xây dựng phương pháp phân tích fluconazol trong huyết tương bằng hplc

Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ Fluconazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất Fluconazo

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương

sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian hoàn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất tới thầy giáo TS Lê Đình Chi thuộc bộ môn Hóa phân tích – Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội và TS Tạ Mạnh Hùng – Giám đốc Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – những người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn chị Phan Thị Nghĩa cùng toàn thể các anh chị tại

Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tạo điều kiện và chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô, ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt nhất cho em

trong 5 năm học qua

Cuối cùng, em xin cảm ơn những người thân, bạn bè – những người luôn bên cạnh quan tâm, động viên em trong suốt thời gian qua

Do sự thiếu sót về kinh nghiệm và thời gian thực hiện nên đề tài không tránh khỏi nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018 Sinh viên

An Duy Mạnh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Fluconazol 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Tính chất hóa lí 2

1.1.3 Dược động học 2

1.1.4 Chỉ định 3

1.1.5 Chống chỉ định 3

1.1.6 Dạng thuốc và hàm lượng 3

1.2 Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng Fluconazol trong huyết tương 3

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) 5

1.3.1 Nguyên tắc 5

1.3.2 Cấu tạo máy HPLC 6

1.3.3 Một số thông số đặc trưng của HPLC 7

1.3.4 Các phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 9

1.4 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương bằng HPLC và thẩm định phương pháp phân tích 10

1.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương bằng HPLC 10

1.4.1.1 Xác định điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội: 10

1.4.1.2 Khảo sát các phương pháp xử lí mẫu 10

1.4.1.3 Xác định LLOQ 11

1.4.1.4 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 11

1.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 11

1.4.2.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu 12

1.4.2.2 Độ phù hợp hệ thống 12

1.4.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 13

1.4.2.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ): 13

1.4.2.5 Độ đúng, độ chính xác 14

1.4.2.6 Tỉ lệ thu hồi 14

1.4.2.7 Độ ổn định 15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Máy móc, thiết bị 16

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol trong huyết tương bằng HPLC……… 17

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa Fluconazol 18

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc 18

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 19

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol trong huyết tương 24

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội 24

3.1.2 Khảo sát và tìm điều kiện xử lý mẫu 28

3.1.3 Quy trình phân tích FLU trong huyết tương 30

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 31

3.2.1 Tính chọn lọc- đặc hiệu 31

3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 33

3.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 33

3.2.4 Giới hạn định lượng dưới 35

3.2.5 Độ đúng- độ lặp lại trong ngày và khác ngày 36

3.2.6 Tỉ lệ thu hồi của phương pháp 39

3.2.7 Độ ổn định 40

BÀN LUẬN 46

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit Of Quantification)

LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control

Sample) MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control

Sample) p.a : Tinh khiết phân tích (pure analysis)

QC : Mẫu kiểm soát chất lượng (Quality Control Sample)

SKĐ : Sắc ký đồ

TW : Trung ương

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper Limit Of Quantification)

US-FDA : Cục quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (The United States Food and

Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng FLU trong máu 4 2.1 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 16 2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu 16 2.3 Các thuốc thử dùng trong nghiên cứu 17 2.4 Các mẫu huyết tương trắng đã dùng trong nghiên cứu 17

3.10 Kết quả độ ổn định dung dịch chuẩn FLU gốc, IS gốc thời gian ngắn

3.14 Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng

3.15 Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương 44 3.16 Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto- sampler 45

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.1 Sơ đồ khối của 1 máy sắc kí lỏng hiệu năng cao 7 3.1 SKĐ mẫu huyết tương trắng 24 3.2 SKĐ FLU trong huyết tương trắng 24 3.3 Phổ hấp thụ UV-VIS của fluconazol 25

3.4 SKĐ Fluconazol trong pha động đệm phosphate pH 7,0: MeCN

3.5 SKĐ FLU và nội chuẩn ketoconazol 26 3.6 SKĐ FLU và nội chuẩn itraconazol 26 3.7 SKĐ FLU và nội chuẩn acetanilid 27

3.8 SKĐ của FLU và IS trong hỗn hợp MeOH: H2O (1:1) với pha động

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tình trạng gia tăng đáng báo động của nhiễm nấm cục bộ đã được nhận thấy tại cộng đồng (xảy ra ở những bệnh nhân nhiễm HIV), cũng như trong bệnh viện (chủ yếu xuất hiện ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch) Điều này có thể do sử dụng ngày càng nhiều các thuốc ức chế miễn dịch hoặc hóa trị liệu ở bệnh nhân ung thư, sự gia tăng số lượng bệnh nhân cấy ghép hay sự sử dụng rộng rãi các kháng sinh phổ rộng [7], [14], [16], [19]

Fluconazol là thuốc đầu tiên của nhóm thuốc tổng hợp triazole chống nấm mới, được sử dụng rộng rãi để chống nấm ở những trường hợp như: viêm màng não do

Criptococcus neoformans ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch (HIV/AIDS), nhiễm

khuẩn toàn thân, nhiễm trùng đường uống hoặc tiết niệu, bệnh nấm da (do Tinea pedis, Tinea corporis, Tinea cruris, Tinea versicolor) Nó có thể sử dụng với mục đích dự

phòng ở bệnh nhân có hội chứng suy giảm miễn dịch để ngăn ngừa sự tái phát nhiễm

Candida spp hoặc viêm màng não do Criptococcus neoforman Fluconazol có thể

chống lại hầu hết các loại nấm gặp phải trong thực hành lâm sàng và nấm ngoài da [1], [14]

Tuy nhiên cơ chế tác dụng của Fluconazol phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ và

có nhiều trường hợp bệnh nhân ngộ độc thuốc Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thường thể hiện rất rõ và phức tạp Do đó việc nghiên cứu về sinh khả dụng, dược động học, dược lâm sàng của các chế phẩm Fluconazol, đặc biệt kiểm soát nồng Fluconazol trong huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với từng cá thể là hết sức cần thiết Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ Fluconazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất Fluconazol, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Xây dựng phương pháp phân tích Fluconazol trong huyết tương bằng HPLC” với

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Fluconazol

1.1.3 Dược động học

• Fluconazol được hấp thụ tốt qua đường uống và sinh khả dụng đường uống ≥ 90% Hấp thu không bị ảnh hưởng bởi thức ăn Nồng độ tối đa trong huyết tương đạt được trong vòng 1-2 giờ (Cmax = 3,7 µg/mL), nồng độ ổn định đạt được trong vòng 5-

7 ngày [1], [ 18]

• Thuốc phân bố rộng rãi trong các mô và dịch cơ thể Nồng độ trong sữa mẹ, dịch khớp, nước bọt, đờm, dịch âm đạo và dịch màng bụng tương tự nồng độ trong huyết tương Nồng độ trong dịch não tủy đạt từ 50% đến 90% nồng độ trong huyết tương ngay cả khi màng não không bị viêm Tỉ lệ gắn với protein khoảng 12% [1]

• Thuốc thải trừ qua nước tiểu ở dạng nguyên thể với tỉ lệ 80% hoặc cao hơn Thời gian bán thải khoảng 30 giờ, và tăng ở người bệnh suy thận Thuốc cũng được loại bằng thẩm tách [1]

1.1.4 Chỉ định

• Fluconazol được chỉ định trong điều trị các bệnh nấm Candida ở miệng - họng, thực quản, âm hộ - âm đạo và các bệnh nhiễm nấm Candida toàn thân nghiêm trọng khác (như nhiễm Candida đường niệu, màng bụng, máu, phổi và nhiễm Candida phát tán) Thuốc cũng được dùng để chữa viêm màng não do Cryptococcus neoformans, các bệnh nấm do Blastomyces, Coccidioides immitis và Histoplasma [1], [22]

• Fluconazol cũng dùng để dự phòng nhiễm nấm Candida cho người ghép tủy

xương đang điều trị bằng hóa chất hoặc tia xạ Ngoài ra thuốc còn được dùng để phòng

các bệnh nhiễm nấm trầm trọng (như nhiễm nấm Candida, Cryptococcus,

Histoplasma, Coccidioides immitis) ở người bệnh nhiễm HIV [1], [22]

