Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus Thuringiensis

Phần II. Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bằng vi khuẩn Bacillus Thuringiensis11 1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus Theringiensis11 2. Chu trình sống của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis12 2.1. Thể sinh dưỡng12 2.2. Nang bào tử13 2.3. Bào tử và tinh thể13 3. Độc tố và cơ chế lây nhiễm độc của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis14 3.1. Các loại độc tố của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis14 3.2. Cơ chế lây nhiễm độc của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis17 4. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus Theringiensis18 Phần III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học20 1. Sơ đồ khối quy trình sản xuất20 2. Thuyết minh quy trinh sản xuất21 3. Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình lên men23

Phần I Tổng quan về chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2

1 Lịch sử về sự phát triển của ngành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 2

3 Đặc điểm và cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học 4

3.2 Cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học 5

4 Các yếu tố ảnh hưởng tới cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học 5

5 Các loại thuốc trừ sâu sinh học phổ biến trên thị trường 7Phần II Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bằng vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

11

1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus Theringiensis 11

2 Chu trình sống của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 12

4 Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus Theringiensis 18Phần III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 20

3 Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình lên men 23

4 Ưu, nhược điểm và cách khắc phục của thuốc trừ sâu Bt 24

Danh mục hình

Hình 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học Vimatox 1.9EC 8

Hình 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Chichomix – DT 9

Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 12

Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

với tinh thể (crystal) và bào tử (spore) 13

Hình 2.3 Cơ chế tác động của tinh thể độc với sâu 17

Danh mục bảng

Bảng 2.1 Các nhóm tinh thể diệt côn trùng 17

Bảng 3.1 Một số môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy Bt 22

MỞ ĐẦU

Trong thời kỳ công nghiệp hóa-hiện đại hóa , nước ta đang từng bước hoàn thiện để trở thành một nước công nghiệp Tuy nhiên, với hơn 75% dân số sống ởnông thôn, với trên 10 triệu ha canh tác, hiện tại nông nghiệp vẫn là ngành sản xuất chính, chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi như: khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, mạng lưới sông ngòi chằng chịt, loại đất đa dạng phù hợp với nhiều loại cây trồng,… đã cung cấp cho chúng ta nguồn nguyên liệu dồi dào cả trong nước và xuất khẩu

Để thu được một vụ mùa bội thu, việc phòng chống sâu bệnh là một trongnhững khâu quan trọng trong chăm sóc cây trồng Từ những năm 50 của thế kỷtrước, người ta đã sử dụng thuốc trừ sâu hóa học được tổng hợp từ clo vàphotpho Tuy nhiên, trong những năm gần đây, khi sử dụng loại thuốc này đãgây ra những ảnh hưởng to lớn đến xã hội và sức khỏe con người như : sau mộtthời gian sử dụng thuốc, không những không tiêu diệt được hết sâu hại mà còn

có nhiều thêm do sâu hại quen dần và có dấu hiệu “ nhờn thuốc ” Từ đó, tồn dưcác chất độc hại trong đất ngày càng cao, đất đai bị thoái hóa dần, dinh dưỡng bịmất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị pháhủy, dẫn đến tồn dư chất độc trong sản phẩm lương thực-thực phẩm, ảnh hưởngđến sức khỏe đến con người và vật nuôi: tình trạng bị ngộ độc thực phẩm tăngcao, sinh ra nhiều bệnh tật và ảnh hưởng tới thế hệ sau

Vì những lý do trên, nhóm đã chọn đề tài: “Công nghệ sản xuất chế phẩmthuốc trừ sâu sinh học” để làm tiểu luận

4

PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC

Cùng với sự đa dạng của cây trồng thì sự đa dạng của sâu hại ở Việt Nam cũng rất lớn Hằng năm, thiệt hại do sâu khoảng 25-30%, thậm chí có khi lên đến 40-50% Thành phần sâu hại khoảng 753 loài thuộc 99 họ và 10 bộ Để khắcphục tình trạng này mỗi năm nước ta phải nhập 25.000 tấn thuốc bảo vệ thực vật.Năm 2004 ở nước ta có đến 436 loại hóa chất với 1231 tên thương phẩm khác nhau, trị giá khoảng 170 triệu USD Do sâu hại có khả năng kháng thuốc nên người trồng trọt thường tăng nồng độ sử dụng dẫn đến dư lượng thuốc trừ sâu trong sản phẩm tăng cao, gây mất an toàn cho người sử dụng, bất lợi đối với môitrường, sức khỏe cộng đồng và chính người trồng trọt Ngoài ra, các sản phẩm này không thể xuất khẩu được nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập của người nông dân Đây cũng là một cách thức lớn cho người nông dân Việt Nam khi gia nhập WTO, chính vì vậy mà sự phát triển của ngành sản xuất thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật ngày càng mạnh hơn trên thế giới cũng như ở nước ta

1 Lịch sử về sự phát triển của ngành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

Trên thế giới, việc sử dụng vi sinh vật trong bảo vệ thực vật ngày càng được phát triển manh mẽ, đã tìm được nhiều chủng vi sinh vật có khả năng gây bệnh cho côn trùng

Năm 1901, chủng vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và hiện đang sử dụng

để diệt sâu hại và côn trùng là vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) do Ishwatari tìm thấy đầu tiên, ông đặt tên là Bacillus sotto.

Đến năm 1911, loài vi khuẩn này được Ernst Berlinner phát hiện và đặt tên làBacillus Thuringiensis khi ông nghiên cứu ra tác nhân gây bệnh trên loài sâu xám ở tỉnh Thuringia, Đức

Đến năm 1938, lần đầu tiên Bacillus Thuringiensis được sử dụng làm thuốc

trừ sâu tại Pháp

Thập niên năm 1950, Bt được sử dụng rộng rãi tại Mỹ

Bt đã được nghiên cứu và được ứng dụng rộng rãi trên nhiều quốc gia và đemlại hiệu quả đáng kể như ở: Hoa Kỳ, Liên Xô cũ, Pháp, Đức, Trung Quốc, Nhật Bản,…

Ở nước ta, từ cuối thập kỷ 80 đầu thập kỷ 90, một số cơ quan nghiên cứu khoa học đã bắt đầu sản xuất các chế phẩm diệt sâu từ Bt Hiệu lực của chế phẩm Bt sản xuất ở trong nước đối với sâu tơ, sâu xanh, sâu cuốn lá loại nhỏ tương ứng đạt 60%-100%, 12%-32%, 28%-100%

Việc sử dụng các chủng vi sinh vật có khả năng gây độc với côn trùng và sâu hại vào công tác bảo vệ thực vật trên thế giới và nước ta đã và đang phát triển ngày càng mạnh mẽ, dần thay thế cho các loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học đang gây ô nhiễm môi trường và gây độc cho động vật và con người

2 Thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Chúng được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ được các loài sâu bọ gây hạicây trồng nông, lâm nghiệp

Thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành 4 nhóm :

 Nhóm vi sinh: thành phần thuốc bao gồm những vi sinh vật còn sống như nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, chúng đều ở dạng bào tử hay nang trong thời gian nhất định Các vi sinh vật này sẽ phát triển và ký sinh trên vật chủ khi gặp điều kiện thuận lợi Ví dụ: thuốc trừ sâu Bt, nấm trichoderma,…

 Nhóm độc tố và kháng sinh: thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sinh học đượctạo ra trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật, gồm chất gây độc (độc tố) và chất

tác động lên hoạt động sống tế bào (kháng sinh) Ví dụ: Kasugamycin,

Streptpmycin, Avermectin, spinosad,

6

 Nhóm thảo mộc: thuốc BVTV sinh học được tạo bởi quá trình tách chiết thực vật có hiệu lực khá cao và phong phú do nguồn nguyên liệu dồi dào Ví dụ: cây thuốc lá, bột tỏi, saponin….

 Nhóm nguồn gốc sinh học khác: thuốc BVTV có thể bào chế từ nguồn sinh học khác như vỏ tôm cua (chitosan), các axit amin từ thủy phân protein, dầukhoáng,…

3 Đặc điểm và cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học

3.1.Đặc điểm của thuốc trừ sâu sinh học

Ưu điểm: So với thuốc bảo vệ thực vật hóa học thì thuốc trừ sâu sinh học có nhiều đặc điểm tốt hơn đó là:

- Không gây độc hại cho người, động vật, cây trồng, có khả năng tiêu diệt một cách chọn lọc các loại sâu bệnh Do không gây độc hại đối với con người, lại không ảnh hưởng xấu đối với sự phát triển của khu hệ vi sinh vật quanh hệ rễ của cây trồng, nên chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật không phá vỡ cân bằng hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường sống

- Việc sử dụng chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học bảo vệ thực vật cho đến nay chưa phát hiện thấy hiện tượng lờn thuốc ở các loài côn trùng

- Có thể chuyển gen chi phối việc tạo tính độc đối với côn trùng gây hại sang cho nhiều loại cây trồng tạo nên những cây trồng tự có khả năng kháng được các loài sâu hại Đây là tác dụng mà những chế phẩm thuốc trừ sâu hóa họckhông thể có được

