Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp trên bệnh nhân tại bệnh viện ở miền bắc việt nam, 2013 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THANH LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2013-2016 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN THỊ THANH LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2013-2016 Chuyên ngành Vi sinh vật học Mã số 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai PGS TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên thức tham gia nghiên cứu Tơi đƣợc trƣởng nhóm nghiên cứu cho phép sử dụng kết nghiên cứu công bố luận án Các số liệu, kết luận án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác NGHIÊN CỨU SINH Trần Thị Thanh Loan LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin trân trọng cảm ơn:  Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội  Ban Giám đốc Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương cho phép, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực hồn thành luận án Với tất lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn: PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai, Phó viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người hướng dẫn khoa học bảo tận tình tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, giáo viên đồng hướng dẫn, truyền thụ cho kiến thức chun ngành Vi sinh vật học lịng nhiệt tình suốt q trình nghiên cứu, hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới: PGS.TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, Phó trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người thầy người bạn hướng dẫn bảo tận tình để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới :  TS Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học thầy cô giáo môn truyền thụ cho nhũng kiến thức quý báu thời gian qua  TS Hoàng Vũ Mai Phương, Trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương toàn thể bạn đồng nghiệp cơng tác Phịng Thí nghiệm Cúm, Khoa Vi rút nhiệt tình giúp đỡ ủng hộ tơi suốt q trình thực luận án  Tập thể cán Khoa Đông Y thực nghiệm động viên tạo động lực cho suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Cuối cùng, tơi xin dành tất lịng biết ơn tình cảm u q tới Bố, Mẹ tơi, Chồng trai người thân gia đình, bạn thân, đồng nghiệp ln động viên, hỗ trợ tôi, chia sẻ khó khăn vất vả ln hết lịng tơi sống nghiệp! Hà Nội, ngày….tháng… năm 2018 Tác giả Trần Thị Thanh Loan MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP THƢỜNG GẶP 1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae 1.1.2 Vi rút Paramyxoviridae 1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae 1.1.4 Vi rút họ Adenoviridae 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA CÁC CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHỊNG THÍ NGHIỆM DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN TÁC NHÂN VI RƯT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HƠ HẤP CẤP 1.3.1 Xét nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest) 1.3.2 Phân lập vi rút 1.3.3 Phản ứng Realtime PCR/ RT-PCR 1.3.4 Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP 1.3.5 Phƣơng pháp xác định trình tự gen Sanger sequencing 1.3.6 Phƣơng pháp phát kháng thể CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Định nghĩa bệnh viêm đƣờng hô hấp cấp 2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian địa điểm 2.2 VẬT LIỆU 2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 2.2.2 Các dòng tế bào đƣợc sử dụng nghiên cứu 59 2.2.3 Sinh phẩm 60 2.2.4 Các chủng vi rút mẫu chứng 63 2.2.5 Trang thiết bị dụng cụ 64 2.3 SƠ ĐỒ TÓM TẮT NGHIÊN CỨU 65 2.3.1 Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 65 2.3.2 Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 66 2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 67 2.4.1 Phƣơng pháp Realtime RT-PCR 67 2.4.2 Phân lập vi rút 70 2.4.3 Định typ vi rút phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu (HI) 71 2.4.4 Kỹ thuật giải trình tự gen 73 2.4.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 77 2.5 VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU 77 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .78 3.1 ĐẶC ĐIỂM NHÓM ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 78 3.1.1 Kết thu thập mẫu theo thời gian giai đoạn nghiên cứu 78 3.1.2 Đặc điểm đối tƣợng nghiên cứu theo tuổi giới 80 3.2 KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TYP CÁC TÁC NHÂN VI RÖT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP 81 3.2.1 Xác định tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp .81 3.2.2 Sự phân bố vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp theo thời gian .83 3.2.3 Sự phân bố họ vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp miền Bắc Việt Nam, 2013-2016 84 3.3 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VI RÚT CÚM 88 3.3.1 Kết phân lập định typ vi rút cúm, 2013-2016 .89 3.3.2 Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA NA vi rút cúm A/H1N1pdm09 phân lập từ bệnh nhân viêm đƣờng hô hấp cấp, 2013-2016 90 3.3.3 Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA, NA vi rút cúm A/H3N2 phân lập từ bệnh nhân VĐHHC, 2013-2016 96 3.3.4 Đặc điểm di truyền vi rút cúm B phân lập từ bệnh nhân viêm đƣờng hô hấp cấp, 2013-2016 103 3.3.5 Đặc tính kháng nguyên vi rút cúm phân lập từ bệnh phẩm viêm đƣờng hô hấp cấp miền Bắc, 2013-2016 110 3.4 ĐẶC ĐIỂM CÁC VI RƯT KHÁC GÂY VIÊM ĐƢỜNG HƠ HẤP CẤP TẠI MỘT SỐ BỆNH VIỆN KHU VỰC MIỀN BẮC, 2013-2016 114 3.4.1 Phân bố tác nhân vi rút đƣờng hô hấp khác theo thời gian nghiên cứu 116 3.4.2 Phân bố tác nhân vi rút đƣờng hô hấp khác theo lứa tuổi 117 3.4.3 Kết phân lập vi rút đƣờng hô hấp khác 120 KẾT LUẬN 126 KIẾN NGHỊ 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 DA Hình 1 Mơ hình cấ Hình Hệ gen Hình Sự thay đổi Hình Chu trình n Hình Giải phẫu b Hình Nhóm thuốc Hình Mơ hình cấ Hình Hệ gen Hình Chu trình n Hình 10 Cấu trúc virion Piconarviridae Hình 11 Hệ gen vi rút thuộc họ Piconarviridae Hình 12 Ch Hình 13 Hì Hình 14 Cấ Hình 15 Hình 16: Phân tích Real time RT-PC Hình Định typ vi Hình 2 Sơ đồ thực Hình Qu Kết thu 2016 Hình Sự tƣơng q số mẫu thu thập theo thời gian Hình 3 Tỷ lệ vi rút gây viêm Hình Cây gia hệ phân đoạn gen A/H1N1pdm09, 2013-2016 Hình Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1413 nucleotide vi rút cúm A/H1N1pdm09, 2013-2016 Hình Phân tích g miền Bắc, 2013-2016 Hình Cây gia hệ A/H3N2, 2013-2016 Hình Cây gia hệ A/H3N2, 2013-2016 Hình Cây gia hệ Hình 10 Cây gia hệ phân đoạn gen B/Victoria, 2013-2016 Hình 11 2013-2016 Hình 12 Nam, 2013 2016 Hình 13 Nam, 2013-2016 Hình 14 cứu Hình 15 Phân bố tác nhân vi Hình 16 (độ phóng đại x200) Hình 17 Hình ảnh CPE vi rút (độ phóng đại x200) 89 VR03-37520.1-NKQ 90 VR03-37521.1-DH 91 VR03-37522.1-DH 92 VR03-37523.1-DH 93 VR03-37524.1-DH 94 VR03-37525.1-DH 95 VR03-37526.1-DH 96 VR03-37527.1-DH 97 VR03-37528.1-DH PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TÍNH NẶNG NGHI DO VI RÚT 2016 Nơi xét nghiệm: Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng STT Mã bênh nhân VR03-37529.1-DH VR03-37530.1-NKQ VR03-37531.1-DH VR03-37532.1-DH VR03-37533.1-DH VR03-37534.1-DH VR03-37535.1-DH VR03-37536.1-DH VR03-37537.1-NKQ 10 VR03-37538.1-DH 11 VR03-37539.1-NKQ 12 VR03-37540.1-DH 13 VR03-37541.1-DH 14 VR03-37542.1-DH 15 VR03-37543.1-DH 16 VR03-37544.1-NKQ 17 VR03-37545.1-DH 18 VR03-37546.1-NKQ 19 VR03-37547.1-DH 20 VR03-37548.1-DH 21 VR03-37549.1-NKQ 22 VR03-37550.1-NKQ 23 VR03-37551.1-NKQ 24 VR03-37552.1-NKQ 25 VR03-37553.1-DH 26 VR03-37554.1-NKQ 27 VR03-37555.1-DH 28 VR03-37556.1-NKQ 29 VR03-37557.1-DH 30 VR03-37558.1-NKQ 31 VR03-37559.1-DH 32 VR03-37560.1-DH 33 VR03-37561.1-DH 34 VR03-37562.1-DH 35 VR03-37563.1-DH 36 VR03-37564.1-DH 37 VR03-37565.1-NKQ 38 VR03-37566.1-DH 39 VR03-37567.1-NKQ 40 VR03-37568.1-DH 41 VR03-37569.1-DH 42 VR03-37570.1-DH 43 VR03-37571.1-DH 44 VR03-37572.1-DH 45 VR03-37573.1-DM 46 VR03-37574.1-DH 47 VR03-37575.1-DH 48 VR03-37576.1-DH 49 VR03-37577.1-DH 50 VR03-37578.1-DH 51 VR03-37579.1-NKQ 52 VR03-37580.1-NKQ 53 VR03-37581.1-DH 54 VR03-37582.1-DTH 55 VR03-37583.1-DM 56 VR03-37584.1-DM 57 VR03-37585.1-NKQ 58 VR03-37586.1-DH 59 VR03-37587.1-DH 60 VR03-37588.1-NKQ 61 VR03-37589.1-DH 62 VR03-37590.1-NKQ 63 VR03-37591.1-NKQ 64 VR03-37592.1-NKQ 65 VR03-37593.1-DH 66 VR03-37594.1-DH 67 VR03-37595.1-DH 68 VR03-37596.1-DH 69 VR03-37597.1-DH 70 VR03-37598.1-NKQ 71 VR03-37599.1-NKQ 72 VR03-37600.1-NKQ 73 VR03-37601.1-NKQ 74 VR03-37602.1-DH 75 VR03-37604.1-DH 76 VR03-37606.1-DH 77 VR03-37607.1-DH 78 VR03-37608.1-NKQ 79 VR03-37609.1-DH 80 VR03-37610.1-DH 81 VR03-37611.1-DH 82 VR03-37612.1-NKQ 83 VR03-37613.1-NKQ 84 VR03-37614.1-DH 85 VR03-37615.1-DMP 86 VR03-37616.1-DH 87 VR03-37617.1-NKQ 88 VR03-37618.1-DTH 89 VR03-37619.1-DH 90 VR03-37620.1-NKQ 91 VR03-37621.1-DH 92 VR03-37622.1-DH 93 VR03-37623.1-DH 94 VR03-37624.1-DH 95 VR03-37625.1-DH 96 VR03-37626.1-DH 97 VR03-37627.1-DH 98 VR03-37628.1-DH 99 VR03-37629.1-DH 100 VR03-37630.1-DH 101 VR03-37631.1-DH 102 VR03-37632.1-DH 103 VR03-37633.1-DPQ 104 VR03-37634.1-DH 105 VR03-37635.1-DTH 106 VR03-37636.1-DTH 107 VR03-37637.1-DH 108 VR03-37638.1-DH 109 VR03-37639.1-DH 110 VR03-37640.1-DH 111 VR03-37641.1-NKQ 112 VR03-37642.1-DH 113 VR03-37643.1-DH 114 VR03-37644.1-DH 115 VR03-37645.1-DH 116 VR03-37646.1-DH 117 VR03-37647.1-DPQ 118 VR03-37648.1-DH 119 VR03-37649.1-NKQ 120 VR03-37650.1-NKQ 121 VR03-37651.1-DH 122 VR03-37652.1-DH 123 VR03-37653.1-DPQ 124 VR03-37654.1-DH 125 VR03-37655.1-DH 126 VR03-37656.1-NKQ 127 VR03-37657.1-DH 128 VR03-37658.1-DH 129 VR03-37659.1-NKQ 130 VR03-37660.1-NKQ 131 VR03-37661.1-DH 132 VR03-37662.1-NKQ 133 VR03-37663.1-NKQ 134 VR03-37664.1-NKQ 135 VR03-37665.1-DH 136 VR03-37666.1-DH 137 VR03-37667.1-DH 138 VR03-37668.1-DH 139 VR03-37669.1-DH 140 VR03-37670.1-DH 141 VR03-37671.1-DH 142 VR03-37672.1-NKQ 143 VR03-37673.1-NKQ 144 VR03-37674.1-DH 145 VR03-37675.1-DH 146 VR03-37676.1-DH 147 VR03-37677.1-DH 148 VR03-37678.1-DH 149 VR03-37679.1-NKQ 150 VR03-37680.1-NKQ 151 VR03-37681.1-DH 152 VR03-37682.1-DH 153 VR03-37683.1-NKQ PHỤ LỤC PHỤ LỤC Bảng Chủng vi rút cúm A/H1N1 pdm09 giải trình tự phân đoạn gen HA NA, 2013-2016 STT Tên chủng A/Vietnam/HN36942/2013 A/Vietnam/HN36944/2013 A/Vietnam/HN36945/2013 A/Vietnam/HN36946/2013 A/Vietnam/HN36947/2013 A/Vietnam/HN36954/2013 A/Vietnam/HN36955/2013 A/Vietnam/HN36983/2013 A/Vietnam/HN36992/2013 10 A/Vietnam/HN37223/2013 11 A/Vietnam/HN36978/2013 12 A/Vietnam/HN36979/2013 13 A/Vietnam/HN37043/2013 14 A/Vietnam/HN37047/2013 15 