• Dung dịch tiêm truyền tĩnh mạch 2 mg/ml, lọ 25 ml, lọ 100 ml [1], [23]

1.2 Một số phương pháp phân tích đã được nghiên cứu để định lượng Fluconazol trong huyết tương

Các phương pháp phân tích Fluconazol trong huyết tương thường dùng sắc kí lỏng pha đảo kết hợp detector khối phổ hoặc detector tử ngoại- khả kiến Hầu hết các phương pháp định lượng đều sử dụng chất chuẩn nội

Một số phương pháp định lượng Fluconazol trong huyết tương được trình bày ở bảng sau:

Bảng 1.1 Tóm tắt các nghiên cứu đã thực hiện định lượng nồng độ fluconazol trong máu

dihydrophosphate (pH 3,0) (15: 85)

[12] Cột Zorbax

SB-C18

Methanol: acid formic 0,1% (45:

55)

Detector khối phổ (MS)

➢ Có thể phân sắc kí lỏng phân bố thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc kí lỏng- lỏng và sắc kí pha liên kết Hiện nay, sắc kí pha liên kết chiếm ưu thế, thay thế cho sắc

kí lỏng- lỏng Trong sắc kí pha liên kết, pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn (silica, alumina…) Loại pha tĩnh phổ biến nhất được chế tạo từ silic dioxid (silica) Nhóm OH trên bề mặt hạt silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan

Bề mặt Silica Dẫn chất Clorosilan Dẫn chất Siloxan

Ở đây R có thể là mạch thẳng có 18 hoặc 8 carbon hoặc các nhóm chức hữu cơ khác như amin mạch thẳng, nitril, hydrocarbon thơm Tính chất phân cực của pha tĩnh thay đổi tùy thuộc vào gốc R [3], [4]

➢ Phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh, người ta phân ra

2 loại: sắc kí pha thuận và sắc kí pha đảo Sắc kí pha đảo là loại hình hay được sử dụng trong phân tích thuốc Loại hình sắc kí này sử dụng pha tĩnh không phân cực như hydrocarbon, pha động phân cực hơn pha tĩnh như nước, acetonitril Trong sắc kí pha đảo, các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên, khi tăng độ phân cực của pha động, thời gian lưu tăng lên [3], [4]

➢ Trong sắc kí có 3 thành phần tương tác với nhau: pha tĩnh, pha động và chất phân tích Để có thể tách bằng sắc kí phân bố thành công cần chọn điều kiện để cân bằng lực tương tác giữa 3 thành phần này Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu mô tả định tính lực tương tác

✓ Với pha tĩnh: dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan

✓ Với pha động: dựa vào chỉ số độ phân cực Snyder của dung môi

✓ Với chất phân tích: dựa vào nhóm chức

Để tách sắc kí người ta có thể lựa chọn theo một trong 2 nguyên tắc sau:

• Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha tĩnh và khác xa độ phân cực của pha động

• Độ phân cực của chất phân tích hợp với độ phân cực của pha động và khác nhiều với độ phân cực của pha tĩnh

Nhiều tác giả nhận thấy chọn theo nguyên tắc 1 có xác suất thành công cao hơn Còn nguyên tắc 2 thì pha tĩnh khó cạnh tranh các chất phân tích với pha động nên thời gian lưu quá ngắn [3], [4]

1.3.2 Cấu tạo máy HPLC

Tuy có nhiều kĩ thuật để định lượng bằng sắc kí lỏng, nhưng nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc kí lỏng đều giống nhau, có một số bộ phận kết nối với nhau:

Thải

Hình 1.1 Sơ đồ khối của một máy sắc kí lỏng hiệu năng cao

1.3.3 Một số thông số đặc trưng của HPLC

1.3.3.1 Thời gian lưu t R

• Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất

đó được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

• Thời gian lưu là đại lượng để định tính một chất [3], [4]

Trong đó CS và CM lần lượt là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh và pha động

• Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm

• Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn, tuy nhiên nếu khác nhau quá nhiều thì thời gian phân tích quá dài [3], [4]

Hệ thống cấp dung môi

Bơm Bộ phận

tiêm mẫu

Cột sắc kí Detector

Hệ thu nhận

xử lý dữ liệu

Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích (phút)

t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột (phút)

✓ Nếu k’ quá nhỏ (<<1): quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh nên khó xác định được chính xác thời gian lưu tR

✓ Nếu k’ quá lớn: quá trình rửa giải diễn ra quá dài, tốn dung môi

Trên thực tế 1 ≤ k’ ≤ 5 là tối ưu [3], [4]

1.3.3.4 Hệ số chọn lọc α

Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỉ đối của 2 chất A và B:

' '

(Theo quy ước KB > KA nên α >1 )

Để tách riêng 2 chất A và B cần α > 1; chọn α dao động trong khoảng từ 1,05 đến

2 Nếu α quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài [3], [4]

tRA, tRB: thời gian lưu của 2 chất A và B (phút)

WA, WB: độ rộng pic đo ở đáy pic A và B (phút)

W1/2(A), W1/2(B): độ rộng pic đo ở nửa chiều cao của A và B (phút)

Độ phân giải tối ưu: R= 1,5 [3], [4]

1.3.3.6 Hệ số kéo đuôi T

b T

a

=

Trong đó: a, b: chiều rộng phần trước và sau tại 10% chiều cao peak

T càng gần 1, peak càng đối xứng

✓ Nếu T ≤ 2,5 thì phép định lượng chấp nhận được

✓ Nếu T ≥ 2,5 thì điểm cuối của peak rất khó xác định [3], [4]

1.3.4 Các phương pháp định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng

độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng hay được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn, phương pháp chuẩn hóa diện tích Hiện nay, phương pháp chuẩn nội được sử dụng nhiều nhất để định lượng thuốc trong huyết tương Phương pháp chuẩn nội khắc phục được những nhược điểm của phương pháp chuẩn ngoại, giúp hạn chế tối đa những sai số có thể gây ra do máy móc, kỹ thuật nhất là với những qui trình xử lý mẫu phức tạp và các mẫu có hàm lượng chất cần định lượng thấp

❖ Nguyên tắc phương pháp chuẩn nội: thêm cả vào mẫu chuẩn và mẫu thử những

lượng bằng nhau của một chất tinh khiết (chất chuẩn nội) rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện

❖ Nguyên tắc lựa chọn chất chuẩn nội:

• Trong cùng điều kiện sắc ký, chất IS phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử

• Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử

• Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử

• Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử

• Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm

❖ Trong phương pháp chuẩn nội có 2 phương pháp là:

• Chuẩn hóa 1 điểm

• Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn ít nhất là 5 mẫu có nồng độ chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng chuẩn nội bằng nhau Tiến hành

chạy sắc ký các mẫu, xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa tỷ số diện tích (hay chiều cao) pic của chất chuẩn với chuẩn nội (SS / SIS) so với tỷ số nồng độ chất chuẩn với chuẩn nội (CS / CIS) Dựa vào đường chuẩn để tìm ra nồng độ chất thử [3], [4]

1.4 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương bằng HPLC và thẩm định phương pháp phân tích

1.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương bằng HPLC

Quá trình xây dựng phương pháp phân tích thuốc trong huyết tương bằng HPLC bao gồm các bước sau:

1.4.1.1 Xác định điều kiện sắc kí và lựa chọn chuẩn nội:

✓ Từ các dữ liệu tham khảo được, xác định sơ bộ điều kiện sắc kí và lựa chọn một

số chất chuẩn nội thích hợp cho phương pháp

✓ Chuẩn bị dd phân tích, dd chuẩn nội trong pha động, tiêm sắc kí

✓ Điều chỉnh pha động, tốc độ dòng, IS để pic của chất phân tích và IS cân đối, tách nhau rõ ràng trên sắc kí đồ và có thời gian lưu không quá dài [8], [9], [10]

1.4.1.2 Khảo sát các phương pháp xử lí mẫu

• Chuẩn bị mẫu là giai đoạn rất quan trọng nhằm loại bỏ các thành phần tạp không mong muốn và làm giàu mẫu Nếu protein trong huyết tương được tiêm vào cột sắc kí thì nó có thể bị tủa bởi pha động gây tắc đường dẫn, tăng áp suất hệ thống Một số phương pháp làm sạch mẫu, làm giàu chất phân tích:

✓ Tủa protein (bằng HClO4, acetonitril, các chất diện hoạt…)

1.4.1.4 Xác định khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn

✓ Dự kiến khoảng nồng độ cần khảo sát để xây dựng đường chuẩn: Khoảng tuyến tính phải từ 1/30 - 1/10 Cmax đến 2 - 3 Cmax để phương pháp phân tích có thể áp dụng cho nhiều nghiên cứu thử tương đương sinh học với các mức liều khác nhau

✓ Xây dựng đường chuẩn gồm ít nhất 6 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng 1 mẫu dịch sinh học để khảo sát

Yêu cầu: phải có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn với đáp ứng pic trong khoảng nồng độ khảo sát

*** Yêu cầu của phương pháp:

• Thời gian phân tích không quá dài (< 10 phút)

• Pic của chất phân tích và IS cân đối (hệ số kéo đuôi Tailing factor ≤ 2), tách nhau

rõ ràng và tách tốt khỏi tạp của nền mẫu

• Đáp ứng pic và thời gian lưu của chất phân tích và IS ổn định

• Tỉ lệ thu hồi cao và ổn định

• Pic tinh khiết ở nồng độ thấp

minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích những mẫu được khảo sát [9], [10]

• Tính chọn lọc - đặc hiệu được coi là đạt khi kết quả thu được trên sắc ký đồ cho các đáp ứng pic thỏa mãn đồng thời các điều kiện sau:

✓ Đối với mẫu LLOQ, pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu và đáp ứng yêu cầu: T ≤ 2

✓ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu trắng không được vượt quá 20% đáp ứng của chất phân tích ở nồng độ LLOQ

✓ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của mẫu trắng không được vượt quá 5% đáp ứng của IS

[8], [9], [10]

1.4.2.2 Độ phù hợp hệ thống

Yêu cầu đánh giá sự phù hợp của hệ thống sắc kí (SST) trước khi tiến hành thẩm định phương pháp và cách 5 ngày thẩm định liên tục đánh giá lại Khi hệ thống đạt yêu cầu mới đánh giá các chỉ tiêu tiếp theo

• Pic cân đối, hệ số kéo đuôi (T) của chất phân tích và IS phải ≤ 2%

• Diện tích pic của chất phân tích và IS lặp lại tốt, CV ≤ 2%

• Tỷ lệ đáp ứng pic giữa chất phân tích và IS lặp lại tốt, CV ≤ 2%

• Thời gian lưu của chất phân tích và IS lặp lại tốt, CV ≤ 1%

• Độ phân giải giữa pic của chất phân tích, IS và pic gần nhất phải ≥ 1,5

[8], [9], [10]

1.4.2.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

• Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa các đáp ứng của pic (diện tích hay chiều cao) và nồng độ chất cần phân tích trong dịch sinh học Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính

• Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ khoảng nồng độ của các mẫu phân tích Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng phương trình hồi quy: y = ax + b với hệ

số tương quan tuyến tính r, thu được từ phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu)

• Trong khoảng nồng độ khảo sát, đường chuẩn cần đáp ứng các điều kiện sau:

✓ Độ đúng so với giá trị thực của nồng độ phải từ 85-115%, trừ điểm LLOQ phải

từ 80-120%

✓ Khoảng tuyến tính có hệ số tương quan ≥ 0,98

[8], [9], 10]

1.4.2.4 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):

• Tiến hành phân tích trên 6 mẫu huyết tương trắng và 6 mẫu tự tạo có chứa chất phân tích và IS ở nồng độ LLOQ dự kiến

• Nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là giới hạn định lượng dưới nếu thỏa mãn các tiêu chí sau:

✓ Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng của mẫu trắng tương ứng

✓ Độ đúng phải bằng 80% – 120% so với nồng độ thực

✓ Độ chính xác thể hiện bằng giá trị CV% khi tiến hành phân tích trên ít nhất 5 mẫu LLOQ độc lập phải nhỏ hơn hoặc bằng 20%

[8], [9], [10]

1.4.2.5 Độ đúng, độ chính xác

• Độ đúng của phương pháp phân tích là giá trị phản ánh độ gần sát của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Độ đúng được xác định trên 3 mức nồng độ trong khoảng nồng độ làm việc dự kiến, mỗi nồng độ tối thiểu 6 mẫu

Độ đúng của phương pháp phân tích đạt khi tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115% so với giá trị thực đã pha, riêng với giá trị giới hạn định lượng dưới LLOQ cho phép từ 80 – 120%

• Độ chính xác của phương pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng 1 mẫu thử đồng nhất Độ chính xác bao gồm độ lặp lại trong ngày và độ lặp lại khác ngày, được biểu thị bằng giá trị của hệ số biến thiên CV(%)

Độ chính xác của phương pháp phân tích đạt yêu cầu khi thỏa mãn 2 điều kiện sau:

✓ Độ lặp lại trong ngày: độ lệch CV% giữa các nồng độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị ≤ 15%

✓ Độ lặp lại giữa các ngày: giá trị CV% giữa các ngày phải ≤ 15%

[8], [9], [10]

1.4.2.6 Tỉ lệ thu hồi

• Tỷ lệ thu hồi là tỷ lệ hoạt chất thu được sau khi mẫu được chiết tách theo quy trình đã chọn so với mẫu có cùng nồng độ không qua chiết tách, được pha trong dung môi thích hợp

• Tỷ lệ thu hồi đạt yêu cầu nếu thỏa mãn các điều kiện sau:

✓ Tỷ lệ thu hồi không quá 110% và không thấp hơn 30%

✓ Giá trị CV% giữa các đáp ứng của nội chuẩn và giữa các đáp ứng của chất phân tích trong các mẫu QC có qua xử lý ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%

✓ Tỷ lệ thu hồi trung bình tại các nồng độ không khác nhau quá 15%

[8], [9], [10]

1.4.2.7 Độ ổn định

• Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giá trong lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản mẫu Mẫu phân tích phải đảm bảo ổn định trong thời gian

dự kiến đủ cho phân tích hết mẫu thử

• Thẩm định phương pháp cần xác định các loại độ ổn định sau:

✓ Độ ổn định của dung dịch gốc của chất phân tích và dung dịch chuẩn nội gốc bao gồm: độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài

✓ Độ ổn định của dung dịch làm việc (dd pha loãng) bao gồm: độ ổn định trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài

✓ Độ ổn định của mẫu dịch sinh học: độ ổn định sau 3 chu kì đông – rã đông, độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng đối với dung dịch mẫu thử sau khi đã xử lý (chiết tách), độ ổn định thời gian dài để đông lạnh của mẫu thử trong khoảng thời gian dự định

[8], [9], [10]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Máy móc, thiết bị

Các máy móc, thiết bị nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các thiết bị được trình bày trong nghiên cứu

Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu, Nhật

Cân phân tích Sartorius-CP224S, Đức

Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức

Máy lắc xoáy Velp, Italia

Tủ lạnh sâu – 40 0C Sanyo MDF – 236, Nhật

Micropipette Eppendorf, Đức

Ống ly tâm thuỷ tinh, dung tích 15 mL Sartorius, Đức

Đầu típ cho micropipette Eppendorf, Đức

Bình định mức, pipet class A Prolabo, Pháp

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC – Shimadzu gồm: Interface CBM-20A; bơm

cao áp LC-20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL-20AC, Detector UV SPD-M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO-20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC Solution Shimadzu

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

Các chất chuẩn, thuốc thử, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.2, bảng 2.3 và bảng 2.4

Bảng 2.2 Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu

sử dụng

Nơi sản xuất

Bảng 2.3 Các thuốc thử dùng trong nghiên cứu

Acetonitril HPLC J.T.Baker, Anh

Dichloromethan p.a Merck, Đức Diethylether p.a Merck, Đức 1- Octanesulfonat natri p.a J.T.Baker, Anh Natri hydrophosphate p.a Merck, Đức

Bảng 2.4 Các mẫu huyết tương trắng đã dùng trong nghiên cứu

01 P0810133075 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

02 P0810133091A2-1 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

03 P0804233121 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

04 P0804233130 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

05 P0804233122 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

06 P0804233136 Viện huyết học – truyền máu TW -400C

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol trong huyết tương bằng HPLC

✓ Quy trình chiết tách FLU: Dựa trên các nguyên lý chiết tách (chiết lỏng – lỏng, tủa loại protein bằng dung môi hoặc acid), khảo sát trên các mẫu huyết tương tự tạo chứa FLU để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp

✓ Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm, đảm bảo phân tách FLU khỏi các thành phần tạp có trong mẫu, cho phép xác định được lượng FLU trong mẫu với độ đúng, độ chính xác đáp ứng các quy định của phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [9], [10]

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa Fluconazol

2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc

✓ Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn FLU trong ethanol để thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ FLU chính xác khoảng 500 μg/ml

✓ Dung dịch chuẩn nội gốc: hòa tan chất chuẩn acetanilid trong nước để thu được dung dịch nội chuẩn có nồng độ khoảng 40 μg/ml

2.3.1.2 Chuẩn bị mẫu đường chuẩn

Dự kiến khoảng nồng độ cần khảo sát để xây dựng đường chuẩn: Khoảng tuyến tính phải từ 1/30 - 1/10 Cmax đến 2 - 3 Cmax để phương pháp phân tích có thể áp dụng cho nhiều nghiên cứu thử tương đương sinh học với các mức liều khác nhau

Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương

có nồng độ FLU chính xác khoảng 10 g/mL

Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn FLU như ở bảng 2.5:

Bảng 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn

V chuẩn làm việc (L) 0 0 20 50 100 200 400 600 800 1000

V Huyết tương trắng (L) 1000 1000 980 950 900 800 600 400 200 0

2.3.1.3 Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC)

Từ dung dịch chuẩn gốc, chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương

Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốc độc lập

2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.2.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lí mẫu, chiết tách FLU từ huyết tương trên các mẫu chuẩn FLU hòa tan trong huyết tương trắng bằng các phương pháp như:

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: acetonitril (MeCN); methanol (MeOH) hoặc tác nhân gây tủa là acid như: acid percloric 20%

- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: diethyleter, cloroform, dicloromethan và hỗn hợp dung môi diethyleter với cloroform, dicloromethan với các

tỷ lệ khác nhau

2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích

2.3.3.1 Tính đặc hiệu - chọn lọc

Chỉ tiêu độ đặc hiệu – chọn lọc được quy định tại mục 1.4.2.1 chương 1

Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu:

- Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau

- Huyết tương trắng có pha chuẩn nội

- Huyết tương trắng có pha chuẩn FLU ở nồng độ 0,2 µg/mL và IS

- Huyết tương trắng có pha chuẩn FLU ở nồng độ 5,0 µg/mL và IS

So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên

2.3.3.2 Độ phù hợp hệ thống

Chuẩn bị một mẫu chuẩn chứa FLU và IS với nồng độ FLU khoảng 5,0 µg/ mL,

xử lý theo quy trình đã nêu, tiến hành phân tích mẫu đã xử lý 6 lần, tính CV% các giá trị thời gian lưu, diện tích pic, tỉ lệ diện tích pic của chất chuẩn và chuẩn nội, hệ số kéo đuôi và độ phân giải

2.3.3.3 Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính

• Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung dịch

có nồng độ như sau: 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 - 10,0 µg/mL

• Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 2 lần Từ đáp ứng pic của FLU và IS tại các nồng độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi quy giữa tỷ lệ đáp ứng pic của FLU/IS và nồng độ FLU có trong mẫu và xác định hệ số tương quan r Tính lại nồng độ FLU các mẫu theo phương trình hồi quy từ đó xác định lại độ đúng

so với giá trị thực của từng nồng độ