Khảo sát thành phần hóa học của cây chùm ruột phyllanthus acidus (l ) skeels từ cao ethyl acetate thu hái ở tỉnh bình thuận​

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC – BỘ MƠN HĨA HỮU CƠ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS (L.) SKEELS TỪ CAO ETHYL ACETATE THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN Sinh viên thực : NGUYỄN ĐÌNH PHƯỚC Giáo viên hướng dẫn : TS BÙI XUÂN HÀO MSSV: K38.201.091 TP Hồ Chí Minh, 2016 Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU 1.1.1 Giới thiệu chùm ruột Phyllanthus acidus Thuộc họ Thầu dầu – Euphorbiaceae, chi Phyllanthus Tên khoa học: Phyllanthus acidus (L.) Skeels Tên thơng thường: Cây chùm ruột, tầm ruột Hình 1.1: Thân chùm ruột Phân bố phổ biến vùng nhiệt đới cận nhiệt đới có Việt Nam 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, đối tượng nghiên cứu chùm ruột Phyllanthus acidus (L.) Skeels (Euphorbiaceae) thu hái huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận 1.1.3 Mơ tả thực vật Ở Việt Nam, số thuộc chi Phyllanthus có danh mục từ điển thuốc Việt Nam Theo Phạm Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích cộng sự, chùm ruột loại nhỏ, cao 3-5 m, thân nhẵn, cành có vỏ màu xám nhạt, cành non màu lục nhạt, nhẵn; cành già màu xám có nhiều vết sẹo rụng để lại Lá chùm ruột thuộc loại kép, mọc so le, cuống dài, chét mỏng, mềm, dài 4-5 cm, rộng 18-20 mm Gốc bầu, tròn, phần đầu phiến nhọn, mặt màu xám nhạt, gân rõ hai mặt Cụm hoa mọc kẽ rụng thành xim, dài 6-15 cm, cuống mảnh có cạnh; hoa nhỏ màu đỏ, hoa hoa đực cây; hoa đực có đài răng, nhị, rời; hoa có đài, bầu ô, hoa mọc thành cụm từ 4-7 hoa mấu trịn Quả chùm ruột mọng, có -1- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước khía, mảnh, đường kính khoảng mm, cuống dài khoảng mm Khi chín có màu vàng nhạt, vị chua, ngọt, ăn [32-34] 1.1.4 Một số ứng dụng chùm ruột Phyllanthus acidus y học Theo Đỗ Tất Lợi, Đỗ Huy Bích cộng sự, y học cổ truyền nước, phận khác chùm ruột dùng làm thuốc chữa bệnh da, dùng nấu nước tắm chữa lở ngứa mề đay Vỏ thân chùm ruột dùng để tiêu hạch độc, ung nhọt, tiêu đờm trừ tích phổi, dùng bơi ngồi, chữa ghẻ, loét, vết thương sứt da chảy máu; ngậm chữa đau răng, đau họng Bột vỏ thân ngâm giấm, uống chữa bệnh trĩ Rễ vỏ chùm ruột có độc, người Malaysia dùng đun sơi, xơng hít chữa ho nhức đầu hay người dân đảo Giava dùng chữa hen suyễn (dùng lượng nhỏ) Vỏ rễ sắc đặc ngâm rượu, bôi chữa vảy nến (Psoriasis) [32-33] 1.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC LỒI CÂY THUỘC CHI PHYLLANTHUS Cây chùm ruột thuộc chi Phyllanthus từ lâu sử dụng y học cổ truyền nước để điều trị bệnh thận, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng đường ruột, bệnh tiểu đường viêm gan siêu vi B Những nghiên cứu hoạt tính sinh học cao chiết phận chùm ruột phổ biến hoạt tính kháng khuẩn (Menlendez cộng sự, 2006), [18] kháng nấm (Satish cộng sự, 2009), sinh trùng giun đũa thực vật (Mackeen cộng sự, 1997), cộng sự, 2007), [28] [17] [24] kháng ký bệnh sơ nang (Sousa chữa trị tổn thương gan (Nilesh cộng sự, 2011), [10] giảm nhẹ mỡ mô, tạng, giảm lipid huyết gan chuột lang tuần (Chongsa cộng sự, 2014) [5] Ngoài ra, hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane thử nghiệm độc tính tế bào kháng virus viêm gan siêu vi B (Lv cộng sự, 2014; Vongvanich cộng sự, 2000) [16][30] 1.2.1 Độc tính tế bào Nhiều cơng trình nghiên cứu gần cho thấy cao chiết từ loài thuộc chi Phyllanthus Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii, Phyllanthus emblica có độc tính dịng tế bào ung thư, -2- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước bao gồm ức chế xâm lấn, di kích hoạt chết theo chương trình tế bào (apoptosis) (Tang cộng sự, 2011) [29] Năm 2011, nghiên cứu Lee cộng cho thấy cao chiết bốn loài, gồm Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii Phyllanthus amarus có tác dụng ức chế di dòng tế bào ung thư phổi A549 dòng tế bào ung thư vú MCF-7, cách kích hoạt trình apoptosis (Lee cộng sự, 2011) [14] IC50 cao chiết methanol lồi có giá trị khoảng 50-180 µg/ml, cao chiết nước khoảng 65-470 µg/ml Trong thành phần cao chiết, hợp chất polyphenol giữ vai trò quan trọng ức chế xâm lấn, di chuyển gắn bám tế bào ung thư Năm 2013, Sumalatha công bố cao chiết ethanol lồi Phyllanthus emblica có tác dụng chống oxy hố có hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư tá tràng HT-29 (Sumalatha, 2013) [27] Ngoài ra, cao chiết polyphenol lồi cịn cho thấy vai trị việc ức chế phân bào kích hoạt q trình apoptosis tế bào ung thư cổ tử cung (Zhu cộng sự, 2013) [31] Nhiều thử nghiệm độc tính tế bào in vitro loại cao chiết từ phận chùm ruột hoạt chất tinh khiết cô lập dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào ung thử phổi NCI-H460, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, tế bào ung thư gan HepG2 1.2.2 Tác dụng ức chế kí sinh trùng Tác dụng kháng ký sinh trùng chi Phyllanthus chưa nghiên cứu nhiều Mặc dù vậy, nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều lồi thuộc chi Phyllanthus có tác dụng hiệu lên ký sinh trùng Năm 2011, nghiên cứu Ajala cộng cho thấy cao chiết lồi P amarus có tác động kháng ký sinh trùng sốt rét Plasmodium yoelii in vivo chuột Swiss (Ajala cộng sự, 2011) [3] Tác động kháng ký sinh trùng loài P amarus tương đương với thuốc kháng ký sinh trùng tiêu chuẩn dùng liều 1600 mg/kg thể trọng chuột/ngày Một nghiên cứu khác ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum kháng thuốc chloroquine cho thấy cao chiết nước cồn loài P amarus ức chế mạnh ký sinh trùng mức độ in vitro với giá trị IC50 11.7 µg/ml (Opong) Một nghiên cứu cho thấy cao chiết nước từ lồi P niruri có tác dụng làm tê liệt chết sán bao tử (Paramphistomes) động vật nhai lại theo thứ tự khoảng -3- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước nồng độ 10 mg/ml (Jahan cộng sự, 2013) [9] Ngồi ra, cao chiết từ chùm ruột kháng ký sinh trùng giun đũa thực vật (Mackeen cộng sự, 1997) [17] Các kết cho thấy, chi Phyllanthus nguồn dược liệu chứa hợp chất kháng nhiều loài ký sinh trùng 1.2.3 Hoạt tính kháng khuẩn Các bệnh nhiễm khuẩn gây nhiều vấn đề nghiêm trọng sức khỏe người Escherichia coli (E coli) vi khuẩn thường trú đường ruột người động vật, số chủng E coli lại có khả gây tiêu chảy nặng nhiều bệnh đường ruột viêm đường tiểu, nhiễm trùng máu E coli có liều gây bệnh thấp lây truyền qua đường phân – miệng Trên giới có nhiều dịch tiêu chảy E coli gây bệnh gây nên dẫn đến nhiều thương vong Theo nghiên cứu GEMS (Global Enteric Multi-Center Study), chủng E coli gây bệnh bốn tác nhân gây tiêu chảy Châu Phi Nam Á Trong đó, tỉ lệ thương vong cao EPEC (enteropathogenic E coli) ETEC (enterotoxigenic E coli) (Kapper cộng sự, 2004) [11] Bệnh lỵ trực trùng (bacilli dysentery), vấn đề sức khỏe quan tâm toàn cầu, bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa với triệu chứng đặc trưng sốt, đau bụng, nôn mửa, tiêu chảy (đi phân lỏng kèm máu dịch nhầy) Trực trùng Shigella xác định nguyên nhân gây bệnh Bệnh lỵ trực trùng có khả lây lan cao từ người sang người qua đường phân – miệng, nguồn nước thực phẩm nhiễm Shigella Trong tổng số ca bị bệnh tiêu chảy toàn giới, có khoảng 5-10% ca nhiễm xác đinh trực trùng Shigella gây Cùng với đó, theo ước tính Tổ chức y tế giới (WHO) năm 1999, số ca nhiễm Shigella chiếm đến 164.7 triệu năm quốc gia phát triển với gần 1.1 triệu ca tử vong 1.5 triệu ca nhiễm năm quốc gia phát triển, có 61% ca tử vong trẻ em tuổi (Kotloff cộng sự, 1999) [12] Cũng theo báo cáo gần Trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm (CDC) - Mỹ, tỉ lệ nhiễm Shigella đến 7.6 ca tổng số 100 000 năm 1993 -4- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Các loại kháng sinh tổng hợp thường sử dụng để đối phó với bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên, 50% loại thuốc sử dụng có nguồn gốc từ thiên nhiên (Sharmin cộng sự, 2015) [26] Việc lạm dụng kháng sinh tổng hợp gây tình trạng kháng đa kháng sinh nhiều chủng vi khuẩn gây nhiều tác dụng phụ khác Việc sử dụng loài thảo dược xem phương pháp thay để đối phó với tình trạng kháng đa kháng sinh vi khuẩn Ngoài việc sử dụng lồi thảo dược cịn làm giảm tác dụng phụ, khơng có độc tính, chi phí thấp (Sharmin cộng sự, 2015) [26] Cây chùm ruột sử dụng y học cổ truyền nhiều quốc gia chất kháng sinh kháng oxy hóa Nghiên cứu Eldeen cộng (2011), cho thấy loài thuộc chi Phyllanthus thu thập Malaysia có khả kháng lại nhiều chủng vi khuẩn gram âm gram dương Escherichia coli, Staphylococcus aures, Bacillus licheniformis, Pseudomonas stutzeri (Eldeen cộng sự, 2011) [8] Một số nghiên cứu Mensah cộng (1990), cho thấy lồi P muellerianus P discoideus có tiềm lớn việc sử dụng chất kháng khuẩn (Mensah cộng sự, 1990) [18] Ở Việt Nam, chùm ruột sử dụng số thuốc dân gian để trị bệnh nhiễm khuẩn Tuy nhiên, nghiên cứu chi tiết hoạt tính lồi khả kháng khuẩn chưa nhiều 1.3 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CHÙM RUỘT PHYLLANTHUS ACIDUS 1.3.1 Những nghiên cứu giới Một số nghiên cứu hoá thực vật chùm ruột thực sớm công bố cô lập triterpene phytosterol (Dekker, 1908; Sengupta Mukhopadhyay, 1966; Pettit cộng sự, 1982) [3][6][25] Các hợp chất triterpene cô lập thuộc khung oleane β-amyrin (22), khung lupane lupeol (23) khung cyclopropyl-hexacyclic triterpenoid phyllanthol (24) Trong đó, hợp chất sterol chủ yếu có khung sitosterol glycoside chúng -5- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước Những nghiên cứu khoảng 15 năm gần loài thuộc chi Phyllanthus công bố cô lập nhóm hợp chất norbisabolane sesquiterpenoid, với hoạt tính sinh học chúng đa dạng (Lv J.-J cộng sự, 2014; Vongvanich cộng sự, 2000) [16][30] Năm 2000, hai hợp chất Phyllanthusol A (2) B (3) lập, có khung sườn serquiterpenoid loại norbisabolane gắn phân tử đường glucosyl mannosamine-N-acetate (Vongvanich cộng sự, 2000) [30] Tuy nhiên, đến năm 2014, với cô lập 19 hợp chất thuộc khung sườn norbisabolane, hợp chất Phyllanthusol A B xác nhận cấu trúc, hai đơn vị đường glucopyranosyl glucosamine-N-acetate Như vậy, nay, 21 hợp chất norbisabolane cô lập, với tên gọi tương ứng phyllanthacidoid A-T (1-21) Trong hai hợp chất phyllantacidoid S (20) T (21) chứa khung sườn lạ so với hợp chất cô lập trước đây, với hợp phần tricyclo[3.1.1.1] có cấu trúc chúng Các hợp chất thử nghiệm hoạt tính kháng virus viêm gan siêu vi B (HBV), với giá trị IC50 khoảng 0.8-36.0 µM (Lv J.-J cộng sự, 2014) [16] Ngoài ra, hợp chất phyllanthacidoid xác định thành phần có rễ chùm ruột, với hàm lượng khoảng mg/g, tính khối lượng rễ chưa khơ (Vongvanich cộng sự, 2000).[30] Q trình chiết xuất phân tích hàm lượng phyllanthacidoid A B xác nhận phương pháp điện di (capillary electrophoresis) (Durham D G cộng sự, 2002) [7] Năm 2010, hợp chất kaemferol (28), adenosine (29), 4-hydroxybenzoic acid (30), hypogallic acid (31), caffeic acid (32) cô lập từ cao n-butanol chùm ruột (Leeya Y cộng sự, 2010) [15] Cao n-butanol toàn phần hợp chất lập có khả làm giảm huyết áp giãn vòng động mạch chủ 1.3.2 Những nghiên cứu nước Năm 2014, nhóm nghiên cứu Nguyen T.T cộng cô lập hợp chất phenylbutanoid diphenylheptanoid, có hợp chất diphenylpentanoid (Nguyen T T cộng sự, 2014) [20] Cho đến nay, hợp chất có khung sườn phenylbutanoid phenylheptanoid chưa công bố chi Phyllanthus Các hợp -6- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước chất cô lập gồm glochodinone (25), 4-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl-2-butanone (26), 1-[4’-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-5-[4”-(O-β-D-glucopyranosyl)phenyl]-3- pentanone (27) Năm 2015, tóm tắt kết nghiên cứu đề tài luận văn Thạc sĩ Võ Thị Như Thảo, với đề tài : “Nghiên cứu tách chiết xác định thành phần hóa học vỏ thân chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam số dịch chiết”, tác giả công bố thu số kết xác định độ ẩm nguyên liệu bột khơ 8.87%; hàm lượng tro trung bình 5.00%; định tính dịch chiết n-hexane có 15 cấu tử hữu thuộc nhóm hợp chất acid hữu cơ, ester, vitamin, sterol; dịch chiết chloroform có cấu tử hữu thuộc nhóm sterol, acid hữu cơ, ester acid béo; dịch chiết ethyl acetate có 14 cấu tử hữu thuộc nhóm acid béo, sterol, sesquiterpene Ngồi ra, tóm tắt luận án cơng bố thơng tin thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn bột vỏ chùm ruột hai dòng chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Klebsiella Tuy nhiên, công bố tác giả không cho thấy xác định cấu trúc hợp chất cô lập từ vỏ thân chùm ruột Tam Kỳ, tỉnh Quảng Nam, nay, kết chưa tìm thấy báo cáo khoa học Việt Nam -7- Khóa luận tốt nghiêp Nguyễn Đình Phước OH OHOH OH OHOH OH OHOH O O R1 O O HO O O R 2 R R H OH H H O OH H OH R =CH3 2a R = H HO 11 O HO HO N-Ac-GlcN H OH O HO H HO HO R R R H (2-1)Glc R2 H OH Glc OH R2 H HO HO HO O OH O O OR HO OHOH O O H HO HO HO HO HO OO O OH 10 CH3 OH HO HO HO Hình 1.2: Một số hợp chất cô lập từ chùm ruột -8- PHỤ LỤC 5425.5.5385.5205155.1835.5.1795.14 814 35 6696.6026.6.5796.5665446 11 16a 16b 7b 0.99001 7a 8.0 7.5 7.0 13 PhPhụlụ clụ1c.1:1.2:PhPhổ ổH -NMRC-NMRcủachủợaphợchpấcht(1)ất (1) 6.6026.5795666.5446 6696 11 16a 1.00 0.99 15 6.7 6.6 Phụ lục 1.1: Phổ H-NMR hợp chất (1) (tiếp theo) 6.5 1.753 1.802 9161.1.9011.8898741 2.00 1.95 1.90 1.85 f1 (ppm) Phụ lục 1.1: Phổ H-NMR hợp chất (1) (tiếp theo) 900 261 102 6a 1.80 12 160 17 14 150 140 332125.329125.119.725119.535019119 261139.700137.135.579 191156.974151.147.985 Phụ lục 1.3: Phổ 13 C-NMR hợp chất (1) 10 20 30 40 50 60 (ppm) f 70 80 90 100 110 120 130 140 8.0 7.5 7.0 PhPhụụlụlcụ1c.4:1.3:PhPhổHổ HSQCcủcaủhaợhpợchpchất ấ(1)t(1) (1)-CDCL3-HMBC 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 7.0 Phụ lục 1.4: Phổ HMBC hợp chất (1) 6.5 6.5 6.0 850 14.0 13.5 13.0 031 3.1 12.5 12.0 3.30 3.2 1.00 0.84 381 9742.2.9672.9399322 0803 1033 1143 3.126 3.137 6343 5135 5205 5.535 5.542 29112 06613 (2)-DMSO-1H 3a 1'' 5OH 3a 11.5 3b 11.0 Phụ lục 2.1: Phổ H-NMR hợp chất (2) 371157.281156.155.486 197.920 2'/6' 3'/5' 1'' 4' f1 (ppm) Phụ lục 2.2: Phổ H-NMR hợp chất (2) 2'/6' 20 1'' 40 60 80 3'/5' (ppm) f 100 2'/6' 120 140 160 180 9.5 Phụ lục 2.3: Phổ HSQC hợp chất (2) 9.0 200 (2)-DMSO-HMBC 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 13.5 Phụ lục 2.4: Phổ HMBC hợp chất (2) 12.5 ... nghiên cứu chùm ruột Phyllanthus acidus (L. ) Skeels (Euphorbiaceae) thu hái huyện Hàm Thu? ??n Bắc, tỉnh Bình Thu? ??n 1.1.3 Mơ tả thực vật Ở Việt Nam, số thu? ??c chi Phyllanthus có danh mục từ điển thu? ??c... khảo sát nguyên liệu Cây chùm ruột Phyllanthus acidus thu hái huyện Hàm Thu? ??n Bắc, tỉnh Bình Thu? ??n vào tháng năm 2014 Tên khoa học xác định Phyllanthus acidus (L. ) Skeels -10- Khóa luận tốt nghiêp... thấy cao chiết từ loài thu? ??c chi Phyllanthus Phyllanthus amarus, Phyllanthus niruri, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus watsonii, Phyllanthus emblica có độc tính dịng tế bào ung thư, -2- Khóa luận