Nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích paraquat trong huyết tương và ứng dụng phục vụ chẩn đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Anh Phƣơng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ ỨNG DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN NGỘ ĐỘC CẤP PARAQUAT Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 62440118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Anh Phƣơng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ ỨNG DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN NGỘ ĐỘC CẤP PARAQUAT Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 62440118 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TẠ THỊ THẢO PGS.TS HÀ TRẦN HƢNG HÀ NỘI - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Vũ Anh Phƣơng LỜI CẢM ƠN Lời cho gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo PGS.TS Hà Trần Hưng tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài viết luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy giáo giảng dạy khoa Hoá, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá q trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc - Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Ánh Hường, PGS.TS Mai Thanh Đức, ThS Đỗ Thị Trang, ThS BSNT Đoàn Thu Hà nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin cảm ơn cơng ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) cung cấp thiết bị CE-C D để thực nghiên cứu này, cảm ơn bạn nhóm nghiên cứu sử dụng phương pháp điện di mao quản CE-C D Bộ mơn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội phối hợp hỗ trợ tơi hồn thành nghiên cứu Cuối tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè ln động viên, chia sẻ khó khăn Hà Nội, ngày 08 tháng 01 năm 2019 Học viên Vũ Anh Phƣơng MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 T ng quan paraquat 1.1.1 Cơng thức hóa học, tính chất lý hóa học paraquat 1.1.2 Thực trạng sử dụng paraquat 1.1.3 Độc tính paraquat 1.1.4 Dược động học paraquat 1.2 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat huyết tương 10 1.3 Các phương pháp xác định paraquat huyết tương 16 1.3.1 Phương pháp quang ph hấp thụ phân tử (UV - Vis) 16 1.3.2 Các phương pháp sắc ký 17 1.3.2.1 Phương pháp sắc ký khí 17 1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng 20 1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (CE) 23 1.3.3.1 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector UV (CE - UV) 25 1.3.3.2 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C D) 25 1.3.3.3 Ứng dụng phương pháp điện di mao quản phân tích paraquat 27 1.4 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích paraquat 29 1.4.1 Phương pháp kết tủa protein 30 1.4.2 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 31 1.4.3 Phương pháp chiết pha rắn 33 1.5 Kết luận chung phần t ng quan 38 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM 40 2.1 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 40 2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 40 2.1.2 Chất chuẩn 41 2.1.3 Hóa chất, dung mơi 42 2.1.4 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 43 2.2 Đối tượng nghiên cứu 44 2.2.1 Bệnh nhân 44 2.2.2 Mẫu nghiên cứu 44 2.3 Phương pháp nghiên cứu 46 2.3.1 Phương pháp định tính PQ nước tiểu 46 2.3.2 Phương pháp lấy mẫu tiền xử lý mẫu huyết tương 46 2.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng detector DAD (HPLC/ DAD) 47 2.3.3.1 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu q trình phân tích PQ mẫu huyết tương trắng thêm chuẩn 47 2.3.3.2 Phương pháp tối ưu quy trình xử lý mẫu huyết tương huyết tương phân tích phương pháp HPLC/DAD 48 2.3.4 Phương pháp điện di mao quản (CE - C D) 49 2.3.4.1 Phương pháp khảo sát điều kiện tối ưu phân tích dung dịch PQ chuẩn 49 2.3.4.2 Phương pháp tối ưu hóa quy trình xử lý mẫu huyết tương phân tích phương pháp CE - C D 50 2.3.5 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích 53 2.3.5.1 Tính chọn lọc 53 2.3.5.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 54 2.3.5.3 Độ chụm phương pháp 54 2.3.5.4 Độ phương pháp phân tích 54 2.3.5.5 Độ ổn định phương pháp 55 2.3.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo 55 2.4 Áp dụng chẩn đoán, tiên lượng điều trị ngộ độc cấp PQ 56 2.5 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 58 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59 3.1 Phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC/DAD) định lượng paraquat huyết tương 59 3.1.1 Lựa chọn điều kiện phù hợp hệ thống phân tích HPLC/DAD 59 3.1.1.1 Xác định bước sóng phát chất phân tích với detector DAD 59 3.1.1.2 Ảnh hưởng thể tích vòng mẫu 59 3.1.1.3 Lựa chọn loại pha động 61 3.1.1.4 Ảnh hưởng tỉ lệ thành phần pha động 62 3.1.1.5 hảo sát ảnh hưởng pH pha động 64 3.1.1.6 hảo sát nồng độ cấu tử pha động 65 3.1.1.7 hảo sát ảnh hưởng tốc độ d ng 70 3.1.2 hảo sát phương pháp xử l mẫu huyết tương phân tích PQ 71 3.1.2.1 hảo sát nồng độ dung dịch CA 72 3.1.2.2 hảo sát th i gian lắc xoáy 73 3.1.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp HPLC 75 3.1.3.1 ính đặc hiệu 75 3.1.3.2 Đư ng chuẩn giới hạn phát v giới hạn định lượng 76 3.1.3.3 Đánh giá độ xác phương pháp phân tích 78 3.1.3.4 Đánh giá độ lặp lại tái lặp lại phương pháp phân tích 81 3.2 Nghiên cứu định lượng paraquat huyết tương người phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc (CE - C D) 88 3.2.1 Tìm điều kiện tối ưu phân tích paraquat phương pháp CE - C D .88 3.2.1.1 Ảnh hưởng loại đệm 89 3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng th i gian bơm mẫu 95 3.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng tách 96 3.2.1.4 Ảnh hưởng cation đến trình phân tách PQ 98 3.2.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương 100 3.2.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp CE - C D 119 3.2.3.1 ính đặc hiệu phương pháp 119 3.2.3.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 119 3.2.3.3 Xây dựng đư ng chuẩn PQ 121 3.2.3.4 Đánh giá độ phương pháp 123 3.2.3.5 Đánh giá độ chụm (độ chụm lặp lại v độ chụm tái lặp) 124 3.2.3.6 Ước lượng độ không đảm bảo đo 126 20 mV PQ Vµo viƯn Sau läc Sau läc Sau läc 3.4 Hình 3.51 Điện di đồ kết phân tích mẫu huyết tương lúc vào viện đến sau lọc âm tính bệnh nhân điển hình Kết so sánh cặp nồng độ PQ huyết tƣơng lúc vào viện đƣợc phân tích phƣơng pháp HPLC CE - C D Paired T-Test and CI: CE-C D, HPLC Paired T for CE-C4D - HPLC CE-C4D HPLC Difference 95% CI for mean difference: (-0.613, 0.502) T-Test of mean difference = (vs not = 0): T-Value = -0.20 P-Value = 0.845 Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn - Phương pháp HPLC: Regression Analysis: Diện tích pic (mAu) versus Nồng độ PQ (ppm) The regression equation is Diện tích pic (mAu) = 0,780 + 205 Nồng độ PQ (ppm) Predictor Constant Nồng độ PQ (ppm) 205,066 S = 0,962019 172 Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total - Phương pháp CE - C D:  Đường chuẩn dung dịch chuẩn PQ Regression Analysis: Diện tích pic (mV.s) versus Nồng độ PQ (ppm)_1 The regression equation is Diện tích pic (mV.phut) = - 2,2 + 9,14 Nồng độ PQ (ppm)_1 Predictor Constant Nồng độ PQ (ppm)_1 S = 22,4167 Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total  Đường chuẩn PQ huyết tương g The regression equation is ện Predictor Constant ng độ S = 3,96326 Analysis of Variance Source Regression Residual Error Total 173 Sơ đồ nghiên cứu phác đồ điều trị lọc máu hấp phụ  Sơ đồ nghiên cứu Hình 3.52 Sơ đồ nghiên cứu  Phác đồ lọc máu hấp phụ resin cho bệnh nhân ngộ độc paraquat trung tâm chống độc - CHỈ ĐỊNH BN chẩn đoán ngộ độc paraquat: + BN uống paraquat (>5ml) + Xét nghiệm paraquat niệu dương tính + Đến viện thời gian 12 sau uống 174 - CHỐNG CHỈ ĐỊNH Tuyệt đối: + Suy hô hấp: pO2 < 60 mmHg, SpO2 < 92% + Tụt huyết áp < 90/60 mmHg + Toan chuyển hóa nặng (pH ≤ 7,2) Tương đối: + Rối loạn đông máu + Dị ứng thành phần lọc - TIẾN HÀNH + Phương tiện + Máy lọc máu: máy lọc máu ngắt quãng + Quả lọc:  Quả lọc hấp phụ HA230  Quả lọc máu ngắt quãng + Bộ dây lọc ngắt quãng dây nối lọc + Chống đông + Heparin TLPT thấp: Enoxaparin (Lovenox): + Liều dùng: 60 - 80 UI/Kg + Đường dùng: tiêm t nh mạch + Thời điểm dùng: trước bắt đầu rút máu 20-30 phút + Tiến hành lọc m u + Lọc máu lần đầu:  Bắt đầu lọc chẩn đoán xác định đủ tiêu chuẩn lọc máu + Lọc máu lần 2:  Ch định: sớm tốt sau lọc máu lần 1, không phụ thuộc nồng độ paraquat huyết tương sau lọc lần  Nếu tiểu cầu trước lọc lần thứ 100.000/ml lọc máu lần lọc máu lần vừa lọc vừa truyển tiểu cầu đảm bảo tiểu cầu > 80.000/ml 175 + Lọc máu từ lần 3:  Ch định: Lọc sau lần lọc thứ xét nghiệm paraquat huyết tương sau lọc lần c n dương tính  Lọc sau lần từ - 12 paraquat huyết tương sau lọc lần âm tính, sau 8-12 làm lại dương tính (do tái phân bố)  hông lọc lần sau lọc lần paraquat huyết tương âm tính + Lọc máu từ lần trở đi:  Ch định: Lọc sau lần sau lọc lần paraquat huyết tương dương tính Sau lọc lần âm tính lọc lần sau - 12 (nếu XN dương tính lại)  + Các lần lọc sau ch định tương tự Lọc máu lần cuối sau lần trước paraquat âm tính, thời gian chờ - 12 xét nghiệm dương tính lại Nếu sau - 12 xét nghiệm âm tính không cần lọc máu - Xét nghiệm Các loại XN: + Cơ bản: paraquat nước tiểu, công thức máu, đông máu bản, sinh hóa máu (ure, creatinin, điện giải đồ, canxi, SGOT, SGPT, C , khí máu động mạch, định lượng paraquat huyết tương sau lọc + XN khác: XQ ph i, CT scanner ph i h i điểm l m XN: + Các XN làm trước sau lần lọc máu + XN khác: theo tình trạng bệnh  Những lƣu ý:  hông giới hạn số lần lọc máu tối đa Mục tiêu lọc máu liên tục đến paraquat niệu âm tính lọc thêm lần  Thời gian lọc nhau: 2,5 Tốc độ máu 150-250 ml/phút  Có thể đặt sonde bàng quang lấy nước tiểu xét nghiệm để tránh trì hỗn thời gian bắt đầu lọc máu 176  Lọc máu lần không cần đợi xét nghiệm công thức máu sau lọc lần Nếu tiểu cầu trước lọc lần < 100.000/ml vừa lọc lần vừa truyền tiểu cầu đảm bảo tiểu cầu >80.000/ml  Các lần lọc từ thứ trở lọc cần có kết xét nghiệm tiểu cầu đông máu để định dùng chống đông truyền tiểu cầu yếu tố đông máu cần  trị Dự ph ng nguy hạ kali máu thời điểm vào viện trình điều Quy trình phân tích hồn chỉnh định lƣợng paraquat phƣơng pháp HPLC/DAD phƣơng pháp CE-C D  Quy trình phân tích paraquat phƣơng pháp HPLC/DAD - Xử l mẫu huyết tương: ml huyết tương 1mL TCA % Hỗn dịch Ly tâm 15 phút (4000 vịng/phút) Lấy dịch phía Dung dịch Lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm Dịch lọc 177 - Điều kiện phân tích thiết bị HPLC: cột tách cột pha đảo Zorbax cột bảo vệ C8 Pha động gồm hai kênh theo tỷ lệ thể tích 5:95 gồm ACN hỗn hợp dung dịch đệm phosphate pH= 2,5 200 ml methanol có thêm 1,10g chất tạo cặp ion sodium 1-heptane sulfonate; 2,00 g KCl; 2,00 ml polyethylenglycol 400 0,05 % triethylamine  Quy trình phân tích paraquat phƣơng pháp CE-C D (xử lý mẫu phƣơng pháp chiết pha rắn cột C18 không sử dụng chất tạo cặp ion) - Tiền xử l mẫu: Mẫu máu toàn phần bệnh nhân ngộ độc PQ ly tâm 10 phút, tách lấy phần huyết tương Sau đó, thêm vào huyết tương 0,4 ml TCA 0,6 ml nước deion, lắc xoáy phút, ly tâm 4000 v ng/phút 10 phút Dịch phía kiềm hố 0,5 ml dung dịch NH3 25 , sau thêm EDTA 10 cho qua cột C18 - Chiết mẫu qua cột C18: 178 -3 M Đây dung dịch mẫu chuẩn bị - Sau thu dịch chiết, tiến hành phân tích điện di mao quản silica có t ng chiều dài 60 cm, chiều dài hiệu dụng 50 cm, đường kính 75 µm; với hệ đệm Histidin (10mM)/ acetic acid (pH=4,0), bơm mẫu theo kiểu thủy động học kiểu xi phông độ cao 10 cm thời gian 30s., tách +20 kV 179 ... ? ?Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phân tích paraquat huyết tƣơng áp dụng phục vụ chẩn đoán, điều trị bệnh nhân ngộ độc cấp paraquat? ?? với ba mục tiêu: 1 .Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích paraquat. .. Vũ Anh Phƣơng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PARAQUAT TRONG HUYẾT TƢƠNG VÀ ỨNG DỤNG PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN ĐIỀU TRỊ BỆNH NHÂN NGỘ ĐỘC CẤP PARAQUAT Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 62440118... tuyến địa phương 3.Áp dụng định lượng paraquat mẫu huyết tương bệnh nhân ngộ độc paraquat bệnh viện tuyến trung ương hai phương pháp từ đánh giá hiệu phục vụ điều trị ngộ độc cấp PQ dựa vào nồng