Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit thử định lượng bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương pháp diazo hóa

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA [ \ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ Niên khóa 2008 - 2010 TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2010 Luận văn thạc sĩ CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM BỆNH VIỆN QUẬN TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: PGS-TS TRẦN THANH NHÃN Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ tại: HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 22 tháng 07 năm 2010 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc oOo TP HCM, ngày 22 tháng 07 năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG Ngày, tháng, năm sinh : 19/09/1981 Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học Giới tính : Nữ Nơi sinh : TP.HCM MSHV : 03108149 I - TÊN ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HOÁ BỘ KIT THỬ ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRỰC TIẾP TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DIAZO HÓA II - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: − Xây dựng quy trình sản xuất kit thử định lượng Bilirubin trực tiếp huyết phương pháp Diazo hóa − Khảo sát độ đúng, độ xác, độ tuyến tính kit với huyết kiểm tra − Kiểm tra độ ổn định kit phương pháp dài hạn phương pháp già hóa cấp tốc để dự đoán hạn sử dụng kit − Sử dụng kit thử xét nghiệm có so sánh thống kê với kit ngoại nhập sử dụng III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 12 năm 2009 IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2010 V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS-TS TRẦN THANH NHÃN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chun ngành thơng qua TRƯỞNG PHỊNG ĐÀO TẠO SĐH TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH (Họ tên chữ ký) Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Thầy hướng dẫn tôi: PGS-TS Trần Thanh Nhãn - Cô chủ nhiệm tôi: TS Nguyễn Thúy Hương - Quý Thầy Cô môn Công nghệ sinh học – trường Đại học Bách khoa TP.HCM - Gia đình tôi, - Quý đồng nghiệp, - Bạn bè học lớp cao học 2008 Xin cảm ơn tất giúp hoàn thành luận văn tốt nghiệp ! Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ TÓM TẮT Đề tài luận văn “Xây dựng quy trình sản xuất tiêu chuẩn hóa kit thử định lượng Bilirubin trực tiếp huyết phương Diazo hóa” thực với mục tiêu ứng dụng phần mềm vi tính (Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel) kết hợp với thực nghiệm để thiết kế tối ưu hóa cơng thức pha chế kit định lượng Bilirubin trực tiếp Thành phần công thức tối ưu kit: nồng độ acid sulfanilic = 49,3252 mmol/L, Natri nitrit = 73,3275 mmol/L Từ công thức tối ưu xây dựng, tiến hành pha chế để kiểm tra độ ổn định kit theo thời gian phương pháp già hóa cấp tốc, từ dự đốn hạn sử dụng kit.Thời hạn sử dụng kit dự đoán 62 tháng kể từ pha chế điều kiện bảo quản mát từ – 0C Bên cạnh đó, sử dụng kit để định lượng nồng độ Bilirubin trực tiếp huyết 217 lượt bệnh nhân 30 mẫu huyết nội kiểm tra khoa xét nghiệm bệnh viện Quận 4-TP.HCM có so sánh thống kê kết với kit ngoại nhập (ISE - Ý) sử dụng Kết đề tài góp phần tạo dòng sản phẩm nội địa lĩnh vực xét nghiệm, nhằm hạ giá thành sản phẩm giảm chi phí cho bệnh nhân Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ Abstract The project, make a manufacturing process and standardization bilirubin direct quantitative of a kit in serum by diazo method, is performed towards applying the software such as Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel to design and be optimum mixing formular for bilirubin direct quantitative kit by diazo method Ingredients of optimum formular of a kit include: concentration of acid sulfanilic = 49,3252 mmol/L, concentration of Natri nitrit = 73,3275 mmol/L Based on the optimum formular, we prepare medicines to test the stable kit by real time method and by aging method so that we can predict a expiry date of the kit The predicted expiry date of the kit is 62 months from the manufacture date at – 80C On the other hands, we use this kit to determine the bilirubin direct quantitative in serum of 217 patients and serum of 30 IQC (Internal Quality Control) at biochemistry department of district hospital at Ho Chi Minh City And then we compare to imported kit (ISE - Italy) are using at our hospital The result of this project is a foundation for manufacturing research to other biochemical kits in Vietnam, and this result also contributes to create the series of domestic products in test field Therefore we can reduce the product price and lighten the expense of patient Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ NHIỆM VỤ LUẬN VĂN LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT MỤC LỤC Chương MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan bilirubin 2.1.1 Cấu trúc hóa học bilirubin 2.1.2 Chuyển hóa bilirubin 2.1.2.1 Tạo biliverdin 2.1.2.2 Tạo bilirubin 2.2 Bệnh lý liên quan 11 2.2.1 Chỉ số bilirubin người bình thường 11 2.2.2 Thay đổi sinh lý 11 2.2.2.1 Bilirubin gián tiếp tăng 11 2.2.2.2 Bilirubin trực tiếp tăng 11 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ 2.2.2.3 Một số hội chứng rối loạn chuyển hóa bilirubin di truyền 12 2.2.2.4 Các thể vàng da 14 2.3 Các phương pháp định lượng bilirubin huyết 15 2.3.1 Phương pháp diazo hóa 15 2.3.1.1 Lịch sử phát triển 15 2.3.1.2 Nguyên tắc 15 2.3.2 Các phương pháp định lượng khác 17 2.3.2.1 Phương pháp enzym 17 2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp 17 2.3.2.3 Phương pháp đo bilirubin xuyên da 18 2.3.3 Ưu nhược điểm phương pháp định lượng bilirubin 19 2.3.4 Các quy trình tham khảo 19 2.4 Thiết kế tối ưu hóa cơng thức 21 2.4.1 Thiết kế mơ hình thực nghiệm 21 2.4.1.1 Mơ hình cơng thức (formulation designs) 22 2.4.1.2 Mơ hình quy trình (process designs) 22 2.4.1.3 Mơ hình kết hợp (combined designs) 22 2.4.2 Nghiên cứu liên quan nhân 23 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ 2.4.3 Tối ưu hóa cơng thức 23 2.4.4 Ứng dụng phần mềm vi tính 24 2.4.4.1 Các phần mềm thông minh 24 2.4.4.2 Cấu tạo phần mềm thông minh 27 2.4.4.3 Ứng dụng phần mềm thông minh 29 2.5 Thẩm định quy trình định lượng 30 2.5.1 Miền giá trị - khoảng tuyến tính 30 2.5.1.1 Khảo sát khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer 30 2.5.1.2 Sự lệch khỏi định luật Beer 30 2.5.1.3 Miền giá trị (khoảng tuyến tính) 31 2.5.2 Xây dựng phương trình hội quy tuyến tính 31 2.5.2.1 Cơng thức tính hệ số hồi quy 32 2.5.2.2 Phương sai tái 32 2.5.2.3 Kiểm định có nghĩa hệ số hồi quy theo Student 32 2.5.2.4 Kiểm định tương thích mơ hình với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher 33 2.5.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng 33 2.5.4 Độ đặc hiệu (specific) 34 2.5.5 Độ xác (precision) 34 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn thạc sĩ 2.5.5.1 Độ lặp lại (repeatibility) 34 2.5.5.2 Độ xác trung gian (intermediate precision) 34 2.5.5.3 Độ chép lại (reproducibility) 35 2.5.6 Độ (accuracy) 35 2.6 Độ ổn định 36 2.6.1 Độ ổn định thuốc 36 2.6.2 Hạn dùng thuốc 36 2.6.3 Nghiên cứu độ ổn định thuốc 36 2.6.3.1 Phương pháp thử độ ổn định thực hay phương pháp theo dõi tự nhiên (real time method) 36 2.6.3.2 Phương pháp thử độ ổn định cấp tốc hay phương pháp già hóa cấp tốc (aging method) 36 Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39 3.1 Nguyên liệu, hóa chất trang thiết bị 40 3.1.1 Hóa chất dung môi 40 3.1.2 Chất chuẩn chất thử 40 3.1.3 Thiết bị nghiên cứu 41 3.1.4 Phần mềm chuyên dụng 42 3.2 Phương pháp nghiên cứu 43 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 24 '1064003461 0.40 0.42 25 '1064003467 0.37 0.40 26 '1064003463 0.24 0.24 27 '1064003466 0.27 0.28 28 '1064003504 0.76 0.77 29 '1064003497 0.30 0.32 30 '1064003496 0.26 0.26 31 '1064003495 0.21 0.20 32 '1064003494 0.18 0.17 33 '1064003488 0.23 0.22 34 '1064003503 0.27 0.25 35 '1064003501 0.27 0.25 36 '1064003506 0.16 0.15 37 '1064003505 0.34 0.33 38 '1064003519 15.82 15.90 39 '1064003516 0.19 0.20 40 '1064003518 0.20 0.20 41 '1064003520 0.17 0.20 42 '1064003525 0.39 0.38 43 '1064003527 0.23 0.22 44 '1064003528 0.24 0.24 45 '1064003529 0.65 0.62 46 '1064003530 0.18 0.20 47 '1064003533 0.20 0.21 48 '1064003538 0.20 0.20 49 '1064003566 0.20 0.22 50 '1064003574 0.36 0.37 51 '1064003573 0.48 0.48 52 '1064003569 0.84 0.85 53 '1064003568 0.22 0.23 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 54 '1064003567 0.27 0.30 55 '1064003581 0.20 0.21 56 '1064003580 0.16 0.17 57 '1064003579 0.31 0.32 58 '1064003575 0.26 0.30 59 '1064003576 1.23 1.26 60 '1064003586 0.27 0.30 61 '1064003584 0.21 0.20 62 '1064003583 0.20 0.20 63 '1064003588 0.32 0.30 64 '1064003587 0.31 0.30 65 '1064003589 0.28 0.30 66 '1064003593 0.23 0.21 67 '1064003591 0.24 0.25 68 '1064003590 0.31 0.30 69 '1064003594 0.18 0.20 70 '1064003601 0.28 0.29 71 '1064003592 0.24 0.24 72 '1064003599 0.23 0.23 73 '1064003605 0.21 0.22 74 '1064003603 0.21 0.23 75 '1064003604 0.94 0.94 76 '1064003607 0.32 0.32 77 '1064003609 1.45 1.48 78 '1064003612 0.38 0.40 79 '1064003614 0.65 0.65 80 '1064003617 0.74 0.75 81 '1064003618 13.24 13.28 82 '1064003622 0.21 0.20 83 '1064003623 0.20 0.20 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 84 '1064003624 0.17 0.20 85 '1064003629 7.32 7.35 86 '1064003630 4.50 4.52 87 '1064003631 1.20 1.21 88 '1064003633 0.23 0.23 89 '1064003640 0.20 0.20 90 '1064003638 0.28 0.29 91 '1064003641 0.19 0.20 92 '1064003642 0.42 0.40 93 '1064003645 0.30 0.32 94 '1064003646 0.20 0.20 95 '1064003652 0.20 0.23 96 '1064003661 0.30 0.30 97 '1064003658 0.14 0.15 98 '1064003662 0.61 0.60 99 '1064003666 0.21 0.20 100 '1064003673 0.24 0.25 101 '1064003679 0.25 0.26 102 '1064003570 0.28 0.28 103 '1064003710 0.17 0.18 104 '1064003709 0.30 0.32 105 '1064003708 0.31 0.30 106 '1064003705 0.20 0.20 107 '1064003707 0.20 0.20 108 '1064003706 0.21 0.20 109 '1064003703 0.24 0.24 110 '1064003702 0.30 0.32 111 '1064003701 0.25 0.25 112 '1064003704 0.23 0.22 113 '1064003711 0.22 0.22 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 114 '1064003719 0.14 0.15 115 '1064003720 0.92 0.95 116 '1064003718 0.25 0.21 117 '1064003717 0.25 0.24 118 '1064003716 0.21 0.20 119 '1064003715 0.32 0.31 120 '1064003714 0.34 0.34 121 '1064003713 0.23 0.24 122 '1064003725 0.25 0.26 123 '1064003728 0.11 0.12 124 '1064003729 0.19 0.20 125 '1064003726 0.26 0.25 126 '1064003724 0.72 0.72 127 '1064003722 0.81 0.81 128 '1064003732 0.24 0.25 129 '1064003731 0.24 0.21 130 '1064003730 0.22 0.23 131 '1064003736 0.25 0.25 132 '1064003737 0.23 0.23 133 '1064003733 0.20 0.20 134 '1064003735 0.38 0.39 135 '1064003721 0.31 0.30 136 '1064003738 0.54 0.55 137 '1064003740 2.32 2.35 138 '1064003742 1.73 1.75 139 '1064003739 0.23 0.20 140 '1064003744 0.24 0.21 141 '1064003745 0.40 0.43 142 '1064003748 0.44 0.42 143 '1064003746 0.30 0.32 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 144 '1064003749 0.22 0.20 145 '1064003751 0.29 0.30 146 '1064003754 0.23 0.25 147 '1064003753 0.37 0.38 148 '1064003755 0.25 0.25 149 '1064003756 5.43 5.42 150 '1064003757 2.45 2.46 151 '1064003758 1.90 2.00 152 '1064003759 0.24 0.26 153 '1064003760 0.22 0.21 154 '1064003762 0.20 0.20 155 '1064003761 0.34 0.31 156 '1064003763 0.30 0.31 157 '1064003767 0.25 0.25 158 '1064003771 0.54 0.54 159 '1064003770 0.21 0.20 160 '1064003764 0.20 0.20 161 '1064003766 0.26 0.26 162 '1064003765 4.30 0.43 163 '1064003774 0.24 0.24 164 '1064003773 0.33 0.32 165 '1064003775 0.31 0.30 166 '1064003772 0.25 0.25 167 '1064003777 0.55 0.54 168 '1064003781 0.23 0.23 169 '1064003788 0.21 0.20 170 '1064003830 0.21 0.21 171 '1064003829 0.23 0.23 172 '1064003828 9.20 9.30 173 '1064003827 0.31 0.30 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 174 '1064003835 0.23 0.23 175 '1064003834 0.39 0.39 176 '1064003833 0.21 0.21 177 '1064003832 0.24 0.24 178 '1064003839 0.24 0.26 179 '1064003838 0.42 0.41 180 '1064003837 0.32 0.32 181 '1064003840 0.43 0.43 182 '1064003844 0.21 0.20 183 '1064003845 0.22 0.21 184 '1064003848 4.32 4.34 185 '1064003847 0.32 0.32 186 '1064003846 0.33 0.30 187 '1064003852 0.27 0.27 188 '1064003851 0.23 0.23 189 '1064003850 0.24 0.24 190 '1064003856 0.53 0.53 191 '1064003855 0.53 0.54 192 '1064003854 0.23 0.25 193 '1064003853 0.25 0.26 194 '1064003860 0.31 0.32 195 '1064003861 0.34 0.34 196 '1064003862 0.43 0.42 197 '1064003865 0.26 0.27 198 '1064003863 0.31 0.34 199 '1064003867 0.37 0.37 200 '1064003868 0.23 0.22 201 '1064003866 0.43 0.43 202 '1064003870 11.45 11.47 203 '1064003875 7.43 7.42 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học 204 '1064003874 0.20 0.21 205 '1064003877 0.20 0.20 206 '1064003883 0.42 0.43 207 '1064003882 0.35 0.35 208 '1064003880 0.26 0.26 209 '1064003893 0.23 0.23 210 '1064003897 0.43 0.42 211 '1064003902 0.53 0.56 212 '1064003903 0.25 0.27 213 '1064003908 0.16 0.20 214 '1064003913 0.25 0.26 215 '1064003917 0.53 0.55 216 '1064003919 0.40 0.42 217 '1064003953 0.18 0.20 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang Luận văn cao học Phụ lục Kết định lượng nồng độ bilirubin trực tiếp mẫu huyết nội kiểm tra (IQC) kit BD1209 I.S.E THỬ NGHIỆM TRÊN HUYẾT THANH NỘI KIỂM TRA (IQC) Thông tin mẫu nội kiểm Ngày Tên mẫu Công ty SX Lot số Kết (mg/dL) Thực nghiệm Tham khảo Mean Range 07/01/2010 0,19 0,20 0,20 0,16 - 0,24 08/01/2010 0,21 0,20 0,20 0,16 - 0,24 09/01/2010 0,20 0,20 0,20 0,16 - 0,24 10/01/2010 0,22 0,17 0,20 0,16 - 0,24 11/01/2010 0,18 0,17 0,20 0,16 - 0,24 12/01/2010 0,18 0,19 0,20 0,16 - 0,24 0,19 0,18 0,20 0,16 - 0,24 0,19 0,19 0,20 0,16 - 0,24 0,19 0,23 0,20 0,16 - 0,24 0,21 0,20 0,20 0,16 - 0,24 0,20 0,21 0,20 0,16 - 0,24 0,20 0,21 0,20 0,16 - 0,24 0,22 0,19 0,20 0,16 - 0,24 0,21 0,18 0,20 0,16 - 0,24 0,20 019 0,20 0,16 - 0,24 22/01/2010 0,21 0,19 0,20 0,16 - 0,24 23/01/2010 0,21 0,21 0,20 0,16 - 0,24 24/01/2010 0,21 0,22 0,20 0,16 - 0,24 25/01/2010 0,18 0,22 0,20 0,16 - 0,24 26/01/2010 0,18 0,21 0,20 0,2 - 0,4 13/01/2010 14/01/2010 15/01/2010 16/01/2010 17/01/2010 18/01/2010 19/01/2010 20/01/2010 21/01/2010 Bio - Rad ISE Lyphocheck Assaye Control Chemis try BD1209 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang 14181 Luận văn cao học 27/01/2010 1,41 1,47 1,47 1,17 - 1,76 28/01/2010 1,49 1,49 1,47 1,17 - 1,76 29/01/2010 1,49 1,55 1,47 1,17 - 1,76 30/01/2010 1,51 1,50 1,47 1,17 - 1,76 1,39 1,53 1,47 1,17 - 1,76 01/02/2010 1,27 1,62 1,47 1,17 - 1,76 02/02/2010 1,51 1,32 1,47 1,17 - 1,76 03/02/2010 1,36 1,22 1,47 1,17 - 1,76 04/02/2010 1,38 143 1,47 1,17 - 1,76 05/02/2010 1,47 1,51 1,47 1,17 - 1,76 31/01/2010 Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang 14182 Luận văn cao học Phụ lục Trắc nghiệm F so sánh phương sai & trắc nghiệm t phương sai so sánh giá trị trung bình để so sánh chất lượng kit I.S.E kit theo dõi Õ Mẫu huyết bệnh nhân: F-Test Two-Sample for Variances 0.22 0.22 Mean 0.81473981 0.797592593 Variance 5.18901291 5.162599545 Observations 216 216 df 215 215 F 1.00511629 P(F