Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (gracilaria verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NI CÁ RƠ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT KHÁNH HÒA, 2017 i BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NI CÁ RƠ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 60.54.10.05 Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH Nguyễn Trọng Cẩn PGS.TS Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA, 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Nha Trang, Ngày tháng Tác giả luận văn Lê Hương Thủy iii năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận án Trước hết xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học Ban Chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng, niềm tự hào học tập nghiên cứu Trường năm qua Sự biết ơn sâu sắc xin giành cho Thầy GS.TSKH Nguyễn Trọng Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang PGS.TS Vũ Ngọc Bội Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm tận tình hướng dẫn động viên tơi suốt q trình thực Luận án Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản cán Phịng Nghiên cứu Cơng nghệ Sau thu hoạch, Phịng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Cơng nghệ gen - Viện Cơng nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phịng, Viện Cơng nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực Luận án vừa qua Đặc biệt, xin ghi nhớ tình cảm, giúp đỡ, động viên gia đình bạn bè ln ln chia sẻ tơi q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, Ngày tháng Tác giả luận văn Lê Hương Thủy iv năm 2017 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH .xi DANH MỤC SƠ ĐỒ xiii DANH MỤC BIỂU ĐỒ .xiv TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nguyên liệu rong biển tình hình sản xuất Agar .3 1.1.1 Nguyên liệu rong biển 1.1.2 Các quy trình sản xuất agar 1.1.3 Thành phần bã thải agar 1.1.4 Các phương pháp xử lý bã thải agar 1.2 Tổng quan Cellulose 11 1.3 Enzym Cellulase 13 1.4 Vi sinh vật tổng hợp Cellulase 18 1.4.1 Giới thiệu chung nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase .18 1.4.2 Một số chủng vi sinh vật ứng dụng nhiều sản xuất cellulase 22 1.4.3 Ứng dụng enzym cellulase vi sinh vật 24 1.4.4 Môi trường nuôi cấy nguồn nguyên liệu 26 1.4 Phương pháp thu nhận enzym cellulase .27 1.5 Sản lượng nuôi cá rô phi 30 1.6 Đặc điểm sinh học cá rô phi 32 1.6.1 Phân loại 32 1.6.2 Đặc điểm hình thái: .32 1.6.3 Đặc điểm dinh dưỡng sinh trưởng 33 1.6.4 Nhu cầu dinh dưỡng cá rô phi .34 v 1.6.5 Nhu cầu dinh dưỡng ảnh hưởng thức ăn lên sinh trưởng cá rô phi .38 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng 42 2.1.1 Bã thải rong sau sản xuất agar .42 2.1.2 Giống vi sinh vật sinh cellulase 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Phương pháp phân tích 43 2.2.2 Các phương pháp thu nhận xác định hoạt tính cellulase 44 2.2.3 Phương pháp nuôi cấy đánh giá khả sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 47 2.2.4 Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm 49 2.3 Hóa chất thiết bị chủ yếu sử dụng luận án .56 2.3.1 Hóa chất .56 2.3.2 Thiết bị .56 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 57 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .58 3.1 Khảo sát đánh giá khối lượng thành phần hóa học bã thải rong câu vàng sau sản xuất agar 58 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật nghiên cứu số tính chất chủng vi sinh vật tuyển chọn .60 3.2.1 Kết nghiên cứu tuyển chọn chủng giống vi sinh vật 60 3.2.2 Nghiên cứu số tính chất chủng vi sinh vật tuyển chọn 64 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình ni cấy chủng vi khuẩn B Subtilis VTCC B-505 B Lichenformis (Li) ứng dụng thủy phân bã rong câu (G Verrucosa) sau sản xuất Agar .70 3.3.1 Xác định điều kiện thích hợp cho q trình ni sản xuất enzyme cellulase từ chủng B505 Li 71 3.3.2 Đề xuất quy trình ni cấy thu nhận chế phẩm cellulase thô 79 3.3.3 So sánh đánh giá hoạt tính cellulase chủng Li B505 với chế phẩm cellulase từ VSV khác .83 vi 3.3.4 Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar enzyme cellulase từ hai chủng vi khuẩn B 505 Li 88 3.4 Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong thức ăn nuôi cá rô phi 94 3.4.1 Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi 94 3.4.2 Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn ni cá rô phi .94 3.4.3 Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi 98 3.4.4 Thử nghiệm nuôi cá rô phi thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong 99 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .103 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A530 : Đo OD bước sóng 530nm B26 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26 B505 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 CMC : Carbonyl – methyl cellulose CMCase CPF Thailand ĐC : Carbonyl – methyl cellulase DNSA : –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid DO : Hàm lượng oxy hòa tan DWG FCR : Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức Liên Hiệp Thế Giới Lương Thực Nông Nghiệp) : Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn) K-Na : TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate Li : Vi khuẩn Bacillus lichenformis NT : Nghiệm Thức Nxb : Nhà xuất OD : Optical Density ( mật độ quang học) TCA : Tricloacetic axit TLS : Tỷ lệ sống TM & SX : Thương mại sản xuất TNHH : Trách nhiệm hữu hạn USD : Đô la Mỹ VSV : Vi sinh vật Wt : Khối lượng cá ứng với thời điểm t FAO : Tập đồn Nơng sản Charoen Pokphand Thái Lan : Đối chứng viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Vi sinh vật phân hủy lignocellulose 19 Bảng 1.2 Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao (µmol/phút/mg) 20 Bảng 1.3 Phân biệt cá đực, cá 32 Bảng 1.4 Giới hạn thành phần thức ăn có giá thành cho cá rô phi giai đoạn 35 Bảng 1.5 Cung cấp bổ sung vitamin khống chất thức ăn cá rơ phi .36 Bảng 1.6 Tiêu chuẩn kỹ thuật thức ăn nuôi cá rô phi chế độ ăn nuôi lồng ao thâm canh 37 Bảng 1.7 Thành phần hố học cá rơ phi ni thức ăn viên có hàm lượng protein 34,2 (%) 40 Bảng 1.8 Nuôi cá rô phi thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác 40 Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác 41 Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn glucose 46 Bảng 3.1 Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ vùng rong nguyên liệu khác 58 Bảng 3.2 Hàm lượng chất bã rong câu số sở sản xuất Agar 59 Bảng 3.3 Hàm lượng kim loại nặng bã rong câu số sở sản xuất Agar .59 Bảng 3.4 Hoạt tính cellulase ngoại bào 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu .61 Bảng 3.5 Hoạt tính enzym cellulase chủng Li, B505, B26 CFd .62 Bảng 3.6 Hoạt tính cellulase ngoại bào chủng Li, B505 đĩa thạch có chất bột giấy 0,2% 68 Bảng 3.7 Khả thủy phân bã thải agar cellulase từ chủng Li B505 69 Bảng 3.8 Khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào chủng B505 nuôi môi trường khác .72 Bảng 3.9 Khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào chủng Li nuôi