ứng dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bt( bacillus thuringiensis var )

ứng dụng chế phẩm sinh học trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học bt( bacillus thuringiensis var )

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG

ĐỀ TÀI:

ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC Bt

(Bacillus thuringiensis)

GVHD: Phạm Minh Tuấn

NHÓM 3

TP.HCM, THÁNG 6 NĂM 2012

MỞ ĐẦU

Hiện nay, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh caovới việc sử dụng ngày càng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học vàhàng lọat các biện pháp như trồng lúa 3 vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… vớimục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng Chính vì vậy, với sự canh tác trên

đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinhthái trong đất, hệ vi sinh vật trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngàycàng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hạikhông dự báo trước

Chính vì vậy, xu hướng quay trở lại nền nông nghiệp hữu cơ với việc tăng cường sử dụngchế phẩm sinh học, phân bón hữu cơ trong canh tác cây trồng đang là xu hướng của ViệtNam nói riêng và thế giới nói chung Hiện các chế phẩm đang được sử dụng nhiều tại cácvùng trồng rau sạch ở Đà Lạt, Vĩnh Phúc, Thanh Trì, Hải Dương, Hà Tây, ĐôngAnh của Việt Nam

Nhiều thập kỉ qua, thuốc hóa học bảo vệ thực vật (BVTV) đã phát huy được tác dụngtích cực trong việc phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ cây trồng, tuy nhiên nó cũng gây ra nhữngtác dụng không mong muốn như ảnh hưởng xấu đến môi trường sống, ô nhiễm lươngthực, thực phẩm, gây ngộ độc chết người Do vậy, việc sử dụng các tác nhân sinh họcnhư virut, vi khuẩn, vi nấm hay các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học mạnh đểphòng trừ sâu bệnh cho cây trồng là rất hữu ích và cần thiết, trong đó thuốc trừ sâu visinh đã và đang được lựa chọn Trong đó thuốc trừ sâu BT thuộc nhóm thuốc trừ sâu visinh nó có nhiều ưu điểm đối với cây trồng và an toàn đối với môi trường được nhiềungười lựa chọn

MỤC LỤC

I TỔNG QUAN 4

1.1 Giới thiệu chung về thuốc trừ sâu 4

1.2 Thuốc trừ sâu sinh học 5

1.2.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học 5

1.2.2 Phân loại thuốc trừ sâu sinh học 6

1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Bt 6

1.3.1 Lịch sử 6

1.3.2 Phân loại 8

1.3.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) 8

1.3.4 Đặc điểm tinh thể độc và cơ chế tác động của vi khuẩn Bacillus thuringenisis 10

1.3.5 Tính an toàn của thuốc sinh học Bt 15

II QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU BT 18

2.1 Tuyển chọn chủng 18

2.2 Lên men 18

2.3 Thu hồi sản phẩm và tạo chế phẩm kỹ thuật 20

2.4 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 21

2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành tinh thể Cry 22

III ƯU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC BT 23

3.1 Ưu điểm 23

3.2 Hạn chế và cách khắc phục 23

IV KẾT LUẬN 25

I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về thuốc trừ sâu

Đa số những thuốc trừ sâu dùng trong sản xuất nông nghiệp đều là những chất hữu cơtổng hợp Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, thuốc trừ sâu Pyrethroid (Cúc trừ sâu tổng hợp),thuốc điều hoà sinh trưởng côn trùng, (như Atabron, Nomolt…), thuốc trừ sâu Cacbamat,

và các hợp chất hữu cơ khác (Padan, Trebon, Confidor, Regent,…) Một số loại thuốc trừsâu không phải là những hợp chất hoá học do con người tổng hợp ra, chúng là những chếphẩm chứa những vi sinh vật hoặc những độc tố do vi sinh vật tạo ra có tác dụng trừ sâu:Bacterine, Xentari, NPV, Beauverine,… Ngoài ra có một số thuốc trừ sâu có nguồn gốcthực vật: Fortenone (Rotenone) chế từ rễ cây ruốc cá, thuốc trừ sâu Nimbecidine chế từhạt cây Neem (Xoan Ấn Độ) Thuốc trừ sâu thường tác động đến sâu hại ở giai đoạn sâunon (ấu trùng) Sâu non ở tuổi càng nhỏ càng dễ mẫn cảm với thuốc, dễ bị thuốc gây độc.Trưởng thành của nhiều loại sâu hại cũng dễ bị thuốc gây độc (rầy nâu, bọ xít, bọ cánhcứng, …)

Thuốc trừ sâu thường ít có hiệu quả đối với giai đoạn nhộng Đa số các thuốc trừ sâu tổnghợp hữu cơ tác động đến hệ thần kinh côn trùng, có tác động tiếp xúc, vị độc, và cả xônghơi, diệt côn trùng tương đối nhanh: Thuốc trừ sâu lân hữu cơ, Cacbamat, cúc trừ sâu, …Một số thuốc trừ sâu có tác động chủ ngăn cản sự lột da của sâu non và ấu trùng và hiệulực trừ sâu thể hiện chậm hơn: Atabron, Nomolt, Applaud…

Có loại thuốc trừ sâu lại tác động chủ yếu đến hệ tiêu hoá, phá huỷ vách ruột côn trùng:Thuốc trừ sâu BT

Thuộc về nhóm thuốc trừ sâu còn có những hợp chất tuy không gây độc trực tiếp cho sâuhại nhưng lại góp phần hạn chế đáng kể tác hại của chúng đến mùa màng, chất dẫn rụMethyl Eugenol không gây độc trực tiếp cho côn trùng nhưng có tác dụng thu hút nhiềuloại ruồi đục trái cây từ xa di chuyển đến nơi có phun thuốc khiến cho số lượng côn trùng

bị nhiễm độc tăng cao (bẫy ruồi đục quả Vizubon D), từ đó mà làm tăng hiệu quả của

thuốc trừ sâu Hoặc việc sử dụng những bẫy Pheromone trên đồng ruộng vào thời điểmcôn trùng trưởng thành ra rộ sẽ ngăn cản sự ghép cặp để giao phối của chúng, khiến chochúng không sinh sôi phát triển được Sự hiểu biết về cơ chế tác động của thuốc trừ sâuđến sâu hại là cơ sở xây dựng kế hoạch dùng luân phiên thuốc trừ sâu trên các ruộngvườn chuyên canh nhằm ngăn ngừa hoặc khắc phục hiện tượng kháng thuốc của sâu hại.Tính độc của thuốc trừ sâu đối với người và động vật có ích thay đổi nhiều tuỳ theo nhómthuốc, loại thuốc, dạng thành phần Có những thuốc rất ít độc với người và động vật máunóng: BT, Applaud, Nomolt, … chúng được khuyến khích sử dụng trừ sâu trên rau xanh,trái cây, … có những thuốc có độ độc cấp tính tương đối cao đối với người và động vậtmáu nóng: Methomyl, … lại có những thuốc có tính độc cao với ong hoặc đối với cáhoặc đối với thiên địch của sâu hại: Thiodan, …

1.2 Thuốc trừ sâu sinh học

1.2.1 Giới thiệu về thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học là những chế phẩm sinh học được sản xuất ra từ các loại thảodược hay các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhautheo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo

ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ được các loại sâu, bọ gâyhại cây trồng nông, lâm nghiệp

Thật ra các loại thuốc trừ sâu sinh học đã được bà con nông dân sử dụng từ lâu đời nhưmột kinh nghiệm sống Ví dụ như: lá sầu đâu (xoan đào), cây thuốc cá, mủ đu đủ, mủxương rồng, mủ vú sữa đã được bà con sử dụng từ bao đời nay để diệt sâu bọ, cua, ốccắn phá cây trồng Tuy nhiên, việc sử dụng các loại cây, lá trên để diệt trừ sâu bọ gây hạiđòi hỏi rất nhiều công sức và thời gian Để khắc phục khó khăn đó, các nhà khoa học trênthế giới đã đầu tư nghiên cứu để chiết xuất ra các hoạt chất, tạo thành một dòng các sảnphẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học, chủ yếu là trừ sâu, trừ nấm bệnh vàkích thích sinh trưởng như khuẩn Bacillus thuringiensis (BT), nấm Trichoderma, hoạtchất Azadirachtin, bột neem (chiết xuất từ cây neem - xoan đào), Karanjin - chiết xuất từcây hoa đào Ấn Độ, Matrine - chiết xuất từ cây khổ sâm, Saponin - bã trà, abamectin,

emamectin benzoate và hoạt chất được sản xuất để diệt trừ sâu, bọ mới đây nhất là hoạtchất Methylamine avermectin.

1.2.2 Phân loại thuốc trừ sâu sinh học

Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học Thành phầngiết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và cácchất do vi sinh vật tiết ra (thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (làchất độc hoặc dầu thực vật) Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chiathành hai nhóm chính là:

- Nhóm thuốc vi sinh: Thuốc trừ sâu vi sinh bao gồm một vi sinh vật (ví dụ: vi khuẩn,nấm, virút hoặc động vật nguyên sinh) như thành phần hoạt hóa Thuốc trừ sâu vi sinh cóthể kiểm soát nhiều loài gây hại khác nhau mặc dù mỗi hoạt chất đặc hiệu cho mỗi loàigây hại mục tiêu của nó Ví dụ: có những loại nấm kiểm soát một số loại cỏ dại, và nhữngloại nấm khác tiêu diệt được một số loại côn trùng Các loại thuốc trừ sâu vi sinh được sửdụng nhiều nhất là những loài phụ và những chủng của Bacillus thuringiensis, hay Bt

- Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây cỏ hoặc dầuthực vật

1.3 Thuốc trừ sâu sinh học Bt

1.3.1 Lịch sử

Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát hiện một loài vikhuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus bombycis Sau đó vào năm 1911, nhàcôn trùng học người Đức là Berline đã phát hiện loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ởThuringia vùng Địa Trung Hải và đặt tên là Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt) Sau đóđến khoảng giữa thế kỷ 20, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt ký sinh trên nhiều loàisâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông Từ đó vi khuẩn Bt đã được chế tạothành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệthuốc trừ sâu sinh học

Bt lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1901 tại Nhật Bản bởi nhà sinh vật học ShigenteIshiwarti, khi ông tìm ra nguyên nhân gây ra cái chết đột ngột của một số sâu tơ ShigenteIshiwarti đầu tiên phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gọi đó là Bacillus Sotto Năm

1911, Bernard - người Đức, tìm thấy trong một xưởng bột mì ở Thuringia, một giống vikhuẩn ký sinh trong cơ thể côn trùng, có sức trừ sâu rất mạnh, gọi là khuẩn Thuring

1971, chế phẩm Bt đã được nghiên cứu

Với những thành tựu của di truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã phát hiệnnhiều chủng Bt có khả năng ký sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm có hàm lượngđộc tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ tác dụng trên nhiềuloài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu khác nhau Đã xác định có tớitrên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng Bt, trong đó bao gồm hầu như toàn bộ các loàisâu hại có ở Việt Nam

Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ sâu sinhhọc trên thế giới cũng như ở nước ta Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu, hiện nay người

ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt ghép vào hệ thống gen của cây để tạo ra các giốngcây kháng sâu như giống bông kháng sâu xanh, giống lúa kháng sâu đục thân, sâu cuốn

lá, giống ngô kháng sâu…

Ở Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis var.) đã được nghiên cứu từ năm 1971.

Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm vàngoài đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâuxám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo

Các lọai sản phẩm thương mại có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP,16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc

Hình 1 Sản phẩm Bt trên thị trường 1.3.2 Phân loại

Thuộc nhóm trừ sâu sinh học, có nguồn gốc vi sinh vật (Bacillus thuringiensis var.) , phổ

diệt rộng và hữu hiệu với các lọai sâu như sâu cuốn lá, sâu tơ, sâu xanh, sâu khoang, sâu

ăn tạp …

Có nhiều loại thuốc Bacillus thuringiensis trên thị trường thế giới như:

- Bacilus thuringiensis var aizawai kiểu serotype, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể, chếbiến thành dung dịch đặc, dùng trừ ấu trùng mọt hại kho tàng

- Bacillus thuringiensis var israelensis (tên khác: Teknar) hoạt chất ở dạng tinh thể endotoxin tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var israelensis, Serotype(H-14) Thuốc được gia công ở nhiều dạng như dung dịch, bột thấm nước dùng trừmuỗi, ấu trùng ruồi

ô Bacillus thuringiensis var kurstaki (tên khác Bakthane, Agritol, Bactospeine plus,Biotrol ), hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxin được tạo thành qua lên menBacillus thuringiensis Berliner, var kurstaki, Serotype H-3a 3b Thuốc được gia côngthành nhiều dạng như bột thấm nước, sữa huyền phù, dung dịch đặc dùng trừ ấu trùng

bộ Lepidoptera như sâu khoang, sâu tơ, sâu xanh và nhiều loại sâu khác hại rau, màu vàcây ăn trái

- Bacillus thuringiensis var morrisoni, hoạt chất ở dạng bào tử và tinh thể ô-endotoxinđược tạo thành qua lên men Bacillus thuringiensis Berliner var morrisoni, serotype 8a 8b.Thuốc được gia công thành dạng bột khô tan trong nước và bột thấm nước, dùng trừ ấutrùng bộ Lepidoptera hại rau, màu, cây ăn trái, cây cảnh, cây công nghiệp

- Bacillus thuringiensis var San Diego (tên khác: Myx 1850), dùng để trừ bọ cánh cứngcho khoai tây, cà chua, cây xanh

1.3.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt)

Bacillus thuringiensis, là loài vi khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức

Ở Việt Nam trong số 185 mẫu đất, bùn thu thập ở Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Thái Bình, Hải Dương, Hưng Yên, Ninh Bình đã phân lập được 920 chủng Bacillus với đặc điểm Gram +, hình que, bào tử không phình Chỉ có 295 chủng trong số đó có tinh thể hình tròn, tháp đôi, hình kim Các chủng Bacillus có tinh thể được phân loại thành loài Bacillus thuringiensis (Bt)

Bt có trong các mẫu đất ruộng, đất vườn, bùn nước, ao hồ… Hình dạng tinh thể (một trong những đặc điểm quan trọng để phân loại Bt thành loài phụ) rất đa dạng Phần lớn các chủng Bt phân lập có dạng tinh thể hình tháp đôi , một số hình cầu và một số chủng

có tinh thể với các hình dạng khác nhau

Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram dương (không mất màunhuộm khi tẩy bằng iôt và cồn, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bàođứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể độc có khả năng diệt sâu

Bt phát triển trong điều kiện nhiệt độ 15-45 0C nhưng thích hợp nhất 29-30 0C Bào tửdạng hình oval, hình trứng dài 1,2 – 1,6 µm

Hình 2 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Hình 3 Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Trưởng thành mỗi tế bào vi khuẩn có một bào tử hình trứng và một tinh thể độc hình quảtrám

Hình 4 Tế bào vi khuẩn Bt với tinh thể (crystal) và bào tử (spore)

a Đặc điểm tinh thể độc

Dựa vào cơ chế tác động diệt côn trùng người ta xác định có 4 loại độc tố:

- Nội độc tố endotoxin, còn gọi là tinh thể độc crystal: cry I, cry II, cry III, cry IV

Hầu hết là các chủng Bt có một hoặc nhiều gen tiền độc tố Cơ sở gây bệnh cho côn trùngchính là các gen Cry khác nhau Gen Cry được chia thành 4 lớp chính: Cry I, II, III, IV.+ Gen Cry I: Thường tổng hợp các Protein hình thoi gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vẩy.+ Gen Cry II: Tạo tinh thể dạng hình tháp gây bệnh cho côn trùng bộ cánh vẩy và côntrùng bộ 2 cánh Ví dụ như gen Cry IIA gây bệnh cho loài Lymantria dispa, Cry IIBHelicoverpa armigera

+ Gen Cry III: Tổng hợp tinh thể dạng hình thoi, gây bệnh cho côn trùng bộ cánh cứngColeoptera

+ Gen Cry IV: Tổng hợp cả tinh thể dạng hình thoi và hình tháp, chỉ gây bệnh cho côntrùng bộ 2 cánh Diptera

Hình 4: Pansy peacock Hình 5: Diaethria

Hình 6: Helicoverpa armigera Hình 7: Lymantria dispa

Hình 8 Bộ cánh cứng Coleoptera

Hình 9 Bộ 2 cánh Diptera

Năm 1955, C.L Hannay và P.C Fitz James xác định được bản chất protein có liên quanđến độc tính của vi khuẩn Tinh thể độc của Bt có dạng hình thoi, hình quả trám, hìnhtháp mang bản chất Protein và có độc tính cao với rất nhiều loại côn trùng, chiếm 30%trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm xanh metylen hoặc fusin đỏ thì độc tố bắt màudưới kính hiển vi đối pha tinh thể độc Tinh thể độc rất bền vững ở nhiệt độ cao, có trọnglượng phân tử là 5000 đơn vị và không phải bào tử nào cũng có tinh thể độc Trong quátrình bảo quản nếu để lâu Bt sẽ mất hoạt tính do tinh thể độc bị biến dạng hoặc phân huỷ.Chất focmandehit 20% và tia tử ngoại có thể làm mất hoạt tính của tinh thể độc.

Hình 10 Bào tử Bt và tinh thể độc

Bản chất hóa học của tinh thể: trong tinh thể độc có nhiều loại acid amin, trong đó có hailoại có tỉ lệ cao nhất là acid glutamic và acid asparaginic Trong tinh thể có chứa lượngkhá lớn 5 nguyên tố C, N, H, O, S Ngoài ra còn chứa 19 nguyên tố khác nhưng không có

P Các phân tử có khối lương lớn thì có độc tính còn loại có phân tử lượng nhỏ thì không

có độc tính

Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố ở dạng hòa tan, chẳng hạn tinh thể B.thuringensis sotto ở 65oc sau 1 giờ vẫn còn hoạt tính trong khi các dạng khác sẽ mất hoàntoàn độc tính

- Ngoại độc tố (anpha) exotoxin, còn được gọi là phospholipaza Thực chất đây là mộtloại men liên quan đến sự phân hủy phospholipit dẫn đến côn trùng chết

- Ngoại độc tố (beta) exotoxin, còn gọi là ngoại độc tố bền nhiệt Chúng có khối lượng phân tử thấp (707-850) Sau 15 phút ở 120oc vẫn còn hoạt tính Chúng tác động lên côn