Xây dựng quy trình định danh lactobacillus acidophilus và bacillus subtills có trong chế phẩm sinh học dùng trong thủy sản bằng kỹ thuật giải trình tự RDNA 16s

1 ðẠI HOC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA HOÀNG TƯỜNG VI XÂY DỰNG QUY TRÌNH ðỊNH DANH LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS CĨ TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ RDNA 16S Chun ngành: Cơng Nghệ Sinh Học LUẬN VĂN THẠC SĨ Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2008 Học viên Hoàng Tường Vi LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn thạc sĩ xin : Trân trọng tri ân TS.BS Phạm Hùng Vân- cánh chim ñầu ñàn lĩnh vực cơng nghệ sinh hoc y học Thầy ln tận tình hướng dẫn bảo em trình thực luận văn tốt nghiệp từ bậc ñại học ñến bậc cao học Trân trọng cảm ơn thầy cô trường ðại học Bách Khoa- ngành Công nghệ Sinh học tiếp thêm cho tơi nhiều kiên thức chun ngành suốt hai năm học trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến Ban Giám ðốc, anh chị nhân viên Công Ty TNHH-TM-DV Nam Khoa tạo điều kiện cho tơi hồn thành ln văn ðặc biệt xin cảm ơn anh chị phịng RD, anh Thái Bình, chị Ngọc Thảo, chị Hiếu Ngọc khơng ngại khó khăn giúp đỡ tơi Xin thật lịng cảm ơn Anh- Xn Phán giúp ñỡ vô quan trọng, lời ñộng viên, chia sẻ suốt thời gian thực luận văn Gia đình tơi – Bố, mẹ em ln chỗ dựa tinh thần vững cho tôi, nơi tơi cảm thấy bình n trở Thành công ngày hôm quà tặng muốn gởi đến Gia ðình Anh Một lần xin trân trọng cảm ơn! Học viên Hoàng Tường Vi TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA VIỆT NAM PHÒNG ðÀO TẠO SðH PHÚC CỘNG HÒA Xà HỘI CHỦ NGHĨA ðỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH Tp HCM, ngày … tháng …năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HOÀNG TƯỜNG VI Phái: Nữ Ngày tháng năm sinh: 03/08/1983 Nơi sinh: Tp HCM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: I- TÊN ðỀ TÀI: “XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC CĨ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILUS SUBTILIS DÙNG TRONG THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ” II – NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: SỬ DỤNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ rDNA 16 VÀ KĨ THUẬT ðỊNH LƯỢNG ðẾM KHUẨN LẠC ðỂ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC TRONG THỦY SẢN ÁP DỤNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG ðỂ KIỂM TRA MỘT SỐ SẢN PHẨM CHẾ PHẨM SINH HỌC TRÊN THỊ TRƯỜNG III – NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: IV – NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: V – CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.BS PHẠM HÙNG VÂN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CN BỘ MƠN QL CHUN NGÀNH Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chun ngành thơng qua Ngày … tháng … năm 2008 TRƯỞNG PHÒNG ðT – SðH NGÀNH TRƯỞNG KHOA QL Học viên Hoàng Tường Vi TÓM TẮT Một khuynh hướng ngành thủy sản sử dụng chế phẩm sinh học để góp phần gia tăng sản lượng, chất lượng ñồng thời tạo phát triển bền vững với ñối với môi trường Trong chế phẩm sinh học u cầu bắt buộc phải định danh xác lịai vi sinh vật đầy đủ hàm lượng ñể mang lại kết tốt ñối với người sử dụng Trong nghiên cứu này, tiến hành xây dựng trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học thủy sản có Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis phương pháp sinh học phân tử phương pháp vi sinh ðối với định danh, chúng tơi xây dựng quy trình định danh hai chủng vi khuẩn kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S dựa sở vùng rDNA 16S vùng có tính bảo tồn đặc hiệu cao lồi ðối với định lượng, chúng tơi sử dụng vi sinh kỹ thuật định lượng gián tiếp khuẩn lạc mơi trường BA (Bacillus subtilis), BAYK (Lactobacillus acidophilus) Áp dụng quy trình kiểm tra chất lượng ñể kiểm tra 15 chế phẩm sinh học có Bacillus subtilis 12 chế phẩm sinh học có Lactobacillus acidophilus, chúng tơi thu kết 9/15 chế phẩm có kết định danh xác Bacillus subtilis, 8/9 chế phẩm có định danh Bacillus subtilis khơng đạt so với hàm lượng đăng kí chất lượng; 1/12 chế phẩm sinh học có định danh Lactobacillus acidophilus hàm lượng thấp hàm lượng đăng kí Học viên Hoàng Tường Vi ABSTRACT Now one of the trends in aquaculture is using probiotic to increase quantity, quality and protect from the polluted environment in stable