cấy môi trường khác .72 Bảng 3.10 Khả sinh trưởng vịng hoạt tính chủng B505 chủng Li nhiệt độ khác 75 ix Bảng 3.11 Khả sinh trưởng tiết cellulase chủng B505 chủng Li pH khác 76 Bảng 3.12 Khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào chủng Li theo thời gian nuôi cấy 77 Bảng 3.13 Khả sinh trưởng tiết cellulase ngoại bào chủng B505 theo thời gian nuôi cấy 78 Bảng 3.14 So sánh hoạt tính cellulase từ chủng VSV (A niger, T konigii, Li, B505 T3) đĩa thạch có CMC 0,2% .84 Bảng 3.15 So sánh hoạt tính cellulase từ chủng VSV (A niger, T konigii, Li, B505 T3) đĩa thạch có chất bột giấy 0,2% 86 Bảng 3.16 Kết thí nghiệm mơ hình Box-Behnken 88 Bảng 3.17 Kết xử lý số liệu phần mềm DX6 89 Bảng 3.18 Kết dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mơ hình Box-Behnken .90 Bảng 3.19 Kết kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán thực nghiệm 91 Bảng 3.20 Thành phần nguyên liệu công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy phân 97 Bảng 3.21 Dao động yếu tố mơi trường q trình thí nghiệm .98 Bảng 3.22 Ảnh hưởng công thức thức ăn đến sinh trưởng cá rô phi 80 ngày nuôi 99 x Nghiệm thức Năng xuất thu Hệ số thức ăn hoạch (g) CT1 (0%) Ct (5%) CT 3(10%) CT (15%) CT (20%) CT (25%) 2,67 2,38 1,92 1,57 1,69 1,84 11341,8 12393,7 14175 16065 15437,1 14385 Khối lượng tăng trọng (g) 6541,8 7353,7 9135 11145 10349,1 9465 Khối lượng ban đầu (g) 4800 5040 5040 4920 5088 4920 Bảng IV.9: Bảng mô tả thống kê so sánh DWG khối lượng cá sau 140 ngày nuôi Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N W 80 DWG Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimu m Maximum CT (0%) 10 630.10 4.606 1.456 626.81 633.39 625 640 CT2 (5%) 10 652.30 4.191 1.325 649.30 655.30 645 658 CT3 (10%) 10 675.00 6.700 2.119 670.21 679.79 665 685 CT4 (15%) 10 765.00 4.190 1.325 762.00 768.00 760 772 CT5 (20%) 10 735.10 3.814 1.206 732.37 737.83 730 740 CT6 (25%) 10 685.00 5.354 1.693 681.17 688.83 678 695 Total 60 690.42 47.026 6.071 678.27 702.56 625 772 CT (0%) 10 5.3020 06647 02102 5.2545 5.3495 5.21 5.40 CT2 (5%) 10 5.5730 07288 02305 5.5209 5.6251 5.41 5.65 CT3 (10%) 10 5.8440 08449 02672 5.7836 5.9044 5.71 5.96 CT4 (15%) 10 7.0050 08797 02782 6.9421 7.0679 6.90 7.19 CT5 (20%) 10 6.6180 08954 02832 6.5539 6.6821 6.48 6.81 CT6 (25%) 10 6.0000 07688 02431 5.9450 6.0550 5.90 6.13 Total 60 6.0570 59674 07704 5.9028 6.2112 5.21 7.19 32 ANOVA Sum of Squares KHOILUONGCC Between Groups Within Groups Total DWG Between Groups Within Groups Total df Mean Square 129172.683 25834.537 1299.900 54 24.072 130472.583 59 20.663 4.133 347 54 006 21.010 59 33 F Sig 1.073E3 000 643.455 000 Multiple Comparisons Dependent Variable (I) CONGTHU C (J) CONGTHU C W80 CT (0%) CT2 (5%) Tukey HSD CT3 (10%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT2 (5%) CT (0%) CT3 (10%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT3 (10%) CT (0%) CT2 (5%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT4 (15%) CT (0%) CT2 (5%) CT3 (10%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT5 (20%) CT (0%) CT2 (5%) 34 Mean Difference (I-J) 95% Confidence Interval Std Error Sig Lower Bound Upper Bound -22.200* 2.194 000 -28.68 -15.72 -44.900* 2.194 000 -51.38 -38.42 -134.900* 2.194 000 -141.38 -128.42 -105.000* 2.194 000 -111.48 -98.52 -54.900* 2.194 000 -61.38 -48.42 22.200* 2.194 000 15.72 28.68 -22.700* 2.194 000 -29.18 -16.22 -112.700* 2.194 000 -119.18 -106.22 -82.800* 2.194 000 -89.28 -76.32 -32.700* 2.194 000 -39.18 -26.22 44.900* 2.194 000 38.42 51.38 22.700* 2.194 000 16.22 29.18 -90.000* 2.194 000 -96.48 -83.52 -60.100* 2.194 000 -66.58 -53.62 -10.000* 2.194 000 -16.48 -3.52 134.900* 2.194 000 128.42 141.38 112.700* 2.194 000 106.22 119.18 90.000* 2.194 000 83.52 96.48 29.900* 2.194 000 23.42 36.38 80.000* 2.194 000 73.52 86.48 105.000* 2.194 000 98.52 111.48 82.800* 2.194 000 76.32 89.28 CT3 (10%) 60.100* 2.194 000 53.62 66.58 -29.900* 2.194 000 -36.38 -23.42 50.100* 2.194 000 43.62 56.58 54.900* 2.194 000 48.42 61.38 32.700* 2.194 000 26.22 39.18 10.000* 2.194 000 3.52 16.48 -80.000* 2.194 000 -86.48 -73.52 CT5 (20%) -50.100* 2.194 000 -56.58 -43.62 CT2 (5%) -.27100* 03584 000 -.3769 -.1651 -.54200* 03584 000 -.6479 -.4361 -1.70300* 03584 000 -1.8089 -1.5971 -1.31600* 03584 000 -1.4219 -1.2101 -.69800* 03584 000 -.8039 -.5921 27100* 03584 000 1651 3769 -.27100* 03584 000 -.3769 -.1651 -1.43200* 03584 000 -1.5379 -1.3261 -1.04500* 03584 000 -1.1509 -.9391 -.42700* 03584 000 -.5329 -.3211 54200* 03584 000 4361 6479 27100* 03584 000 1651 3769 -1.16100* 03584 000 -1.2669 -1.0551 -.77400* 03584 000 -.8799 -.6681 -.15600* 03584 001 -.2619 -.0501 1.70300* 03584 000 1.5971 1.8089 1.43200* 03584 000 1.3261 1.5379 1.16100* 03584 000 1.0551 1.2669 38700* 03584 000 2811 4929 1.00500* 03584 000 8991 1.1109 1.31600* 03584 000 1.2101 1.4219 CT4 (15%) CT6 (25%) CT6 (25%) CT (0%) CT2 (5%) CT3 (10%) CT4 (15%) DWG Tukey HSD CT (0%) CT3 (10%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT2 (5%) CT (0%) CT3 (10%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT3 (10%) CT (0%) CT2 (5%) CT4 (15%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT4 (15%) CT (0%) CT2 (5%) CT3 (10%) CT5 (20%) CT6 (25%) CT5 (20%) CT (0%) 35 CT2 (5%) CT3 (10%) CT4 (15%) CT6 (25%) CT6 (25%) CT (0%) CT2 (5%) CT3 (10%) CT4 (15%) CT5 (20%) * The mean difference is significant at the 0.05 level 36 1.04500* 03584 000 9391 1.1509 77400* 03584 000 6681 8799 -.38700* 03584 000 -.4929 -.2811 61800* 03584 000 5121 7239 69800* 03584 000 5921 8039 42700* 03584 000 3211 5329 15600* 03584 001 0501 2619 -1.00500* 03584 000 -1.1109 -.8991 -.61800* 03584 000 -.7239 -.5121 W 80 Subset for alpha = 0.05 Tukey HSDa CONGTHU C N CT (0%) 10 CT2 (5%) 10 CT3 (10%) 10 CT6 (25%) 10 CT5 (20%) 10 CT4 (15%) 10 Sig Duncana 10 CT2 (5%) 10 CT3 (10%) 10 CT6 (25%) 10 CT5 (20%) 10 CT4 (15%) 10 630.10 652.30 675.00 685.00 735.10 765.00 1.000 CT (0%) Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 630.10 652.30 675.00 685.00 735.10 765.00 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 37 1.000 1.000 1.000 1.000 DWG Subset for alpha = 0.05 CONGTHU C N Tukey HSDa CT (0%) 10 CT2 (5%) 10 CT3 (10%) 10 CT6 (25%) 10 CT5 (20%) 10 CT4 (15%) 10 Sig Duncana 10 CT2 (5%) 10 CT3 (10%) 10 CT6 (25%) 10 CT5 (20%) 10 CT4 (15%) 10 5.3020 5.5730 5.8440 6.0000 6.6180 7.0050 1.000 CT (0%) Sig 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 5.3020 5.5730 5.8440 6.0000 6.6180 7.0050 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000 38 1.000 1.000 1.000 1.000 ... LÊ HƯƠNG THỦY NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU (Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NI CÁ RƠ PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM LUẬN ÁN... Do vi? ??c thực đề tài ? ?Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng sản xuất thức ăn nuôi cá rơ phi đơn tính giai đoạn thương phẩm? ?? hướng nghiên. .. ÁN Đề tài luận án: ? ?Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm? ?? Ngành/Chun ngành: