Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây râu hùm hoa tía Tacca chantrieri

Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây râu hùm hoa tía Tacca chantrieri Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây râu hùm hoa tía Tacca chantrieri Nghiên cứu hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây râu hùm hoa tía Tacca chantrieri luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Diệp NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾTCỦA CÂY RÂU HÙM HOA TÍA -Tacca chantrieri LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Vũ Thị Diệp NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ DỊCH CHIẾTCỦA CÂY RÂU HÙM HOA TÍA -Tacca chantrieri Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội – 2018 Lời cảm ơn Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy, ngƣời Thầy tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian trao đổi, định hƣớng nghiên cứu tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Hóa sinh Sinh học phân tử nhƣ thầy cô khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Sinh, Ph ng Sau Đại học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên gi p đ tạo điều kiện cho tơi hồn thành chƣơng trình học tập thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, ngƣời thân ạn , ngƣời động viên tạo điều kiện thuận l i cho c thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2018 Học viên cao học MỤC LỤC Lời cảm ơn MỤC LỤC Danh mục hình Danh mục bảng BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Mở đầu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung thuốc 1.2 Các h p chất thứ cấp có thực vật 1.2.1 Alkaloids 1.2.2 Flavonoids 1.2.3 Tannins 1.2.4 Glycoside 1.2.5 Saponins 1.3 Giới thiệu chi Râu hùm 1.3.1 Thành phần loài thuộc chi Râu hùm 1.3.2 Các nghiên cứu thành phần h a học hoạt tính sinh vật chi Râu hùm 1.3.3 Hoạt tính sinh học chi Tacca 11 1.4 Giới thiệu lồi Râu hùm hoa tía-Tacca chantrieriở Việt Nam 12 1.5.Tình hình sử dụng Râu hùm y học cổ truyền Việt Nam 14 Chƣơng 16 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 Nguyên liệu 16 2.1 Hóa chất 16 2.2 Thiết bị thí nghiệm 17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.4.1 Định tính nhóm chất Râu hùm 17 2.4.2 Phương pháp thử hoạt tính DPPH 22 2.4.3 Phƣơng pháp xử lý mẫu 23 2.4.4 Phƣơng pháp chiết xuất 23 2.4.5 Các phƣơng pháp phân lập chất 23 2.4.6 Các phƣơng pháp xác định cấu tr c hoá học 24 2.4 Phƣơng pháp thống kê 25 Chƣơng 26 Kết nghiên cứu Thảo luận 26 3.1 Kết định tính nhóm chất Râu hùm 26 3.2.Điều chế cặn chiết từ Râu hùm hoa tíaTacca chantrieri 27 3.2.1 Phân lập chất từ cặn chiết 28 3.2.3.Xác định cấu trúc chất 31 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học RHH2 phân lập từ dịch chiết Râu hùm 43 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 44 Tài liệu tham khảo 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo nicotine .3 Hình 1.2 Công thức cấu tạo flavonoid [16] Hình 1.3.Cơng thức cấu tạo tannin Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo glycoside .5 Hình 1.5 Một số h p chất từ lồi chi Râu hùm Hình 1.6 Ảnh Râu hùm hoa tíaTacca chantrieri Việt Nam 14 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn biểu thị mối tƣơng quan nồng độ DPPH mật độ quang học 23 Hình 3.1 Sơ đồ điều chế cặn chiết từ mẫu T chantrieri 27 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết hexane lồi T chantrieri 28 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết EtOAc lồi T chantrieri 29 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập chất từ cặn nƣớc loài T chantrieri 30 Hình 3.5 Cơng thức hoá học chất RHW1 .31 Hình 3.5a Phổ 1H-NMR h p chất RHW1 32 Hình 3.5b Phổ 13C-NMR h p chất RHW1 33 Hình 3.5c Phổ DEPT h p chất RHW1 33 Hình 3.5d Phổ CD h p chất RHW1 .35 Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo chất RHH1 .35 Hình 3.6a Phổ 1H NMR RHH1 36 Hình 3.6b Phổ 1H NMR giãn rộng RHH1 .36 Hình 3.6c Phổ 13C NMR RHH1 .37 Hình 3.6d Phổ DEPT RHH1 37 Hình 3.7 Công thức cấu tạo chất RHH2 .38 Hình 3.7a Phổ 1H NMR RHH2 39 Hình 3.7b Phổ 1H NMR giãn rộng RHH2 .39 Hình 3.7c Phổ 1H NMR giãn rộng RHH2 40 Hình 3.7d.Phổ 13C NMR RHH2 .40 Hình 3.7e Phổ DEPT RHH2 41 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách cá loài thuộc chi Tacca phân bố Việt Nam Bảng 3.1.Kết định tính nhóm chất Râu hùm .26 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR RHW1 h p chất tham khảo 34 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR RHH2 42 Bảng 3.4.Khả kháng vi sinh vật kiểm định chất β-sitosterol (RHH2) 43 BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa ASE Kỹ thuật chiết nhanh với dung môi ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ DCM Dichloromethane DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DMEM Môi trƣờng Dul ecco’s Modified Eagle DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EA Ethyl acetate EtOH Ethanol FT-IR Phổ hồng ngoại Hep - G2 Ung thƣ gan MetOH Methanol NCI Viện Ung thƣ Quốc gia Hoa kỳ NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân SFE Kỹ thuật chiết siêu tới hạn UAE Kỹ thuật chiết sóng siêu âm v/v Thể tích / Thể tích Mở đầu Thế giới thực vật nguồn tài nguyên phong phú vô quý giá h p chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học Khơng nƣớc phƣơng Đông mà nƣớc phƣơng Tây tiêu thụ lƣ ng lớn dƣ c liệu Xu hƣớng sâu nghiên cứu tìm kiếm h p chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ loài thực vật làm dƣ c phẩm chữa bệnh ngày thu h t đƣ c quan tâm nhà khoa học ƣu điểm ch ng độc tính thấp, dễ hấp thu chuyển h a thể so với dƣ c phẩm tổng h p Mặc dù công nghệ tổng h p h a dƣ c ngày phát triển mạnh mẽ, tạo biệt đƣ c khác sử dụng cơng tác phịng, chữa bệnh, nhờ đ giảm tỉ lệ tử vong nhiều, song đ ng g p thuốc khơng mà chỗ đứng Y học mà tiếp tục đƣ c dùng nhƣ nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp cung cấp chất đầu cho công nghệ bán tổng h p, nhằm tìm kiếm dƣ c phẩm cho việc điều trị chứng bệnh thông thƣờng, nhƣ bệnh nan y Các nghiên cứu gần cho thấy, có khoảng 60% dƣ c phẩm đƣ c dùng chữa bệnh nay, thử cận lâm sàng có nguồn gốc từ tự nhiên Cho đến nay, giới phát khai thác nhiều h p chất có hoạt tính sinh học từ thuốc truyền thống chữa bệnh nâng cao sức khoẻ ngƣời Việt Nam nƣớc nằm vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ thực vật đa dạng phong ph Theo ƣớc tính, nƣớc ta có khoảng gần 13000 lồi thực vật bậc cao đ c khoảng 4000 loài đƣ c sử dụng làm thuốc Ngoài đa dạng thành phần chủng loại, nguồn dƣ c liệu Việt Nam có giá trị to lớn chỗ chúng đƣ c sử dụng rộng rãi cộng đồng để chữa nhiều loại bệnh khác Các thuốc đƣ c sử dụng dƣới hình thức độc vị hay phối h p với tạo nên thuốc quý giá Ngoài ra, hàng trăm thuốc đƣ c khoa học y - dƣ c đại chứng minh giá trị chữa bệnh chúng [5] Chi Tacca Việt Nam c loài đƣ c sử dụng làm thuốc chữa thấp khớp, viêm loét dày, viêm gan làm thực phẩm nhƣ rau ăn Trong chi Tacca, lồi Râu hùm hoa tía (Tacca chantrieri) đƣ c nghiên cứu kĩ Tuy nhiên số lƣ ng nghiên cứu lồi Râu hùm cịn ít, nghiên cứu tập trung thành phần hoá học hầu hết nghiên cứu tập trung phần thân rễ mà chƣa đề cập đến phần Chính chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Râu hùm hoa tía - Tacca chantrieri Việt Nam với mục tiêu nghiên cứu số thành phần hố học có dịch chiết Râu hùm nhằm tìm kiếm h p chất có hoạt tính sinh học, làm sở khoa học cho nghiên cứu để tạo sản phẩm chăm s c sức khỏe cộng đồng góp phần giải thích đƣ c tác dụng chữa bệnh thuốc Hình 3.5b Phổ 13C-NMR hợp chất RHW1 Hình 3.5c Phổ DEPT hợp chất RHW1 33 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR RHW1 hợp chất tham khảo C #,a, b a,b 42.5 42.4 C 50.7 50.7 CH2 201.2 201.2 C - 127.2 127.2 CH 5.87 (s) 167.3 167.3 C - 80.0 80.0 C - 131.6 131.6 CH 5.89 (m) 135.3 135.3 CH 5.90 (m) 77.3 77.3 CH 4.44 (m) 10 21.2 21.2 CH3 1.31 (d, 6.5) 11 24.7 24.7 CH3 1,05 (s) 12 23.5 23.4 CH3 1,06 (s) 13 19.6 19.6 CH3 1.94 (d, 1.5) 1′ 102.8 102.8 CH 4.35 (d, 8.0) 2′ 75.3 75.3 CH 3,19 (dd, 8,0; 8,0) 3′ 78.2 78.1 CH 3,24-3,37 (m) 4′ 71.7 71.7 CH 3,24-3,37 (m) 5′ 78.1 78.0 CH 3,24-3,37 (m) 6′ 62.9 62.8 CH2 a δC δC DEPT a,c δH (mult., J in Hz) 2.17 (d, 17.0) 2.54 (d, 17.0) 3.66 (dd, 5.5, 11.5) 3.87 (dd, 2.0, 11.5) Đo CD3OD, b125MHz, c500MHz, C#của chất (6S, 9R)-roseoside [1] Phổ 13C-NMR DEPT củah p chất RHW1 xuất tín hiệu 19 cacbon bao gồm cacbonyl δC 201.2, nhóm methyl δC21.2, 24.7, 23.4 19.6, nhóm methin sp2 δC 127.2, 131.6 135.3, nhóm methin sp3 δC77.3, nhóm methylen δC50.7, cacbon bậc cacbon thuộc phân tử đƣờng (5 nhóm oxymethin nhóm oxymethylen) Cấu hình β phần đƣờng đƣ c xác định từ số tƣơng tác lớn (J = 8,0 Hz) proton anomeric H-1’ δH4,35 34 Hình 3.5d Phổ CD hợp chất RHW1 Cấu hình tuyệt đối h p chất đƣ c xác định phân tích phổ CD so sánh độ chuyển dịch hóa học với đồng phân lập thể iết Hiệu ứng Cotton 240 nm có giá trị dƣơng cho phép xác định cấu hình S cho cacbon C-6 [1] Từ liệu phổ NMR, ESI-MS, CD, so sánh độ quy cực với tài liệu tham khảo, h p chất RHW1 đƣ c xác định (6S, 9R)-roseoside[1] H p chất đƣ c đánh giá c hoạt tính chống ung thƣ d ng tế ung thƣ da chuột thực nghiệm [2] 3.2.3.2 Hợp chất Triolein (RHH1) Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo chất RHH1 H p chất RHH1 đƣ c phân lập dƣới dạng chất dầu màu trẳng ngà Phổ 1HNMR RHH1 có tín hiệu cộng hƣởng nhóm oxymethylen δH 4.13 (2H, dd,J = 6.0, 11.5 Hz, H-1a H-3a) 4.28 (2H, dd,J = 4.0, 7.0 Hz, H-1b H-3b), nhóm oxymethine δH 5.24 (1H, m, H-2) Các tín hiệu cộng hƣởng cho biết cấu trúc RHH1 có chứa phân tử glycerol ị este hóa nhóm hydroxy 35 Ngồi tín hiệu ra, phổ 1H NMR cịn có tín hiệu cộng hƣởng ba nhóm methyl δH 0.87 (9H, t, J = 7.0 Hz, H-18, H-18 H-18), nhóm methine dạng olefin cộng hƣởng vùng δH 5.26-5.39 (6H, m), tín hiệu cộng hƣởng nh m methylene vùng trƣờng cao δH 1.20-2.83 Hình 3.6a Phổ 1H NMR RHH1 Hình 3.6b Phổ 1H NMR giãn rộng RHH1 36 Phổ 13 C NMR DEPT RHH1 cho tín hiệu nh m car onyl (δC 173.17 172.80), nhóm methin dạng olefin (δC 129.95 129.66), nhóm oxymethin (δC 68.85), hai nh m oxymethylen (δC 62.06), nh m methyl (δC 14.03) số nhóm methylen tập trung vùng trƣờng cao (δC 22.63-34.16) Hình 3.6c Phổ 13C NMR RHH1 Hình 3.6d Phổ DEPT RHH1 37 Kết h p liệu phổ 1H NMR 13 C NMR cho phép dự kiến h p chất RHH1 trieste glycerol với axit So sánh số liệu phổ 13 C NMR phần axit RHH1 với axit oleic [3] Sự tƣơng đồng số liệu cho phép xác định RHH1 trieste axit oleic glycerol có tên gọi triolein Cấu trúc RHH1 triolein đƣ c khẳng định lại qua việc tham khảo tài liệu công ố trƣớc triolein so sánh mỏng TLC với chất triolein có phịng thí nghiệm (Rf = 1,6) [4,5] 3.2.3.3 Hợp chất β-sitosterol (RHH2) Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo chất RHH2 Hợp chấtRHH2 thu đƣ c dƣới dạng tinh thể dạng phiến, màu trắng, nóng chảy 135-136 oC Phổ 1H NMR xuất tín hiệu cộng hƣởng proton dạng olephin [δH 5,34 (1H, brd, J= 5,0 Hz, H-6) nh m methyl đ c nh m cộng hƣởng dƣới dạng singlet [δH 0,68 (3H, s, H-18) 1,00 (3H, s, H-19)] nhóm cộng hƣởng dạng doublet [δH 0,81 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-27); 0,83 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-26); 0,85 (3H, d, J= 7,5 Hz, H-29); 0,92 (3H, d, J= 6,5 Hz, H-21)] Tín hiệu cộng hƣởng nhóm hydroxymethin xuất dƣới dạng multiplet [δH 3,52 (1H, m, H-3)] Ngoài cịn có tín hiệu cộng hƣởng proton nhóm methin methylen khác vùng trƣờng cao [δH 1,04-2,31] 38 Hình 3.7a Phổ 1H NMR RHH2 Hình 3.7b Phổ 1H NMR giãn rộng RHH2 39 Hình 3.7c Phổ 1H NMR giãn rộng RHH2 Phổ 13C NMR RHH2 có tín hiệu cộng hƣởng 29 nguyên tử cacbon bao gồm liên kết đôi [δC 121,73 (C-6); 140,77 (C-5)], nhóm methyl [δC 11,87 (C18); 11,99 (C-29), 18,79 (C-21); 19,05 (C-26); 19,40 (C-19); 19,82 (C-27)], nhóm methin, 11 nhóm methylen cacbon bậc bốn Sự có mặt liên kết đơi, nhóm methyl bậc cacbon bậc bốn phân tử RHH2 cho biết chất có chứa khung steroit đƣ c nhận định β-sitosterol Hình 3.7d.Phổ 13C NMR RHH2 40 Hình 3.7e Phổ DEPT RHH2 Số liệu phổ 13 C NMR RHH2 đƣ c so sánh với giá trị tƣơng ứng đƣ c công bố h p chất β-sitosterol [6].Sự phù h p số liệu phổ NMR hai h p chất (bảng 2) cho phép khẳng định cấu trúc RHH2 β-sitosterol H p chất βsitosterol sterol phổ biến lồi thực vật bậc cao Chất khơng có mặt nhiều loài thực vật mà c n đƣ c tìm thấy lồi sinh vật biển 41 Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR RHH2 a C# Ca,b DEPT Ha,c (dạng pic, J=Hz) 37,7 37,27 CH2 32,3 31,68 CH2 72,2 71,83 CH 42,8 42,32 CH2 141,2 140,77 C 122,1 121,73 CH 32,1 31,93 CH2 32,3 31,93 CH 50,6 50,17 CH 10 36,9 36,52 C 11 21,5 21,10 CH2 12 40,2 39,80 CH2 13 42,8 42,35 C 14 57,2 56,79 CH 15 24,7 24,31 CH2 16 28,7 28,25 CH2 17 56,5 56,09 CH 18 12,4 11,87 CH3 0,68 (3H, s) 19 19,8 19,40 CH3 1,00 (s) 20 36,6 36,16 CH 21 19,2 18,79 CH3 22 34,4 33,98 CH2 23 26,5 26,13 CH2 24 46,2 45,87 CH 25 29,6 29,19 CH 26 20,2 19,82 CH3 0,83 (d, J= 7,0 Hz) 27 19,5 19,05 CH3 0,81 (d, J= 7,0 Hz) 28 23,5 23,10 CH2 29 12,3 11,99 CH3 3,52 (m) 5,34 (m, H-6) 0,92 (d, J= 6,5 Hz) 0,85 (t, J= 7,5 Hz) Đo CDCl3, b125MHz, c500MHz, C# β-sitosterol [6] 42 3.3 Đánh giá hoạt tính sinh học RHH2 phân lập từ dịch chiết Râu hùm Do hàm lƣ ng thu đƣ c từ chất phân lập không nhiều nên tập trung nghiên cứu chất RHH2 (tách từ phân đoạn n hecxan) có cơng thức chất β-sitosterol (RHH2)là chất thu đƣ c với khối lƣ ng H p chất c số nghiên cứu cho thấy chúng có hoạt tính kháng tế ung thƣ nhƣng không mạnh [] Kết nghiên cứu chất β-sitosterol (RHH2)đƣ c thể qua khả kháng vi sinh vật kiểm định (bảng 3.4) hoạt tính chống oxi hố (bảng 3.5) Bảng 3.4.Khả háng vi sinh vật kiểm định chất β-sitosterol (RHH2) Giá trị IC50 chủng (ug/mL) Gram (+) Mẫu RHH2 Gram (-) Nấm S B L S.nella E P Candia aureus subtilis fermentum eenterica coli aeruginosa albican 1,1 79,7 25,8 3,1 4,4 > 256 > 256 Kết bảng 3.4 xác định với khả kháng khuẩn kết cho thấy chất RHH2 có hoạt tính mạnh với chủng vi khuẩn Gram +, nhƣng yếu với chủng Gram - khơng có hoạt tính với nấm Kết so với nghiên cứu trƣớc thấp Điều chứng tỏ với Râu hùm chất có hoạt tính tập trung phần thân, rễ ảng ết thử hoạt tính chống oxy hoá chấtβ-sitosterol (RHH2) Chất thử Giá trị IC50 (µg/mL) hệ DPPH RHH2 > 128 Đối chứng dƣơng uercetin 8,11 Kết bảng 3.5 cho thấy chất β-sitosterol (RHH2) phân lập đƣ c từ Râu hùm khơng có hoạt tính oxi hóa hệ thử nồng độ