.107 1,3.108 - 2,19.107 Bước nhảy 0,1 0,59 0,1 Bước làm tròn 0,1 0,6 0,1 Thí nghiệm tưởng tượng 6,9 14,6 2,4 Thí nghiệm tưởng tượng 6,8 15,2 2,3 Thí nghiệm 6,7 15,8 2,2 Thí nghiệm tưởng tượng 6,6 16,4 2,1 Thí nghiệm tưởng tượng 6,5 17,0 2,0 Thí nghiệm 6,4 17,6 1,9 Thí nghiệm tưởng tượng 6,3 18,2 1,8 Thí nghiệm tưởng tượng 6,2 18,8 1,7 Thí nghiệm 6,1 19,4 1,6 Thí nghiệm tưởng tượng 6,0 20 1,5 Thí nghiệm tưởng tượng 5,9 20,6 1,4 Thí nghiệm 5,8 21,2 1,3 Hệ số bi Khoảng biến thiên 2,11.109 2,22.109 1,67.109 1,62.109 Do khoảng biến thiên dựa giá trị sở glucose với khoảng biến thiên 0,1 nên khoảng biến thiên hai yếu tố lại phải dựa theo glucose Tuy nhiên, giới hạn mặt thiết bị (đo giá trị pH) nên chúng tơi thực thí nghiệm từ – (khoảng biến thiên pH 0,3) Xét kết từ thí nghiệm ta có y = 2,22.109 cực đại điều kiện thí nghiệm tương ứng tối ưu Vậy điều kiện tối ưu để thu nhận tế bào BT sau: Nồng độ glucose 1,9 g/l - nồng độ peptone 17,6 g/l – pH = 6,4 – nhiệt độ 30OC, chế độ lắc 200rpm, thời gian thu nhận 24 giờ, nước thải nguyên chất HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 66 - Hình 8: Dịch huyền phù Bacillus thuringiensis với thành phần môi trường tối ưu 4.11 Khả diệt sâu TB Số lần lặp lại thí nghiệm Thời Gian 24h 48h 72h 96h Số sâu Số sâu chết ban đầu 60 15 Tỉ lệ 0% 0% 10% 25% Số sâu Số sâu chết ban đầu 60 11 Tỉ lệ 0% Số sâu Số sâu chết ban đầu 0% 6.7% 18,3% 60 13 Tỉ lệ 0% 0% 8,4% 21,7% Bảng 20: Thử nghiệm đối chứng HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 67 - Số lần lặp lại thí nghiệm Thời Gian 24h 48h 72h Số sâu Số sâu ban chết đầu 12 60 96h TB Tỉ lệ 20% 28 50% 45 75% 60 100% Số sâu Số sâu ban chết đầu 15 60 Tỉ lệ 25% 31 60% 46 76,7% 60 100% Số sâu Số sâu Tỉ lệ ban chết đầu 13,5 22,5% 60 29,5 49,2% 45,5 75,8% 60 100% Bảng 21: Thử nghiệm với dịch vi khuẩn B thuringiensis ™ Nhận xét: Khả tiêu diệt sâu dịch lên men B thuringiensis sau 24 22.5%, 48 49.2%, 72 75.8% sau 96 chết 100% Nếu tính đến tỉ lệ sâu chết tự nhiên tỉ lệ diệt sâu thử nghiệm khơng hồn tồn Hình 9: Thuốc trừ sâu Bacillus thuringiensis dạng bột HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 68 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu rút kết luận: ™ Nguồn nước thải thuỷ sản với thành phần lý hố phân tích sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis ™ Với pH: 6,4 – Peptone: 17,6 gram – Glucose: 1,9 gram – Nhiệt độ: 30OC – Tốc độ lắc: 200 rpm, bổ sung vào môi trường nước thải thuỷ sản ta thu nhận 2,22.109 tế bào Bacillus thuringiensis thời gian 24 ™ Từ kết chúng tơi xây dựng quy trình thuốc trừ sâu sinh học sau: Huấn luyện giống Nước Thải Thủy Sản Xử Lý Nước Thải Nhân Giống cấp 1, cấp 2… Lên Men Môi Trường Nuôi Cấy Thu Sinh Khối - Sấy 40OC - Độ ẩm: -10% HV:Lã Thành Nam - pH: 6.4 - Peptone: 17.6gram - Glucose: 1.9 gram - Nhiệt độ: 30oC - Tốc độ lắc: 200rpm - Lên men: 24 Hoàn Thiện Sản Phẩm Luận văn thạc sĩ - 69 5.2 Đề nghị ™ Tiếp tục nghiên cứu thêm tác động môi trường nước thải thủy sản (hoá chất bảo quản thủy sản, dư lượng kháng sinh,…) ™ Tiếp tục nghiên cứu thêm bào tử tinh thể độc Bacillus thuringiensis Hình 10: Một số sản phẩm thuốc trừ sâu Việt Nam sản xuất HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 70 - TÀI LIỆU THAM KHẢO ™ Tài liệu tiếng việt Bernard R Glick – Jack J Pasternak Công nghệ sinh học phân tử Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Bùi Thị Như Thuận, Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức Kiểm nghiệm chất lượng tra vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà xuất y học – 1991 Lâm Minh Triết Kỹ thuật môi trường, Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh -2006 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội - 5/2005 Lê Xuân Phương Vi sinh vật công nghiệp Nhà xuất xây dựng Hà Nội Lê Huy Bá , Lâm Minh Triết Sinh thái môi trường ứng dụng Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Anh Tuyết Thí nghiệm Cộng nghệ sinh học, tập 2.Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 2003 Nguyễn Đức Lượng Cộng nghệ sinh học, tập Vi sinh vật học cơng nghiệp Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Văn Kiết, Huỳnh Trung Hải Quan trắc nước thải công nghiệp Nhà xuất Khoa học kỹ thuật - 2006 10 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất giáo dục – 09/2003 11 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm Văn Ty Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội – 1972 12 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học, tập 2, t ập Nhà xuất đại học trung học chuyên nghiệp Hà Nội – 1980 13 Nguyễn Lân Dũng Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội – 1981 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 71 14 Nguyễn Văn Phước Xử lý nước thải bùn hoạt tính, Nhà xuất đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh – 2004 15 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hồng Hải, Vũ Thị Hồn Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất giáo dục – 06/2005 16 Những nghiên cứu bảo vệ thực vật, tập Nhà xuất Khoa học kỹ thuật – 1978 17 Nguyễn Cảnh Nguyễn Đình Soa Tối ưu hóa thực nghiệm hóa học kỹ thuật hóa học –Trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh – 1994 18 Nguyễn Dỗn Ý Quy hoặnh vàxử lý số liệu thực nghiệm Nhà xuất xây dựng Hà Nội – 2006 19 Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Đại học trung học chuyên nghiệp – Hà Nội 20 Trần Linh Thước Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nhà xuất giáo dục 21 Trần Linh Thước Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất giáo dục Đại học quốc gia TP.HCM – 2001 22 Trần Dũ, Nguyễn Nhiều, Phạm Văn Nông, Đỗ Dương Thái, Lê Đình Tiềm, Nguyễn Phùng Tiến Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh vật ký sinh trùng Nhà xuất y học – 1972 23 Trần Thị Thanh Công nghệ vi sinh, Nhà xuất giáo dục – 10/2003 24 Trịnh Xuân Lai, Nguyễn Trọng Dương Xử Lý nước thải công nghiệp, Nhà xuất xây dựng Hà Nội - 2005 25 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành Công nghệ sinh học, tập Nhà xuất giáo dục - 2006 26 Lương Đức Phẩm Công nghệ xử lý nước thải biện pháp sinh học, Nhà xuất giáo dục – 10/2003 ™ Tài liêu nước internet 27 Alexander N Glazer, Hiroshi Nikaido, Microbial Biotechnology fundamentals of applied microbiology HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 72 28 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley, Stanley T Williams (1994) , Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology Ninth Edition, William & Wilkins 29 Available online at www.sciencedirect.com 30 www.elsevier.com/locate/watres 31 www.mindfully,org/GE/Bacillus - thurin - BT.html 32 www.bt.uesd.edu 33 www.inchen.org/documents/ehc/v217eh02.gif 34 www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html 35 ipmofak@mtaonline,net 36 www.sinhquyen.com 37 www.thiennhien.net/news/158/ARTICLE/1773/2007-03-30.html 38 www.elsevier.com/locate/procbio 39 hide-hri@gs.niigata-u.ac.jp 40 pmep.cce.cornell.edu/profiles/extoxnet/24d-captan/bt- ext.html 41 search.yahoo.com/ search?p=bacillus+thuringiensis&tab 42 www.academicjournals.org/AJB 43 www.fems-microbiology.org 44 file:///C:/Documents%20and%20Settings/TRUONG%20PHONG/Des 45 file:///F:/net/maom.htm 46 www.magma.ca/~scimat/B-thurin.htm 47.Malik.K.A”maintence of microorganism by simple methods” in maintenance of microorganism and cultured cells, Academic Press, Harcourt Brace Jovanovih Publishers, 1991 HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 73 - PHỤ LỤC I Những loài sâu bị bacillus thuringiensis giết hại ( Phụ lục1) - Sâu đo acrobat (Acrobasis Spp.) - Bướm hại gai (Albaiis urtene) - Sâu xám hại rau (Agrotis ypsilon) - Bướm phấn Địa Trung Hải (Anagasta) - Ong kén nhỏ (Apanteles glomeratris) - Sâu đo rau vàng (Apochemia brisoidaria) - Bướm trắng gân đen (Aporia crataegi) - Ngài (Archips argurospilus) - Bướm tai châu (Arctiaenfa) - Sâu bướm đốm (Argtresthia conjugella) - Sâu ăn (Argyroplose variegana) - Sâu cắn điền (Barathra brassieae) - Ngài (Cocoecia poclana) - Sâu (Chloridea dipsaea) - Sâu nhỏ (Cnaphalocrocis medinalis) - Bướm vàng (Colias philocide eurytheme) - Sâu róm thơng (Dendrolimus depressella) - Sâu róm (Euproctis chrysorrhoea) - Sâu ống sáp (Galleria mellonella) - Sâu hại lớn (Gastropacha quereifolia) - Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimosechesma operculella) - Sâu xanh hại (Heliothis armigera) - Sâu xanh hại ớt (Heliothis asulla) - Sâu xanh hại cà chua (Heliothis absolela) - Sâu hại ngô (Heliothis zeae) - Sâu đo đậu (Hemerophila atrineatia) - Bướm hại táo tây (Hyponomeuta malinellus) - Sâu đục đậu (Laspeyresia migricana) - Bọ khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 74 - Sâu cắn ngô (Leucania separata) - Sâu róm hại dâu (Lymantria monaeha) - Sâu đục đỗ (Maruca telulatis) - Sâu đục thân ngô (Ostrinia nubilatis) - Sâu lúa lớn (Parnara guttata) - Bướm cải (Pieris rapae) - Bướm phấn trắng (Pieris rapae) - Sâu tơ (Plutella maculipennis) - Mọt lúa mì (Sitophilus granarius) - Sâu (Timetocera acellassa) - Bướm vằn (Vanessa urticeae) - Sâu hồng (Zeuzera kyrina) II Môi trường thuốc thử ( phụ lục 2) Môi trường Nutrient Broth ( NB ) Cao thịt 5g NaCl 5g Pepton bột 10 g Nước cất 1000 ml pH = 7,4 – 7,6 Hấp 121oC / 15 phút Môi trường thạch dinh dưỡng NA - Thành phần môi trường mơi trường NB có bổ sung 18 g agar 1000 ml môi trường - Đun cho tan thạch, sau đem hấp khử trùng 121oC / 15 phút - Sau hấp khử trùng xong , để nguội khoảng 50oC tiến hành đổ mơi trường vào đĩa petri vô trùng Môi trường bán lỏng test khả di động Cao thịt bò 3g Pepton NaCl 5g Agar Nước cất 1000 ml 10 g 3g Đun có khuấy cho sơi phút để hòa tan thạch Phân phối vào ống nghiệm ml môi trường Hấp tiệt trùng 121oC 15 phút HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 75 Môi trường Phenol Red Glucose Broth Pepton 10 g NaCl 5g Cao thịt bò 1g Glucose 10 g Đỏ phenol (7,2 ml dung dịch 0.25%) Nước cất 0,018 g 1000 ml Phân phối vào ống nghiệm ml môi trường Hấp tiệt trùng 15’/121oC Môi trường Clark – Lubs ( thử VP ) Peptone 7g K2HPO4 5g Glucose 10 g Nước cất 1000 ml Phân phối vào ống nghiệm ml môi trường Hấp tiệt trùng 15’/121oC Môi trường dịch thể nitrate Cao thịt bò 3g Peptone 5g KNO3 1g Nước cất 1000 ml Hoà tan chất Phân phối vào ống nghiệm ml môi trường Hấp tiệt trùng 15’/121oC Thuốc thử để xác định khả khử Nitrate Gress A : Acid sulfanilic 0,5 g Acid acetic Nước cất vừa đủ 30 ml 100 ml Dung dịch bảo quản tháng đựng chai màu tránh tiếp xúc với ánh sáng Gress B : α - naphtylamin 0,8 g Acid acetic 30 ml Nước cất 100 ml Hòa tan 0,8 g α - naphtylamin 100 ml nước cất đun sôi Để nguội bổ sung thêm 30 ml acid acetic, đem lọc, đựng chai màu Dung dịch bảo quản tuần HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ - 76 III Một số hình ảnh kết sinh hóa ĐC − + + Lên men đường − − + Khử Nitrate HV:Lã Thành Nam Thử nghiệm VP ÑC Khả tan máu Luận văn thạc sĩ - 77 - Ống giống huấn luyện Độ pha loãng 10 -8 HV:Lã Thành Nam Độ pha loãng 10 -7 Độ pha loãng 10 -9 Luận văn thạc sĩ - 78 - Hộp sâu Superworm đối chứng Hộp sâu Superworm có sử dụng dịch lên men HV:Lã Thành Nam Luận văn thạc sĩ ... phần nước thải thủy sản ™ Tối ưu hóa nguồn nước thải thủy sản làm môi trường nuôi cấy B thuringiensis ™ Xây dựng qui trình sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis từ nguồn nước thải chế biến. .. Sản Xuất Thuốc Trừ Sâu Sinh Học Bacillus Thuringiensis Từ Nguồn Nước Thải Chế Biến Thuỷ Sản? ?? 1.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài - Nguồn nước thải thủy sản nước thải môi trường, việc tận dụng nguồn nước. .. trùng sinh học dựa vi khuẩn Bacillus thuringiensis phương pháp việc tận dụng nguồn nước thải thủy sản loại bỏ Việc sử dụng nguồn nước thải thủy sản cho sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis