Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bacillus Thuringiensis

Phần II. Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bằng vi khuẩn Bacillus Thuringiensis11 1. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus Theringiensis11 2. Chu trình sống của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis12 2.1. Thể sinh dưỡng12 2.2. Nang bào tử13 2.3. Bào tử và tinh thể13 3. Độc tố và cơ chế lây nhiễm độc của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis14 3.1. Các loại độc tố của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis14 3.2. Cơ chế lây nhiễm độc của vi khuẩn Bacillus Thuringiensis17 4. Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn Bacillus Theringiensis18 Phần III. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học20 1. Sơ đồ khối quy trình sản xuất20 2. Thuyết minh quy trinh sản xuất21 3. Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình lên men23

MỤC LỤC Mục lục i Danh mục hình iii Danh mục bảng vi Mở đầu Phần I Tổng quan chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học Lịch sử phát triển ngành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 2 Thuốc trừ sâu sinh học 3 Đặc điểm chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học 3.1 Đặc điểm thuốc trừ sâu sinh học 3.2 Cơ chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học Các yếu tố ảnh hưởng tới chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học 4.1 Ảnh hưởng yếu tố vật lý 4.2 Ảnh hưởng yếu tố hóa học 5 Các loại thuốc trừ sâu sinh học phổ biến thị trường Phần II Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 11 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus Theringiensis 11 Chu trình sống vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 12 2.1 Thể sinh dưỡng 12 2.2 Nang bào tử 13 2.3 Bào tử tinh thể 13 Độc tố chế lây nhiễm độc vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 14 3.1 Các loại độc tố vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 14 3.2 Cơ chế lây nhiễm độc vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 17 Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus Theringiensis 18 Phần III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 20 Sơ đồ khối quy trình sản xuất 20 Thuyết minh quy trinh sản xuất 21 Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất trình lên men 23 Ưu, nhược điểm cách khắc phục thuốc trừ sâu Bt 24 4.1 Ưu điểm 24 4.2 Nhược điểm 24 4.3 Cách khắc phục 24 Phần IV Kết luận 25 Phần V Danh mục tài liệu tham khảo 26 Danh mục hình Hình 1.1 Thuốc trừ sâu bacilus 18WP Hình 1.2 Thuốc trừ sâu sinh học Vimatox 1.9EC Hình 1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Chichomix – DT Hình 1.4 Thuốc trừ sâu exin 2.0SC 10 Hình 1.1 Vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 12 Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus Thuringiensis với tinh thể (crystal) bào tử (spore) 13 Hình 2.3 Cơ chế tác động tinh thể độc với sâu 17 Danh mục bảng Bảng 2.1 Các nhóm tinh thể diệt côn trùng 17 Bảng 3.1 Một số môi trường thường sử dụng để nuôi cấy Bt 22 MỞ ĐẦU Trong thời kỳ công nghiệp hóa-hiện đại hóa , nước ta bước hoàn thiện để trở thành nước công nghiệp Tuy nhiên, với 75% dân số sống nông thôn, với 10 triệu canh tác, nông nghiệp ngành sản xuất chính, chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc dân Nước ta có nhiều điều kiện thuận lợi như: khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, mạng lưới sông ngòi chằng chịt, loại đất đa dạng phù hợp với nhiều loại trồng,… cung cấp cho nguồn nguyên liệu dồi nước xuất Để thu vụ mùa bội thu, việc phòng chống sâu bệnh khâu quan trọng chăm sóc trồng Từ năm 50 kỷ trước, người ta sử dụng thuốc trừ sâu hóa học tổng hợp từ clo photpho Tuy nhiên, năm gần đây, sử dụng loại thuốc gây ảnh hưởng to lớn đến xã hội sức khỏe người : sau thời gian sử dụng thuốc, không tiêu diệt hết sâu hại mà có nhiều thêm sâu hại quen dần có dấu hiệu “ nhờn thuốc ” Từ đó, tồn dư chất độc hại đất ngày cao, đất đai bị thoái hóa dần, dinh dưỡng bị cân đối, cân hệ sinh thái đất, hệ vi sinh vật đất bị phá hủy, dẫn đến tồn dư chất độc sản phẩm lương thực-thực phẩm, ảnh hưởng đến sức khỏe đến người vật nuôi: tình trạng bị ngộ độc thực phẩm tăng cao, sinh nhiều bệnh tật ảnh hưởng tới hệ sau Vì lý trên, nhóm chọn đề tài: “Công nghệ sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học” để làm tiểu luận PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Cùng với đa dạng trồng đa dạng sâu hại Việt Nam lớn Hằng năm, thiệt hại sâu khoảng 25-30%, chí có lên đến 40-50% Thành phần sâu hại khoảng 753 loài thuộc 99 họ 10 Để khắc phục tình trạng năm nước ta phải nhập 25.000 thuốc bảo vệ thực vật Năm 2004 nước ta có đến 436 loại hóa chất với 1231 tên thương phẩm khác nhau, trị giá khoảng 170 triệu USD Do sâu hại có khả kháng thuốc nên người trồng trọt thường tăng nồng độ sử dụng dẫn đến dư lượng thuốc trừ sâu sản phẩm tăng cao, gây an toàn cho người sử dụng, bất lợi môi trường, sức khỏe cộng đồng người trồng trọt Ngoài ra, sản phẩm xuất nên ảnh hưởng lớn đến thu nhập người nông dân Đây cách thức lớn cho người nông dân Việt Nam gia nhập WTO, mà phát triển ngành sản xuất thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật ngày mạnh giới nước ta Lịch sử phát triển ngành sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Trên giới, việc sử dụng vi sinh vật bảo vệ thực vật ngày phát triển manh mẽ, tìm nhiều chủng vi sinh vật có khả gây bệnh cho côn trùng Năm 1901, chủng vi sinh vật phát sử dụng để diệt sâu hại côn trùng vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) Ishwatari tìm thấy đầu tiên, ông đặt tên Bacillus sotto Đến năm 1911, loài vi khuẩn Ernst Berlinner phát đặt tên Bacillus Thuringiensis ông nghiên cứu tác nhân gây bệnh loài sâu xám tỉnh Thuringia, Đức Đến năm 1938, lần Bacillus Thuringiensis sử dụng làm thuốc trừ sâu Pháp Thập niên năm 1950, Bt sử dụng rộng rãi Mỹ Bt nghiên cứu ứng dụng rộng rãi nhiều quốc gia đem lại hiệu đáng kể ở: Hoa Kỳ, Liên Xô cũ, Pháp, Đức, Trung Quốc, Nhật Bản,… Ở nước ta, từ cuối thập kỷ 80 đầu thập kỷ 90, số quan nghiên cứu khoa học bắt đầu sản xuất chế phẩm diệt sâu từ Bt Hiệu lực chế phẩm Bt sản xuất nước sâu tơ, sâu xanh, sâu loại nhỏ tương ứng đạt 60%-100%, 12%-32%, 28%-100% Việc sử dụng chủng vi sinh vật có khả gây độc với côn trùng sâu hại vào công tác bảo vệ thực vật giới nước ta phát triển ngày mạnh mẽ, dần thay cho loại thuốc bảo vệ thực vật hóa học gây ô nhiễm môi trường gây độc cho động vật người Thuốc trừ sâu sinh học Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Chúng nuôi cấy môi trường dinh dưỡng khác theo phương pháp thủ công, bán thủ công phương pháp lên men công nghiệp để tạo chế phẩm có chất lượng cao, có khả phòng trừ loài sâu bọ gây hại trồng nông, lâm nghiệp Thuốc trừ sâu sinh học chia thành nhóm : − Nhóm vi sinh: thành phần thuốc bao gồm vi sinh vật sống nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng, chúng dạng bào tử hay nang thời gian định Các vi sinh vật phát triển ký sinh vật chủ gặp điều − kiện thuận lợi Ví dụ: thuốc trừ sâu Bt, nấm trichoderma,… Nhóm độc tố kháng sinh: thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) sinh học tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật, gồm chất gây độc (độc tố) chất tác động lên hoạt động sống tế bào (kháng sinh) Ví dụ: Kasugamycin, Streptpmycin, Avermectin, spinosad, − Nhóm thảo mộc: thuốc BVTV sinh học tạo trình tách chiết thực vật có hiệu lực cao phong phú nguồn nguyên liệu dồi Ví dụ: thuốc lá, bột tỏi, saponin… − Nhóm nguồn gốc sinh học khác: thuốc BVTV bào chế từ nguồn sinh học khác vỏ tôm cua (chitosan), axit amin từ thủy phân protein, dầu khoáng, … Đặc điểm chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học 3.1.Đặc điểm thuốc trừ sâu sinh học Ưu điểm: So với thuốc bảo vệ thực vật hóa học thuốc trừ sâu sinh học có - nhiều đặc điểm tốt là: Không gây độc hại cho người, động vật, trồng, có khả tiêu diệt cách chọn lọc loại sâu bệnh Do không gây độc hại người, lại không ảnh hưởng xấu phát triển khu hệ vi sinh vật quanh hệ rễ trồng, nên chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật không phá vỡ cân - hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường sống Việc sử dụng chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học bảo vệ thực vật chưa - phát thấy tượng lờn thuốc loài côn trùng Có thể chuyển gen chi phối việc tạo tính độc côn trùng gây hại sang cho nhiều loại trồng tạo nên trồng tự có khả kháng loài sâu hại Đây tác dụng mà chế phẩm thuốc trừ sâu hóa học không - thể có Khi phun thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật thiên nhiên, vi sinh vật chế phẩm có khả thích nghi cao, hội nhập vào tự nhiên cách thuận lợi để tham gia vào đấu tranh sinh học cách tích - cực Các vi sinh vật diệt côn trùng tồn điều kiện môi trường không thuận lợi (không vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt,…) nhiều dạng khác - Khả phát tán rộng tự nhiên giống vi sinh vật có ý nghĩa lớn việc tăng cường lây lan tạo thành dịch côn trùng, ưu điểm lớn thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật Nhược điểm: bên cạnh ưu điểm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật số hạn chế như: - Thuốc trừ sâu vi sinh có đặc hiệu cao nên phổ tác động hẹp Do để tiêu diệt nhiều loại côn trùng phải sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu virus, điều - không mang lại hiệu kinh tế Diễn biến chậm, gặp điều kiện thời tiết bất lợi khó đạt kết tốt Chịu tác động môi trường lớn ánh sáng, lượng nước tưới, - nước mưa, nhiệt độ,… Khó cân đong đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường 1-2 năm, - điều kiện lạnh, khô Giá thành cao Tuy nhiên với hạn chế nhỏ 3.2 hạn chế nhiều biện pháp khác Cơ chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học Các vi sinh vật diệt côn trùng nhiễm lên côn trùng nhiều cách khác nhau: đường tiêu hóa (ở vi khuẩn), sâu ăn phải có vi khuẩn, tinh thể độc với bào tử xâm nhập vào thể sâu qua đường tiêu hóa Khi vào ruột giữa, tinh thể độc hòa tan protease ruột hoạt hóa thành dạng có hoạt tính độc độc tính liên kết với tế bào biểu mô thành ruột, đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng, làm cân ion nội bào tế bào biểu mô làm cho chúng bị phân giải, ruột bị phá hoại, sâu chết Các yếu tố ảnh hưởng tới chế gây độc thuốc trừ sâu sinh học 4.1 ảnh hưởng yếu tố vật lý Nhiệt độ: Các chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học tương đối bền với nhiệt, giới hạn nhiệt độ mà chúng tồn tương đối rộng Chúng chịu nhiệt độ lên tới 90oC Độ ẩm: Khi dạng bào tử độ ẩm môi trường không ảnh hưởng nhiều tới chúng Khi dạng sinh trưởng độ ẩm có tác động lớn tới tác dụng gây độc thể côn trùng chúng Độ ẩm thích hợp cho chúng phát triển thể côn trùng sâu hại tùy thuộc vào chế phẩm, thường độ ẩm tốt nằm khoảng 70-85% Các yếu tố khác: Bên cạnh yếu tố nhiệt độ, độ ẩm ánh sáng, gió, mưa ảnh hưởng không nhỏ tới tác dụng chế phẩm Một số loại chế phẩm thường bị phân hủy tác dụng ánh sáng mặt trời với cường độ chiếu sáng cao Mưa tác dụng lớn tới phạm vi gây bệnh chế phẩm, phun chế phẩm gặp trời mưa dễ bị rửa trôi hiệu không cao 4.2 Ảnh hưởng yếu tố hóa học - pH: pH môi trường mà chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh vật tồn phát triển tốt môi trường kiềm bên thể côn trùng, sâu hại Khoảng pH tối thích tùy thuộc vào loại chế phẩm khác nhau, thông thường nằm khoảng pH=6,5 đến 7,5 tốt - Các yếu tố khác: Ngoài pH môi trường chế phẩm chịu tác động số chất có thuốc bảo vệ thực vật hóa học dùng số chất kích thích sinh trưởng khác Các loại thuốc trừ sâu sinh học phổ biến thị trường Hình 2.1 Thuốc trừ sâu bacilus 18WP 10 PHẦN II: SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BẰNG VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS Giới thiệu vi khuẩn Bacillus Theringiensis Bacillus Theringiensis (Bt) phát vào năm 1901 Ishwatari.S, lần phân lặp chủng vi khuẩn gây bệnh cho tằm đến năm 1961, Bt đăng ký loại thuốc trừ sâu an toàn với tổ chức EPA Ngày nay, hàng ngàn sản phẩm chủng sử dụng để tạo thuốc trừ sâu sinh học nhiều côn trùng gây bệnh khác Thuốc trừ sâu vi sinh Bacilluss Thuringiensis thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi khuẩn, phổ tác dụng diệt sâu rộng hữu hiệu lọai sâu sâu lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu ăn tạp… Sâu ăn phải thuốc ngừng ăn sau vài chết sau – ngày Bacillus Thuringiensis thuộc: • • • • • • • Giới: Autobacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Bacillales Họ: Bacillaceae Giống: Baciilus Loài: Thuringiensis Đặc điểm vi khuẩn Bacillus Theringiensis • • • • • Là trực khuẩn gram dương, hiếu khí không bắt buộc, kích thước 3-6µm Có dạng hình que, hình thoi chuỗi nhiều phân tử Có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng lẽ xếp thành chuỗi Sinh bào tử, kích thước khoảng 1,6-2µm Sinh trưởng tốt điều kiện nhiệt độ khoảng từ 12 °C-40°C; nhiệt độ tối ưu từ 27°C-32°C, nhiệt độ thấp sinh trưởng chậm; nhiệt độ cao từ 35°C-40°C, sinh trưởng nhanh chóng lão hóa • BT thích hợp với pH kiềm khoảng từ 6-8 14 Hình 3.1 Vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Chu trình sống vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Chu trình sống vi khuẩn Bt chia ba giai đoạn: thể sinh dưỡng, nang bào tử, bào tử tinh thể 2.1 Thể sinh dưỡng Thể sinh dưỡng dạng que, hai đẩu tù, kích thước 1,2-1,8µm x 3-5µm, bắt màu Gram dương nhuộm màu với thuốc nhuộm Lông mọc xung quanh động không động Chúng thường tồn cá thể hai cá thể liền Thể dinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang Trong thời kỳ sinh sản thường có 2, ,8… thể dinh dưỡng liền thành chuỗi Lúc vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều dễ nuôi cấy môi trường 15 2.2 Nang bào tử Khi thể vi khuẩn già, hai đầu thể hình thành bào tử hình bầu dục, đầu hình thành thể hình thoi Đó giai đoạn nang bào tử, giai đoạn nang bào tử hình trứng dài, to thể sinh dưỡng 2.3 Bào tử tinh thể Khi nang bào tử phát triển đến giai đoạn đó, chúng nứt ra, giải phóng bào tử tinh thể Kích thước bào tử 0,8-0,9µm x 2µm Bào tử dạng ngũ đề kháng với điều kiện môi trường bất lợi Chế phẩm vi khuẩn thường bảo quản dạng bào tử Tinh thể thường có kích thước thay đổi khoảng 0,6 x 2µm, hình thoi, có loại hình tròn, hình bầu dục tùy theo loài loại môi trường Tinh thể loại protein (chất diệt sâu) có hiệu chủ yếu Hình 2.2 Tế bào vi khuẩn Bacillus Thuringiensis với tinh thể (crystal) bào tử (spore) 16 Độc tố chế lây nhiễm độc vi khuẩn Bacillus Thuringiensis 3.1 Các loại độc tố vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Vi khuẩn Bt gây bệnh cho côn trùng qua đường tiêu hoá Bào tử nảy nầm đẫn đến sinh sản vi khuẩn thể vật chủ làm côn trùng chết, song yếu tố làm côn trùng chết nhanh chóng lại chất độc vi khuẩn sinh ra, chất độc tinh thể (Cry) mã hoá gen Cry khác (đây dấu hiệu dùng để phân loại nhóm Bt chất độc phân giải tế bào (Cry) có tác động riêng rẽ tổ hợp Cry làm tăng tác dụng tinh thể độc Nhóm chất độc Cry bao gồm ngoại độc tố (sản phẩm tiết vi khuẩn) α, β, γ - Ngoại độc tố α loại enzyme phospholipase tiết trước bào tử tinh thể độc hình thành, chúng có tác dụng gây nên phân huỷ mô thể côn trùng bị tác động - Ngoại độc tố β loại độc tố Bt nghiên cứu kỹ thuật Độc tố có tính bền nhiệt, tạo trước tinh thể độc hình thành Ngoại độc tố β có cấu trúc tương tự ATP, có tác dụng canh tranh với ATP, làm ức chế hoạt động ARN_polymerase Cùng với tinh thể độc, ngoại độc tố xâm nhập vào huyết tương côn trùng, đến quan làm tăng tính độc vi khuẩn vào thể côn trùng Hiệu ngoại độc tố β thể rõ đối tượng sâu non côn trùng chịu tác động, làm ngăn cản trình lột xác, gây dị thường trình phát triển sâu Tác dụng độc tố phụ thuộc vào liều lượng cách thức sử dụng để gây độc, thường gây độc qua tiêm cho hiệu mạnh qua đường tiêu hoá - Ngoại độc tố γ; độc tố loại phosphlipase tác động lên phostpholipid, làm phá huỷ mô tế bào sâu hại bị nhiễm Bt 17 So với nhóm độc tố trên, tinh thể độc Cry tạo với lượng lớn có hiệu gây độc cho côn trùng Tinh thể Cry gọi nội độc tố δ Tinh thể độc protein kết tinh có kích thước khác biệt tuỳ nhóm Ngoài thành phàn protein, tinh thể nhiều nguyên tố khác Ca, Mg, Fe, Si, Zn hay Al… Tinh thể độc bắt đầu tạo khởi đầu trình hình thành bào tử, dần tích luỹ từ protein tế bào có liên hệ mật thiết với màng bào tử kết tinh thành tinh tghể có nhiều dạng khác nhau, chủ yếu hình thoi Tinh thể không hoà tan nước, chất hữu (chloroform, ethanol, ester), tan dung dịch kiềm tinh thể ổn định dung dịch có phạm vi pH rộng (4-12), bị biến tính acid trichoaxetic, chlorua thuỷ ngân.Tuy nhạy cảm với nhiệt độ cao song có tính chịu nhiệt nhhất định (ở 65 oC giữ 1h, 80oC giữ phút) Độc tố δ gồm có vùng chức là: - Vùng I bó gồm chuỗi xoắn α Một vài tất chuỗi cài vào màng tế bào ruột, tạo lỗ, từ ion qua lại tự - Vùng II chứa dải β không song tương tự vùng gắn kháng nguyên globulin miễn dịch Vùng có vai trò gắn với thụ thể bề mặt tế bào biểu mô ruột - Vùng III có nhiệm vụ bảo vệ độc tố hoạt hoá không bị phân huỷ protease ruột Với cấu trúc phức tạp vậy, nội độc tố δ liên kết đặc hiệu với thụ thể màng tế bào biểu mô ruột sâu, gây rác động dây chuyền nêu Chính điều làm nên tính đặc hiệu cao hiệu tác động Bt lên sâu hại Do phổ tác dụng Bt tương đối hẹp, tuỳ loại tinh thể độc mà chủng Bt có tác dụng với loại sâu nhóm côn trùng chủ yếu thuộc Lepidoptera 18 Đã có 50 gen mã hoá cho protein tinh thể độc giải mã cho phép phân loại chất độc vào thành phần 15 nhóm dựa giống trình tự gen, nêu bảng sau: 19 Bảng 2.1 Các nhóm tinh thể diệt côn trùng Khối lượng Gen Hình dạng tinh thể CryI ( nhiều nhóm phụ: A(a),A(b), Hình thoi protein tinh thể (kDa) 130-138 A(c), B, C, D, E, F, G) Cry II (nhóm phụ : A, B, C) Đối tượng diệt Các ấu trùng cánh vảy Hình khối 69-71 Côn trùng cánh vảy, hai cánh Cry III (nhóm phụ : A, B, C) Hình phẳng 73-74 vô định Côn trùng cánh cứng hình Cry III (nhóm phụ : A, B, C) Hình thoi 73-134 côn trùng hai cánh Cry V- IX Đa dạng 35-129 Nhiều loài 3.2 Cơ chế lây nhiễm độc vi khuẩn Bacillus Thuringiensis Cơ chế tác động chung: côn trùng ăn phải tinh thể độc vòng từ 1-7h, pH máu- bạch huyết sâu tăng làm tê liệt đường ruột, khoang miệng có toàn thân sâu, làm thay đổi tính thấm thành ruột, gây tổn thương hệ thống điều hòa trao đổi chất sâu sâu bị chết yếu tố thúc đẩy tinh thể gây độc là: pH đường ruột côn trùng khả sinh enzyme phân giải protein đường ruột sâu Đa số loài vi khuẩn BT thành tế bào vi khuẩn bị phân giải hình thành bào tử tinh thể độc tế bào Khi bào tử tinh thể độc phóng thích vào môi trường riêng rẽ 20 Hình 2.3 Cơ chế tác động tinh thể độc với sâu Tùy theo loại côn trùng mà xuất chế tác động tinh thể độc: Sau ăn phải tinh thể độc từ 3-20p, ruột côn trùng bị liệt, pH máu tế bào bạch huyết tăng, pH ruột giảm chất kiềm máu thấm vào máu Các tế bào biểu mô ruột bị phá hủy Sau 1h, toàn thể sâu bị tê liệt Sau ăn phải tinh thể độc, sâu ngừng ăn ruột bị tê liệt pH máu va tế bào bạch huyết không tăng Sau 2-4 ngày sâu chết sâu non không bị tê liệt hoàn toàn Côn trùng ăn phải tinh thể độc kèm theo bào tử sau 2-4 ngày chết • • • • • không thấy tượng tê liệt Phản ứng sinh hóa vi khuẩn Bacillus Theringiensis Làm ngưng kết sữa Trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, mantose hình thành acid Có phản ứng dương với methyl đỏ Có tác dụng hòa tan môi trường huyết ngựa agar Có thể mọc muối xianat, khử muối nitrate thành nitrit, khử muối sulphat, sản sinh emzyme phospholypase 21 PHẦN III: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Sơ đồ khối quy trình sản xuất Giống gốc Chuẩn bị môi tường Khử trùng môi trường Sản xuất giống cấp Thổi khí Sản xuất giống cấp Lên men khoảng 4872h; pH=7,5; nhiệt độ 30°C Lọc ly tâm Thu sinh khối Hoàn thiện chế phẩm: -Bổ sung phụ gia -sấy khô -đóng gói bảo quản 22 Thuyết minh quy trình sản xuất  Giống để sản xuất chế phẩm Bt vi khuẩn Bacillus Theringiensis, có đặc điểm sau: • Có độc tính diệt sâu cao tác dụng tinh thể độc rộng thời gian tồn lâu • Tốc độ sinh trưởng mạnh, có khả tạo nhiều tinh thể độc • Lên men nguồn cacbon khác đạt tốc độ lên men nhanh • Thích nghi tốt với điều kiện không thuận lợi môi trường, đặc biệt có tác dụng gây độc côn trùng sâu hại nhanh mạnh • Giống nhân lên sau cấp gấp khoảng 10-15 lần giống cũ  Chuẩn bị môi trường: Môi trường thường sử dụng để nuôi cấy Bt bao gồm thành phần sau: • Nguồn cacbon tinh bột maltose, glucose Nếu tinh bột thường dùng gạo, ngô, sắn,…Tinh bột qua giai đoạn thủy phân tạo đường đơn đường đôi sử dụng amylase H2SO4 điều kiện nhiệt độ cao để thủy phân • Nguồn N: thường sử dụng bột cá, bột ngô, bột banh lạc, bột bánh đậu, cao thịt bò, peptone, bột men, … • Muối vô thường bổ sung vào muối sau: K2HPO4, MgSO4, CaCO3 Môi trường sau trộn lẫn thành phần trải qua giai đoạn dịch hóa Sau bảng số thành phần môi trường dùng nuôi cấy Bt thường dùng: 23 Bảng 3.1 Một số môi trường thường sử dụng để nuôi cấy Bt Tên nước Mehico Thành phần môi trường Tên tác giả Rỉ đường, bột đậu tương, bột ngô, Roldan Cs, 1998 CaCO3 + nước Hàn Quốc Bột cá, đậu tương, cám đổ, bã vừng, Yoon Cs, 1987 gạo, cám Trung Quôc Cám lúa mì, chấu, bột chanh, bánh Hussey, 1981 – Wang Tao, đậu tương, loại dầu bánh hạt 1998 loại dầu, cám lúa mì bột ngô Nigieria Brazil Bột sắn lên men, ngô, đậu đũa Ejiofar & Okager, 1989 Phụ phẩm công nghiệp giấy Moscardi, 1988 gỗ, thêm tinh bột tan Ấn Độ Bột chanh bột đậu tương thêm Mummgatti tinh bột tan rỉ đường Raghunathan, 1990  Khử trùng: Sau chuẩn bị môi trường xong nên khử trùng với chế độ khử trùng sau: • Khử trùng phương pháp gián đoạn: tiến hành áp suất dư 0.05-0.1Mpa với nhiệt độ từ 110-1200C vòng – 1,5 • Hoặc khử trùng liên tục: tiến hành nhiệt độ cao 140-145 thời gian ngắn 5- 15 phút  Lên men: Tiến hành nồi lên men có dung tích 500l, 1000l, 2000l , điều kiện nhiệt độ từ 27-320C điều chỉnh pH =7,5 khoảng thời gian từ 48-72h Trong trình lên men tiến hành thổi khí  Chế độ thổi khí: Đây tiêu cho trình hình thành bào tử tinh thể độc Ngưỡng thổi khí tốt trình lên men 0,5-0,6m môi trường/m3 không khí Nếu chế độ thổi khí mức thấp bào tử phát triển yếu, mật độ thưa, 24 chế độ thổi khí mức cao bào tử phát triển nhanh thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố nhỏ, hiệu diệt sâu không cao, nên chế độ thổi khí hợp lý  Sau lên men 48-72h ta tiến hành tách sản phẩm cách lọc ly tâm lạnh 4000 vòng/phút, thu kết tủa sau bổ sung thêm số chất định hình bảo quản đem sấy khô điều kiện thường chân không nhiệt độ 50-65oC 1h, 70-80oC vòng 20 phút, độ ẩm giảm xuống từ 3-5% đạt  Ở bước hoàn thiện sản phẩm, sản phẩm đóng gói, chế thành dạng chế phẩm khác Hiệu phòng trừ chế phẩm Bt không hoàn toàn định thành phần hoạt tính chế phẩm mà dạng chế phẩm nhân tố quan trọng dạng chế phẩm Bt bao gồm dạng nước, dạng bột, dạng bột thấm nước, dạng nang keo Mỗi dạng chế phẩm có hiệu diệt sâu khác tùy thời điểm đối tượng diệt Các điều kiện ảnh hưởng tới hiệu suất trình lên men Ảnh hưởng nhiệt độ: nhiệt độ có ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử Nếu nhiệt độ cao thấp kéo dài rút ngắn trình lên men, trình lên men phải điều chỉnh nhiệt độ (nhiệt độ thích hợp 30°C) Các chế độ luân chuyển giống: tiêu làm ảnh hưởng tới hình thành bào tử tinh thể độc Nếu sử dụng giống liên tục, xảy tượng nhiễm thực khuẩn thể Cho nên, bình thường lên men khoảng 10-15 lần giống cũ cần phải thay đổi gống Như khắc phục tượng phân đốt, tượng tạo bào tử, tinh thể độc Ảnh hưởng độ pH: vi khuẩn Bt thích hợp môi trường kiềm pH=7, điều kiện pH = 8,5 hình thành bào tử, pH =5 không hình thành bào tử Ảnh hưởng oxi: vi khuẩn loại hiếu khí, phải có đủ oxi sinh trưởng tốt, hình thành bào tử Nếu thiếu oxi không hình thành bào tử hình thành chậm Lượng oxi thường cung cấp cho trình lên men 0,5-0,6m môi trường/m3 không khí tốt Ưu, nhược điểm cách khắc phục thuốc trừ sâu Bt 25 4.1 Ưu điểm Không gây ô nhiễm môi trường Bt có hiệu lực cao sâu kháng loại thuốc gốc lân, carbamat,… Tinh thể độc Bt tạo hoà tan dịch dày người nên thuốc trừ sâu sinh học Bt hoàn toàn vô hại người, sinh vật khác Không độc với cá, ong mật loài thiên địch Thời gian cách ly ngắn 4.2 Nhược điểm Chỉ diệt sâu non chúng ăn lá, không diệt trứng, nhộng bướm Dễ bị phân huỷ tia cực tím có ánh mặt trời Có tác động vi độc, không nội hấp, không tiếp xúc Hạn chế lớn thuốc trừ sâu Bt phát tác chậm, 48 tiếng sau ăn độc tố sâu chết 4.3 Cách khắc phục Nên ý phun sớm trồng bị sâu phá hại, thích hợp sâu non từ đến ngày tuổi Do sâu thường gối lứa nên sau phun 5-7 ngày, cần thiết phải phun lại lần để diệt sâu non nở Nên phun thuốc vào lúc chiều mát, lúc sâu dễ dàng trúng độc thường bò lên ăn vào ban đêm Tránh phun thuốc trời nắng gắt mưa Sau tưới phun thuốc ngày sau tưới trở lại Không sử dụng thuốc trừ sâu Bt dâu dùng nuôi tằm Cần phun ướt hai mặt mặt phận mà sâu thích ăn, thêm mật rỉ đường để tăng bám dính hiệu diệt sâu cao PHẦN IV: KẾT LUẬN Hiện với xu phát triển bền vững vừa tạo suất hiệu cao vừa đảm bảo an toàn môi trường, sản phẩm công nghệ ưu tiên phát triển Sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học đáp ứng yêu cầu trên, xem giải pháp cho phát triển bền vững Hơn Việt Nam có tiềm lớn nguồn tác nhân sinh học phòng trừ sinh học sâu hại thiên nhiên Chính việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật vi sinh vật hướng đắn cho phất triển nông nghiệp Việt Nam bảo vệ môi trường Điều giúp 26 làm giảm giá thành sản phẩm, để ứng dụng rộng rãi nhằm bảo vệ sức khỏe cho nhân dân, tăng thu nhập cho nông dân kinh tế hội nhập cải thiện chất lượng môi trường 27 PHẦN V: DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2007), Công nghệ vi sinh môi trường, Nhà xuất giáo dục http://123doc.org/document/2275382-san-xuat-thuoc-tru-sau-sinh-hoc-bt-tuvi-khuan-bacillusthuringiensis.htm?page=7 [ngày 10, tháng 10, năm 2016] http://kiemtailieu.com/nong-lam-ngu/tai-lieu/bao-cao-chuyen-de-thuoc-trusau-vi-sinh-bt/50.html [ngày 13, tháng 10, năm 2016] 28