development Probiotic requires the exact identified organism and adequate organism’s quantity to have great influence on aquaculture In this research, we aimed to build a quality control procedure of aquaculture probiotic having Lactobacillus acidophilus and Bacillus subtilis by bio-molecular method and microbiological method In terms of identification, we built the procedure based on rDNA 16S sequence analysis because rDNA 16S is a highly conserved region In expression of enumberation, we used plate counting technic with BA medium (Bacillus subtilis), BAYK medium (Lactobacillus acidophilus) Using this quality control procedure to examine 15 probiotic products having Bacillus subtilis on labels and 12 probiotic products having Lactobacillus acidophilus on labels We identified Bacillus subtilis in 9/15 products and the number of this species in 8/9 products is not as many as printed on labels We identified Lactobacillus acidophilus in 1/12 products and the number of this species is less 100 times than printed on the labels Học viên Hoàng Tường Vi Mục lục Trang Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục chữ viết tắt ðẶT VẤN ðỀ PHẦN MỘT 1.1 GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTIC 1.1.1 Lịch sử Probiotic .3 1.1.2 Tác dụng Probiotic 1.1.2.1 Tác dụng ñối với người .4 1.1.2.2 Tác dụng ñối với ñộng vật 1.1.2.3 Tác dụng mơi trường 1.1.3 Các yêu cầu ñối với vi sinh vật probiotic 1.1.4 Thực trạng việc sử dụng Probiotic hoạt động ni trồng thủy sản Việt Nam 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS VÀ BACILLUS SUBTILIS 1.2.1 Lactobacillus acidophilus 1.2.1.1 Lịch sử phát Lactobacillus acidophilus 1.2.1.2 Phân loại 1.2.1.3 ðặc điểm hình thái 10 1.2.1.4 ðặc điểm sinh hóa 10 1.2.1.5 ðiều kiện nuôi cấy 10 1.2.1.6 Vai trò L acidophilus 11 1.2.2 Bacillus subtilis 12 1.2.2.1 Phân loại 12 1.2.2.2 ðặc điểm hình thái 13 1.2.2.3 ðặc ñiểm sinh hóa 13 1.2.2.4 ðiều kiện nuôi cấy 14 1.2.2.5 Vai trò B subtilis .14 1.2.2.6 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis .15 Học viên Hoàng Tường Vi 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP 17 1.3.1 Các phương pháp ñịnh danh vi sinh vật 17 1.3 1.1 ðịnh danh thử nghiệm sinh hóa 17 1.3 1.2 ðịnh danh phương pháp giải trình tự gen 18 a Giải trình tự phương pháp hóa học 18 b Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy 19 c Giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 20 1.3.1.3 ðịnh danh phương pháp giải trình tự rDNA 16S 20 1.3.2 Các phương pháp ñịnh lượng vi sinh vật 22 1.3.2.1 Phương pháp ñếm trực tiếp 22 1.3.2.2 Phương pháp ñếm khuẩn lạc 22 1.3.2.3 Phương pháp màng lọc 23 1.3.2.4 Phương pháp MPN (Most Probable Number) 23 1.3.2.5 ðịnh lượng vi sinh vật phương pháp ño mật ñộ quang .23 PHẦN HAI 2.1 VẬT LIỆU 25 2.1.1 Mẫu thí nghiệm 25 2.1.2 ðịnh lượng vi sinh vật 25 2.1.3 Tạo sản phẩm khuếch ñại .25 2.1.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn 25 2.1.3.2 Khuếch ñại DNA vi khuẩn phát sản phẩm 26 2.1.4 Giải trình tự sản phẩm khuếch ñại .27 2.1.4.1 Tinh kiểm tra sản phẩm .27 2.1.4.2 Chạy chu trình nhiệt giải trình tự 27 2.1.4.3 Tủa sản phẩm khuyếch ñại .28 2.1.4.4 ðiện di mao quản .28 2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 29 2.2.1 Phương pháp xác ñịnh vi khuẩn yếm khí 29 2.2.2 Phương pháp cấy ñịnh lượng .29 2.2.2.1 Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 29 2.2.2.2 Cấy ñịnh lượng .29 2.2.2.3 ðếm khuẩn lạc 30 2.2.3 Nhuộm gram .30 2.2.4 Thử nghiệm catalase 31 2.2.5 Tạo sản phẩm khuếch ñại 32 Học viên Hoàng Tường Vi 2.2.5.1 2.2.5.2 2.2.5.3 2.2.6 2.2.6.1 2.2.6.2 2.2.6.3 2.2.6.4 Ly trích DNA vi khuẩn 32 Khuếch ñại DNA vi khuẩn 33 ðiện di phát sản phẩm 16S – DNA 35 Giải trình tự sản phẩm .36 Tinh sản phẩm 37 Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự 38 Tủa sản phẩm phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự 38 Chạy điện di mao quản giải trình tự 39 PHẦN BA 3.1 KẾT QUẢ KIỂM TRA ðẶC ðIỂM HÌNH THÁI VÀ SINH HÓA HAI CHỦNG B1 VÀ L1: 40 3.1.1 B subtilis B1 .40 3.1.2 L acidophilus L1 40 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ HAI CHỦNG VI KHUẨN B SUBTILIS VÀ L ACIDOPHILUS .41 3.2.1 Ly trích tạo sản phẩm khuếch đại rDNA 16S: 41 3.2.2 Tinh sản phẩm PCR 16S 42 3.2.3 Phản ứng chu kỳ nhiệt giải trình tự tủa DNA 43 3.2.4 ðiện di mao quản phân tích kết 44 3.3 XÂY DỰNG KỸ THUẬT ðỊNH LƯỢNG L.ACIDOPHILUS VÀ B SUBTILIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN 46 3.3.1 ðối với B subtilis 46 3.3.2 ðối với L acidophilus 47 3.4 XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI SINH ðỐI VỚI CÁC CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG THỦY SẢN CÓ L ACIDOPHILUS VÀ B SUBTILIS .48 3.5 Kết ứng dụng quy trình kiểm tra chất lượng mẫu chế phẩm sinh học dùng thủy sản 50 3.5.1 ðối với B subtilis 50 3.5.1.1 Kết ñịnh lượng phương pháp vi sinh 50 3.5.1.2 Kết ñịnh danh phương pháp sinh học phân tử 51 3.5.2 ðối với L acidophilus .53 3.5.2.1 Kết ñịnh lượng phương pháp vi sinh .53 3.5.2.2 Kết ñịnh danh phương pháp sinh học phân tử 54 Học viên Hoàng Tường Vi 3.6 3.6.1 a b 3.6.2 a b BÀN LUẬN .56 Kết ñịnh danh: .57 ðối với B subtilis: 57 ðối với L acidophilus .59 Kết ñịnh lượng 60 ðối với B subtilis 60 ðối với L acidophilus .61 PHẦN BỐN 4.1 KẾT LUẬN 62 4.2 KIẾN NGHỊ 63 PHẦN NĂM TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 65 Học viên Hoàng Tường Vi 10 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Kết ñịnh danh 15 mẫu chế phẩm sinh học có đăng ký chất lượng B subtilis Bảng 2: Kết ñịnh danh 12 mẫu chế phẩm sinh học có đăng ký chất lượng L acidophilus Bảng 3: Kết định lượng mẫu có kết định danh B subtilis DANH MỤC HÌNH Hình 1: Kết định danh bẳng sinh hóa Hình 2: Kết định lượng mẫu V5 V26 Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng thủy sản có B subtilis Hình 3: Quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng thủy sản có L acidophilus Học viên Hoàng Tường Vi 80 Phần bốn KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Với kết đạt được, tơi xin đưa kết luận sau: Học viên Hoàng Tường Vi 81 Xây dựng đựợc kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S ñể ñịnh danh L acidophilus B subtilis chế phẩm sinh học dùng cho thủy sản Xây dựng quy trình định lượng L acidophilus B subtilis phương pháp vi sinh Từ hai kỹ thuật trên, tơi xây dựng nên quy trình kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng thủy sản dành cho hai chủng vi khuẩn L acidophilus B subtilis phương pháp vi sinh phương pháp sinh học phân tử Áp dụng quy trình kiểm tra chất lượng ñể kiểm tra chế phẩm ñã ñược công bố chất lượng cho thấy rằng: ðối với B subtilis: 9/15 chế phẩm có kết định danh với chất lượng cơng bố Trong chế phẩm định danh có B subtilis có đến chế phẩm khơng có đủ số lượng cơng bố ðối với L acidophilus: có 1/12 chế phẩm có kết định danh L acidophilus Số lượng vi khuẩn có chế phẩm khơng ñạt so với chất lượng ñã ñăng ký 4.2 KIẾN NGHỊ Học viên Hoàng Tường Vi 82 ðể đề tài nghiên cứu hồn thiện có khả áp dụng thực tế, xin kiến nghị vấn ñề sau: Quy trình kiểm tra chất lượng nên sớm đưa vào ứng dụng thành quy trình thường quy ñể kiểm tra chất lượng chế phẩm sinh học dùng thủy sản có L acidophilus B subtilis quan chức sở sản xuất Bằng sở khoa học quy trình xây dựng cần mở rộng nghiên cứu nhiều đối tượng vi sinh vật khác có loại chế phẩm sinh học dùng thủy sản Có sản phẩm chế phẩm sinh học nước ta có chất lượng đáng tin cậy, đem lại hiệu cao cho người ni trồng thủy sản ðối với L acidophilus cần nghiên cứu việc dùng thêm mơi trường tăng sinh để phát loài dù chúng diện với số lượng chế phẩm Áp dụng quy trình kiểm tra chất lượng để kiểm tra mẫu chế phẩm sinh học thị trường với số lượng mẫu nhiều để có kết luận đầy ñủ tình hình sản xuất chế phẩm Nghiên cứu xây dựng quy trình kiểm tra chất lượng dựa kỹ thuật sử dụng ñề tài ñối với chế phẩm sinh học sử dụng cho người loại sản phẩm địi hỏi chất lượng tính an tồn tối ưu Học viên Hoàng Tường Vi 83 Phần năm TÀI LIỆU THAM KHAÛO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT ðỗ Thị Ngọc Huyền ; Nguyễn Ngọc Huyền ; Nguyễn Thuỳ Châu, 2005, Phân lập, tuyển chọn ñịnh loại chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả sinh phytaza, Tạp chí Nơng Nghiệp phát triển nơng thơn, số Học viên Hoàng Tường Vi 84 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục, tr 129 – 133, 190 – 206 Khuất Hữu Thanh, 2005 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen ðH Bách khoa Hà nội, Nhà xuất khoa học Kỹ thuật Lương ðức Phẩm, 2007 Các chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi nuôi trồng thủy sản Nhà xuất Nông nghiệp Lương ðức Phẩm 1998 Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Nông nghiệp Hà nội Lê Thuý Quyên (1999) PCR phát ñịnh lượng HBV – DNA, luận án thạc sĩ khoa học sinh học, trường ðại học Khoa học Tự nhiên, tr 27 – 30 Nguyễn ðức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2006 Thí nghiệm cơng nghệ sinh học thí nghiệm vi sinh vật học 2006 Nhà xuất ðại học quốc gia tP HCM Phạm Hùng Vân (2002), Cẩm nang Các kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng, Trường ðại học Y dược Tp Hồ Chí Minh, tr 39, 93 Phạm Hùng Vân, 2006, Từ Real-time PCR ñến Sequencing: giải pháp tồn diện cho chẩn đốn sinh học phân tử phát tác nhân gây bệnh nhiễm trùng 10 Tô Minh Châu, Lâm Thị Thu Hương, Nguyễn ðức Duy Anh, 2005 Xác định mơi trường tối ưu để thu sinh khối, enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học.Tạp chí KHKT Nông lâm nghiệp Số 11 Trần Thu Hoa, 2003 Nghiên cứu khả dùng bào tử Bacilluc tái tổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc Luận văn TS DượcTp.HCM, tr 13- 18 Học viên Hoàng Tường Vi 85 12 Võ Thị Thu, 1996 Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học khả ứng dụng mốt số chủng vi khuẩn thuộc chi Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, tr – 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH 13 Anthony di Fabio et al, Friendly bacteria – Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium, the Arthritis Trust of American, 1989 14 Bonen et al., "Cyanobacterial evolution: results of 16S ribosomal ribonucleic acid sequence analysis," Can J Biochem 57:879-888 (1979) 15 Christèle Humblot, Aurélia, Malène Sutren, Evelvne Lhoste, Joel Doré, Brussels sprouts, inulin and fermented milk alter the feacal microbiota of human microbiota-associated rats as shown by PCR-temporal temperature gradient gel electrophoresis using universal, Lactobacillus and Bifidobacterium, Bristish Journal of Nutrition 93, 2006, p677-684 16 Cowan and Steels (2005), Manual for the Identification of Medical Bacteria, Third edition, Edited by G I Barrow and R K A Feltham, p 87 – 90 17 Jean F MacFaddin (2000), Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, Third edition, Lippincott Williams & Wilkins, tr 484, 506 – 509, 582 18 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley, Stanley T Williams (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Ninth edition, tr 24, 559 19 José Luis Balcázar, Ignacio de Blas, Imanol Ruiz-Zarzuela, Daneil Vendrell, Olivia Gironés, José Luis Muzquiz, Sequencing of variable regions of the 16s rRNA gene for identification of lactic acid bacteria Học viên Hoàng Tường Vi 86 isolated from the intestinal microbiota of healthy salmonids, Comparative Immunology, Microbiology and Infectiuos Disease 30, 2007, p 111-118 20 Jean-Marc Neefs, Yves Van de Peer, Peter De Rijk, Compilation of small ribisomal subunit RNA structures, Nucleic Acids Research, Vol 21, No 13, 1993, p 3025-3049 21 Gerald W Tannock, Identification Lactobacilli and Bifidobacteria, Current Issues Molec Biol 1999, 1, p53-64 22 Hans G.H.J Heilig, Erwin G Zoetendal, Elaine E Vaughan, Philippe Marteau, Antoon D.L Akkermans,1 and Willem M de Vos, Molecular Diversity of Lactobacillus spp and Other Lactic Acid Bacteria in the Human Intestine as Determined by Specific Amplification of 16S Ribosomal DNA, Applied and Environmental Microbiology, January 2002, p 114-123, Vol 68, No 23 Iris L Gonzales, James E Sylvester, Beyond ribosomal DNA: ontowards the telomere, Chromosoma 1997, 105, 431 -437 24 Kirsten L Simpson, Bertil Pettersson and Fergus G Priest, Characterization of lactobacilli from Scotch malt whisky distilleries and description of Lactobacillus ferintoshensis sp nov., a new species isolated from malt whisky fermentations , Microbiology (2001), 147, 1007-1016 25 Luc De Vuyst, Vincent Schrijvers, Spiros Paramithiotis, Bart Hoste, Marc Vancanneyt, Jean Swings, George Kalantzopoulos, The Biodiversity of Lactic Acid Bacteria in Greek Traditional Wheat Sourdoughs Is Reflected in Both Composition and Metabolite Formation, Appl Environ Microbiol 2002 December; 68(12): 6059–6069 26 Lin Zhu, Wei Li and Xiuzhu Dong , Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Học viên Hoàng Tường Vi 87 Bifidobacterium thermacidophilum subsp porcinum subsp nov , Int J Syst Evol Microbiol 53 (2003), 1619-1623 27 Mary Carrington, A Rus Hoelzel, Molecular Epidemiology, p57 – 62 28 Masaki Fukuda, Tadashi Sekiguchi, Yoko Ono, Genetic analysis of nuclear ribosomal DNA of Lentinula Edodes, Mycoscience (2006) 57: 347 – 350 29 Michel Drancourt, Claude Bollet, Antoine Carlioz, Rolland Martelin,JeanPierre Gayral, and Didier Raoult, 16S Ribosomal DNA Sequence Analysis of a Large Collection of Environmental and Clinical Unidentifiable Bacterial Isolates, Journal of Clinical Microbiology, October 2000, p 3623-3630, Vol 38, No 10 30 M.J Kullen, R.B Sanozky-Dawes, D.C Crowell, T.R Klaenhammer (2000) Use of the DNA sequence of variable regions of the 16S rRNA gene for rapid and accurate identification of bacteria in the Lactobacillus acidophilus complex, 2001, Journal of Applied Microbiology, Volume 89 Issue Page 511-516, September 2000 31 Roy Byun, Mangala A Nadkarni, Kim-Ly Chhour, F Elizabeth Martin, Nicholas A Jacques, and Neil Hunter, Quantitative Analysis of Diverse Lactobacillus Species Present in Advanced Dental Caries, J Clin Microbiol 2004 July; 42(7): 3128–3136 32 R Santoro, The silence of the ribosomal RNA gene, CMLS Cellular and Molcular Life sciences, 62 (2005) 2067 – 2079 33 P C Y Woo, P K L Leung , K W Leung, K Y Yuen, Identification by 16S ribosomal RNA gene sequencing of an Enterobacteriaceace species from bone marrow transplant receipt, Journal of Clinical Pathology, 2000, 53(4), 211 – 215 34 P Wattiau, M-E Renard, P Ledent, V.Debois, A PCR test to identify Bacillus subtilis and closely related species and its appication to monitoring Học viên Hoàng Tường Vi 88 of wastewater biotreatment, Appl Microbiol Biotechnol 55, 2001, p816819 35 Patrice Chagnaud, Kalotina Machinis, Loic A Coutte, Armelle Marecat, Annick Mercenier, Rapid PCR-based procedure to indentify lactic acid bacteria: application to six common Lactobacillus species, Journal of Mirobiol Methods 44, 2001, p139-148 36 S.I Pavlova, A.O Kilic, S.S Kilic, J.-S So, M.E Nader-Macias, J.A Simoes, L Tao, Genetic diversity of vaginal lactobacilli from women in different countries based on 16S rRNA gene sequences, Journal of Applied Microbiology 92 (3), 2001, p451–459 37 S K P Lau, P C Y Woo, Usefulness of the MicroSeq 500 16s rDNA bacterial identification system for identificating anaerobic Gram positive bacilli isolated from blood cultures, Journal of Clinical Pathology, 2006, 59, 219 – 222 38 Ulrike Lyhs, Lactic acid bacteria associated with th spoilage of fish products, 2002, University of Helsinki, Finland 39 Xi-Yang Wu, Mark J Walker, Micheal Hornitzky, James Chin, Development of a group – specific PCR combined with ARDRA for the identification of Bacillus species of enviromental significance, Journal of Microbiological Methods 64, 2006, p107-119 40 Yi-Ting Kao, Yu-Shan Liu, Yuan-Tay Shyu, Identification of Lactobacillus spp in probiotic products by real-time PCR and melting curve annalysis, Food research International 40, 2007, p71-79 41 X Wang, S.P Heazlewood, D.O Krause, T.H.J Florin, Molecular characterization of the microbial species that colonize human ileal and colonic mucosa by using 16S rDNA sequence analysis, Journal of Applied Microbiology 95 (3),2003, p 508–520 Hoïc viên Hoàng Tường Vi 89 Học viên Hoàng Tường Vi 90 PHỤ LỤC KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ RDNA 16S CỦA CÁC MẪU CỊN LẠI Trình tự rDNA 16S M Tên S phẩm DT sản – LACTO Bio – DW Probiotex – one GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAATGGATTAAGAGCTTGCTCT TATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC CATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAA CATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCA CTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT GAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGA ACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACTGCAGTCGAGTCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCG GATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGT AAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTC CTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTT ACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTC ACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG GAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA GTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACA AGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGC CACGGCTAACTACGTGCCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAATGGATTAAGAGCTTGCTCT T ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC A TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACAT TTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT A TGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA C CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT G GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA T CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGA T GAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGC Học viên Hoàng Tường Vi 91 T AGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGG C TAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAATGGATTAAGAGCTTGCTCT Vime – T ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC Subtyl A TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACAT TTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT A TGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA C CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT G GGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA T CTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGA T GAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGC TAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACG GCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAATGGATTAAGAGCTTGCTCT Novazym T ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC eF A TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACAT TTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT A TGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CC AAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTG G GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAAT C TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT G AAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCT A GTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGC T AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCTGAATGGATTAAGAGCTTGCTCT Subtyl – T ATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC LA A Học viên Hoàng Tường Vi 92 11 TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACAT TTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTT A TGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA C CAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACT GGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG A ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT G ATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGT GCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCA CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAA GTGCCTAATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCT NPV – G ATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTA Prozyme A 900 GACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTC T GAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC A AGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTG ATGAAGGTTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAA GTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCCAGAAA GCCACGGCTAACTACCGTGCCAGCAGCCCGCGGGTAA AGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTACAGCA ProKura CTCGGGATAACTCCGCGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTT GAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC A AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGG G ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC T TCCGCAATGGACTAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG A AGGTTTTCGGATCGTTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTTACC GTTCGAATAGGGCGGTA AGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTACAG Men Gấu CACTCGGGATAACTCCGCGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGT TGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACC Vàng ACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA CGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAT Học viên Hoàng Tường Vi 93 12 Zymmix 18 Biobac 20 Pond Clear 21 Bio Pond CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACTAAAGTCTGACGGAGC AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTTAAAGCTCTGT TGTTAGGGAAGAACAAGTTACCGTTCGAATAGGGCGGTA CTTACACATGCAAGTCGAACTGGTAACAGGTCTTCGGATGCTGAC GAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCTGGTAGTG GGGGATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATGAGATCTAC GGATGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGTGCTACCAGAGCGGCT GATGGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGCCTG CGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTGTT GGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGCAGGATG AAGGCCCTCGGGTTGTAAACTGCTTTTAGTACGGAACGAAAAGCC TGGGGCTAATATCCCCGGGTCATGACGGTACCCGTAAGAATAAGC ACCGGCTAACTACGCTGCCAGCAGCCGCG CCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCG GATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCT GTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATA GTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTG TCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTA ATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA TCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAG CAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCCTG TTGTTAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGAC GGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCCAGCAGCCGC CTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGAT GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTG AACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAG ATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA A GGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTG CCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCA CGGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCC TGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTG TAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTT GTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCAC TTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT Học viên Hoàng Tường Vi 94 GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGA ACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAG AAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG 23 Men Bac 24 Lactovet 27 Microzym e TCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTTATTCAACTAGCA CTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTT CATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGC GGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTG TCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTA CGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCT AATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCG CCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGT ATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCA GGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCAT AAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCCGACTTGCATGTAT TAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTTGAGCCAGGATCCAA ACTCTACCA AGGAAGTTTTCGGATGGAATTAAAAGTGACTGAGCGGCGGACG GGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCTCATACAGGGGGATAACA GTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGTGCTGCAT AGCACAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTC TGATTAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCACCAAGCCGACGATC AGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGAC ACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGAC AATGGGGGAAACCCTGATCCAGCGACGCCGCGTGAGTGAAGAAG TATTTCGGTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGAAAATGACGGT ACCTGACTAAGAAGCCCCGGCTAAACTACGTGCCAGCAGC TGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTA ACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAAT ACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGG CTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTT GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTG AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTC CTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTA AAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGG TACCTTGACGGTACCTAACCCAGAAAGCCAGGCTAACTACGTGCA GCAGCCGC Học viên Hoàng Tường Vi ... ? ?Xây dựng quy trình định danh Lactobacillus acidophilus Học viên Hoàng Tường Vi 14 Bacillus subtilis chế phẩm sinh học dùng thủy sản kỹ thuật giải trình tự rDNA 16s? ?? Bên cạnh đó, chất lượng chế. .. dựng quy trình định danh kỹ thuật giải trình tự rDNA 16S hai chủng Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis - Xây dựng quy trình ñịnh lượng phương pháp vi sinh - Kết hợp quy trình định danh kỹ. .. chất lượng chế phẩm sinh học thủy sản có Lactobacillus acidophilus Bacillus subtilis phương pháp sinh học phân tử phương pháp vi sinh ðối với định danh, chúng tơi xây dựng quy trình định danh hai