A/Vietnam/HN20216/2013 16 A/Vietnam/IS0213085/2013 17 A/Vietnam/IS0213089/2013 18 A/Vietnam/IS0213189/2013 19 A/Vietnam/IS0713035/2013 20 A/Vietnam/IS0713037/2013 21 A/Vietnam/IS0713070/2013 22 A/Vietnam/IS0913135/2013 23 A/Vietnam/NH13049/2013 24 A/Vietnam/NH13111/2013 25 A/Vietnam/NH13246/2013 26 A/Vietnam/NH13284/2013 27 A/Vietnam/DK13120/2013 28 A/Vietnam/2013369/2013 29 A/Vietnam/HS174318/2014 30 A/Vietnam/HS1914375/2014 31 A/Vietnam/37271/2014 32 A/Vietnam/HS1814041/2014 33 A/Vietnam/ELI439/2014 34 A/Vietnam/NH14075/2014 35 A/Vietnam/N162/2014 36 A/Vietnam/KX14079/2014 37 A/Vietnam/KX14038/2014 38 A/Vietnam/NH14243/2014 39 A/Vietnam/DK1479/2014 40 A/Vietnam/HS0914082/2014 41 A/Vietnam/HS0914027/2014 42 A/Vietnam/N44/2014 43 A/Vietnam/N69/2014 44 A/Vietnam/HS1914028/2014 45 A/Vietnam/HS1814140/2014 46 A/Vietnam/DK14116/2014 47 A/Vietnam/HS1714194/2014 48 A/Vietnam/HS1814093/2014 49 A/Vietnam/HS1714156/2014 50 A/Vietnam/37547/2016 51 A/Vietnam/37548/2016 52 A/Vietnam/37552/2016 53 A/Vietnam/37559/2016 54 A/Vietnam/37576/2016 55 A/Vietnam/37577/2016 56 A/Vietnam/37590/2016 57 A/Vietnam/37604/2016 58 A/Vietnam/37607/2016 59 A/Vietnam/37609/2016 60 A/Vietnam/37611/2016 61 A/Vietnam/37613/2016 62 A/Vietnam/SARI02TN16002/2016 63 A/Vietnam/SARI21NO16042/2016 64 A/Vietnam/SARI21NO16043/2016 65 A/Vietnam/SARI21NO16046/2016 66 A/Vietnam/SARI21TN16052/2016 67 A/Vietnam/SARI21NO16069/2016 68 A/Vietnam/SARI21NO16071/2016 69 A/Vietnam/SARI0216CC002/2016 70 A/Vietnam/SARI0216CC003/2016 Bảng Chủng vi rút cúm A/H3N2 giải trình tự phân đoạn gen HA NA, 2013-2016 STT Tên chủng A/Vietnam/36999/2013 A/Vietnam/37079/2013 A/Vietnam/KX14031/2014 A/Vietnam/NH14184/2014 A/Vietnam/HS191401/2014 A/Vietnam/NH14078/2014 A/Vietnam/NH14378/2014 A/Vietnam/IS0714015/2014 A/Vietnam/IS0914137/2014 10 A/Vietnam/IS0914011/2014 11 A/Vietnam/N176/2014 12 A/Vietnam/HS1714315/2014 13 A/Vietnam/N189/2014 14 A/Vietnam/37438/2015 15 A/Vietnam/37440/2015 16 A/Vietnam/37441/2015 17 A/Vietnam/37499/2015 18 A/Vietnam/37454/2015 19 A/Vietnam/37455/2015 20 A/Vietnam/37456/2015 21 A/Vietnam/37478/2015 22 A/Vietnam/37481/2015 23 A/Vietnam/37511/2015 24 A/Vietnam/IS0215272/2015 25 A/Vietnam/IS0915005/2015 26 A/Vietnam/IS0915044/2015 27 A/Vietnam/IS0915082/2015 28 A/Vietnam/37569/2016 29 A/Vietnam/37572/2016 30 A/Vietnam/37631/2016 31 A/Vietnam/SARI0216CC007/2016 32 A/Vietnam/SARI01CC16048/2016 33 A/Vietnam/SARI02TN16028/2016 34 A/Vietnam/SARI01NK16046/2016 35 A/Vietnam/SARI02TN16037/2016 Bảng Chủng vi rút cúm B dòng B/Victora B/Yamagata giải trình tự phân đoạn gen HA, 2013-2016 STT Tên chủng B/Vietnam/2013189/2013 B/Vietnam/2013321/2013 B/Vietnam/N318/2014 B/Vietnam/HS1714154/2014 B/Vietnam/KX14129/2014 B/Vietnam/BNH15017/2015 B/Vietnam/SARI01CC16041/2016 B/Vietnam/SARI02TN16006/2016 PHỤ LỤC Hình ảnh làm việc phịng thí nghiệm ATSH cấp PTN Cúm Máy chạy Realtime RT-PCR Máy giải trình tự Sanger sequencing ... LOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VI? ?M ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VI? ??N Ở MIỀN BẮC VI? ??T NAM, 2013- 2016 Chuyên ngành Vi sinh... bố vi rút gây vi? ?m đƣờng hô hấp cấp theo thời gian .83 3.2.3 Sự phân bố họ vi rút gây vi? ?m đƣờng hô hấp cấp miền Bắc Vi? ??t Nam, 2013- 2016 84 3.3 ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN... đặc điểm vi rút học tác nhân vi rút gây VĐHHC Vi? ??t Nam hạn chế Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu đặc điểm di truyền đặc tính kháng nguyên số tác nhân vi rút gây vi? ?m đƣờng hô