- Khi phun thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật ra ngoài thiên nhiên, các vi sinh vật trong chế phẩm đều có khả năng thích nghi cao, hội nhập vào tự nhiên một cách khá thuận lợi để có thể tham gia vào các cuộc đấu tranh sinh học một cách tích cực

- Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt,…) ở nhiều dạng khác nhau

- Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên của các giống vi sinh vật có ý nghĩa rất lớn trong việc tăng cường lây lan tạo thành dịch ở côn trùng, đó là một

ưu điểm lớn của thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật

Nhược điểm: bên cạnh những ưu điểm trên thì thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật còn một số hạn chế như:

- Thuốc trừ sâu vi sinh có đặc hiệu cao nên phổ tác động hẹp Do đó để tiêudiệt nhiều loại côn trùng thì phải sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu virus, điều nàykhông mang lại hiệu quả về kinh tế

- Diễn biến chậm, khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi thì khó đạt kết quả tốt

- Chịu những tác động của môi trường rất lớn như ánh sáng, lượng nước tưới, nước mưa, nhiệt độ,…

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường 1-2 năm, trong những điều kiện lạnh, khô

- Giá thành còn cao Tuy nhiên với những hạn chế trên là rất nhỏ chúng ta

có thể hạn chế được bằng nhiều biện pháp khác nhau

3.2 Cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học

Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể nhiễm lên côn trùng bằng nhiều cách khác nhau: bằng đường tiêu hóa (ở vi khuẩn), khi sâu ăn phải lá có vi khuẩn, tinhthể độc cùng với bào tử sẽ xâm nhập vào cơ thể sâu qua đường tiêu hóa Khi đi vào ruột giữa, tinh thể độc hòa tan và được protease trong ruột hoạt hóa thành dạng có hoạt tính độc độc tính này liên kết với tế bào biểu mô thành ruột, đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô làm cho chúng bị phân giải, ruột bị phá hoại, sâu chết

4 Các yếu tố ảnh hưởng tới cơ chế gây độc của thuốc trừ sâu sinh học

4.1 ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

Nhiệt độ: Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học tương đối bền với nhiệt, giớihạn nhiệt độ mà chúng có thể tồn tại tương đối rộng Chúng có thể chịu đượcnhiệt độ lên tới 90oC

8

Độ ẩm: Khi ở dạng bào tử thì độ ẩm của môi trường không ảnh hưởng nhiềutới chúng Khi ở dạng sinh trưởng thì độ ẩm có tác động rất lớn tới tác dụng gâyđộc trong cơ thể côn trùng của chúng Độ ẩm thích hợp cho chúng có thể pháttriển trên cơ thể côn trùng và sâu hại là tùy thuộc vào từng chế phẩm, thường độ

ẩm tốt nhất nằm trong khoảng 70-85%

Các yếu tố khác: Bên cạnh các yếu tố nhiệt độ, độ ẩm thì ánh sáng, gió, mưacũng ảnh hưởng không nhỏ tới tác dụng của các chế phẩm Một số loại chế phẩmthường bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng mặt trời với cường độ chiếu sángcao Mưa cũng tác dụng rất lớn tới phạm vi gây bệnh của chế phẩm, nếu phuncác chế phẩm gặp trời mưa thì rất dễ bị rửa trôi do đó hiệu quả không cao

4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố hóa học

- pH: pH của môi trường mà các chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh vật tồn tại và

phát triển tốt là môi trường kiềm bên trong cơ thể côn trùng, sâu hại Khoảng pHtối thích tùy thuộc vào từng loại chế phẩm khác nhau, thông thường nằm trongkhoảng pH=6,5 đến 7,5 là tốt

- Các yếu tố khác: Ngoài pH của môi trường các chế phẩm này còn chịu tácđộng của một số chất có trong các thuốc bảo vệ thực vật hóa học đang dùng vàmột số chất kích thích sinh trưởng khác

5 Các loại thuốc trừ sâu sinh học phổ biến trên thị trường

Hình 2.1 Thuốc trừ sâu bacilus 18WP

10

Hình 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học Vimatox 1.9EC

Hình 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Chichomix - DT

Hình 1.4 Thuốc trừ sâu exin 2.0SC

PHẦN II: SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BẰNG VI

KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

1 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus Theringiensis

Bacillus Theringiensis (Bt) được phát hiện vào năm 1901 do Ishwatari.S, lần

đầu tiên phân lặp được chủng vi khuẩn gây bệnh cho tằm và đến năm 1961, Btđược đăng ký như một loại thuốc trừ sâu an toàn với tổ chức EPA Ngày nay,hàng ngàn sản phẩm của chủng này được sử dụng để tạo ra thuốc trừ sâu sinhhọc đối với nhiều côn trùng gây bệnh khác nhau

Thuốc trừ sâu vi sinh Bacilluss Thuringiensis thuộc nhóm trừ sâu sinh học,

có nguồn gốc vi khuẩn, phổ tác dụng diệt sâu rộng và hữu hiệu đối với các lọaisâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sâu khi ăn phảithuốc sẽ ngừng ăn sau vài giờ và chết sau 1 – 3 ngày

Bacillus Thuringiensis thuộc:

Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus Theringiensis

 Là một trực khuẩn gram dương, hiếu khí không bắt buộc, kích thước 6µm

3- Có dạng hình que, hình thoi hoặc ở chuỗi nhiều phân tử

 Có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng lẽ hoặc xếp thành từngchuỗi

 Sinh bào tử, kích thước khoảng 1,6-2µm

14

 Sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ khoảng từ 12 °C-40°C; nhiệt độtối ưu từ 27°C-32°C, nhiệt độ thấp sinh trưởng chậm; nhiệt độ cao từ 35°C-40°C, sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hóa.

 BT thích hợp với pH kiềm khoảng từ 6-8

Hình 3.1 Vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

2 Chu trình sống của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

Chu trình sống của vi khuẩn Bt chia ra ba giai đoạn: thể sinh dưỡng, nang bào tử, bào tử và tinh thể

2.1 Thể sinh dưỡng

Thể sinh dưỡng dạng que, hai đẩu tù, kích thước 1,2-1,8µm x 3-5µm, bắt màu Gram dương khi nhuộm màu với thuốc nhuộm Lông mọc xung quanh hơi động hoặc không động Chúng thường tồn tại một cá thể hoặc hai cá thể liền nhau Thể dinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang Trong thời kỳ sinh sản thường có 2, 4 ,8… thể dinh dưỡng liền nhau thành chuỗi Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều dễ nuôi cấy trên môi trường

và loại môi trường Tinh thể là một loại protein (chất diệt sâu) có hiệu quả chủ yếu.

16

Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus Thuringiensis với tinh thể (crystal) và bào tử

(spore)

3 Độc tố và cơ chế lây nhiễm độc của vi khuẩn Bacillus

Thuringiensis

3.1 Các loại độc tố của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis

Vi khuẩn Bt gây bệnh cho côn trùng qua con đường tiêu hoá Bào tử nảy nầmđẫn đến sự sinh sản của vi khuẩn trong cơ thể vật chủ làm côn trùng chết, songyếu tố chính làm côn trùng chết nhanh chóng lại là chất độc do vi khuẩn sinh ra,

đó là các chất độc tinh thể (Cry) được mã hoá bởi các gen Cry khác nhau (đâycũng là một trong các dấu hiệu dùng để phân loại các nhóm Bt và các chất độcphân giải tế bào (Cry) có tác động riêng rẽ và tổ hợp cùng Cry làm tăng tác dụngcủa tinh thể độc Nhóm chất độc Cry bao gồm các ngoại độc tố (sản phẩm tiếtcủa vi khuẩn) α, β, γ

- Ngoại độc tố α là một loại enzyme phospholipase được tiết ra trước khi bào

tử và tinh thể độc được hình thành, chúng có tác dụng gây nên sự phân huỷ các

mô trong cơ thể côn trùng bị tác động

- Ngoại độc tố β là loại độc tố của Bt được nghiên cứu kỹ thuật Độc tố này

có tính bền nhiệt, được tạo ra trước khi tinh thể độc hình thành Ngoại độc tố β

có cấu trúc tương tự như ATP, có tác dụng canh tranh với ATP, làm ức chế hoạtđộng của ARN_polymerase Cùng với tinh thể độc, ngoại độc tố này xâm nhậpvào huyết tương của côn trùng, đến các cơ quan làm tăng tính độc của vi khuẩnkhi đi vào cơ thể côn trùng Hiệu quả của ngoại độc tố β thể hiện rõ trên đốitượng sâu non của côn trùng chịu tác động, làm ngăn cản quá trình lột xác, hoặcgây dị thường trong quá trình phát triển của sâu Tác dụng của độc tố này cònphụ thuộc vào liều lượng và cách thức sử dụng để gây độc, thường thì gây độcqua tiêm cho hiệu quả mạnh hơn là qua đường tiêu hoá

- Ngoại độc tố γ; độc tố này cũng là loại phosphlipase tác động lênphostpholipid, làm phá huỷ các mô tế bào của sâu hại khi bị nhiễm Bt