Xây dựng phương pháp phân tích fluconazol trong huyết tương bằng HPLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI AN DUY MẠNH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH FLUCONAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI AN DUY MẠNH 1301270 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH FLUCONAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Đình Chi TS Tạ Mạnh Hùng Nơi thực hiện: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc TW HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian hồn thành khóa luận, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới thầy giáo TS Lê Đình Chi thuộc mơn Hóa phân tích – Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội TS Tạ Mạnh Hùng – Giám đốc Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – người tận tình hướng dẫn, bảo em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn chị Phan Thị Nghĩa toàn thể anh chị Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương tạo điều kiện bảo em suốt trình thực khóa luận Đồng thời, em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy cơ, ban giám hiệu trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy, tạo điều kiện học tập tốt cho em năm học qua Cuối cùng, em xin cảm ơn người thân, bạn bè – người bên cạnh quan tâm, động viên em suốt thời gian qua Do thiếu sót kinh nghiệm thời gian thực nên đề tài không tránh khỏi nhiều thiếu sót Em mong nhận góp ý thầy bạn bè để khóa luận hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên An Duy Mạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Fluconazol 1.1.1 Cơng thức hóa học 1.1.2 Tính chất hóa lí 1.1.3 Dược động học 1.1.4 Chỉ định 1.1.5 Chống định 1.1.6 Dạng thuốc hàm lượng .3 1.2 Một số phương pháp phân tích nghiên cứu để định lượng Fluconazol huyết tương 1.3 Tổng quan phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) 1.3.1 Nguyên tắc 1.3.2 Cấu tạo máy HPLC 1.3.3 Một số thông số đặc trưng HPLC 1.3.4 Các phương pháp định lượng sắc kí lỏng hiệu cao .9 1.4 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc huyết tương HPLC thẩm định phương pháp phân tích 10 1.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc huyết tương HPLC .10 1.4.1.1 Xác định điều kiện sắc kí lựa chọn chuẩn nội: 10 1.4.1.2 Khảo sát phương pháp xử lí mẫu 10 1.4.1.3 Xác định LLOQ .11 1.4.1.4 Xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn 11 1.4.2 Thẩm định phương pháp phân tích 11 1.4.2.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu 12 1.4.2.2 Độ phù hợp hệ thống .12 1.4.2.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính .13 1.4.2.4 Giới hạn định lượng (LLOQ): .13 1.4.2.5 Độ đúng, độ xác 14 1.4.2.6 Tỉ lệ thu hồi 14 1.4.2.7 Độ ổn định 15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Máy móc, thiết bị 16 2.1.2 Ngun liệu, hóa chất, dung mơi .16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol huyết tương HPLC……… 17 2.2.2 2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 18 Phương pháp nghiên cứu .18 2.3.1 Chuẩn bị mẫu huyết tương tự tạo chứa Fluconazol 18 2.3.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc 18 2.3.2 Xây dựng phương pháp phân tích 19 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 20 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .24 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol huyết tương .24 3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc kí lựa chọn chuẩn nội .24 3.1.2 Khảo sát tìm điều kiện xử lý mẫu 28 3.1.3 Quy trình phân tích FLU huyết tương 30 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 31 3.2.1 Tính chọn lọc- đặc hiệu 31 3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 33 3.2.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 33 3.2.4 Giới hạn định lượng 35 3.2.5 Độ đúng- độ lặp lại ngày khác ngày 36 3.2.6 Tỉ lệ thu hồi phương pháp 39 3.2.7 Độ ổn định 40 BÀN LUẬN 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CV : Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) Dd : Dung dịch FLU : Fluconazol HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ cao (High Quality Control Sample) IS : Nội chuẩn (Internal Standard) KN : Kiểm nghiệm LLOQ : Giới hạn định lượng (Lower Limit Of Quantification) LQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ thấp (Lower Quality Control Sample) MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm soát chất lượng nồng độ trung bình (Middle Quality Control Sample) p.a : Tinh khiết phân tích (pure analysis) QC : Mẫu kiểm sốt chất lượng (Quality Control Sample) SKĐ : Sắc ký đồ TW : Trung ương ULOQ : Giới hạn định lượng (Upper Limit Of Quantification) US-FDA : Cục quản lý thuốc thực phẩm Mỹ (The United States Food and Drug Administration) UV-VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet - Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang 1.1 Tóm tắt nghiên cứu thực định lượng FLU máu 2.1 Các thiết bị dùng nghiên cứu 16 2.2 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 16 2.3 Các thuốc thử dùng nghiên cứu 17 2.4 Các mẫu huyết tương trắng dùng nghiên cứu 17 2.5 Chuẩn bị đường chuẩn 18 2.6 Chuẩn bị mẫu kiểm tra 19 2.7 Chuẩn bị mẫu QC xác định độ 21 3.1 Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời gian lưu FLU IS 32 3.2 Kết khảo sát độ phù hợp hệ thống phương pháp 33 3.3 Sự tương quan nồng độ FLU huyết tương đáp ứng pic 34 3.4 Kết khảo sát đường chuẩn 34 3.5 Kết xác định giới hạn định lượng (LLOQ) 36 3.6 Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày 37 3.7 Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày 38 3.8 Khảo sát tỷ lệ thu hồi IS 39 3.9 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi FLU 40 3.10 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn FLU gốc, IS gốc thời gian ngắn nhiệt độ phòng 41 3.11 Kết độ ổn định dung dịch nội chuẩn gốc thời gian dài nhiệt độ 2oC- 8oC 41 3.12 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc FLU thời gian dài nhiệt độ 2oC- 8oC 42 3.13 Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kì đơng- rã 42 3.14 Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn 43 3.15 Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 44 3.16 Kết độ ổn định mẫu sau xử lý auto- sampler 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Nội dung Trang 1.1 Sơ đồ khối máy sắc kí lỏng hiệu cao 3.1 SKĐ mẫu huyết tương trắng 24 3.2 SKĐ FLU huyết tương trắng 24 3.3 Phổ hấp thụ UV-VIS fluconazol 25 3.4 SKĐ Fluconazol pha động đệm phosphate pH 7,0: MeCN (75:25) 26 3.5 SKĐ FLU nội chuẩn ketoconazol 26 3.6 SKĐ FLU nội chuẩn itraconazol 26 3.7 SKĐ FLU nội chuẩn acetanilid 27 3.8 3.9 3.10 SKĐ FLU IS hỗn hợp MeOH: H2O (1:1) với pha động đệm phosphate pH 7,0: MeCN (75:25) tốc độ dòng 1,5 ml/ phút SKĐ FLU IS huyết tương với pha động đệm phosphatepH 7,0: MeCN (75:25) tốc độ dòng 1,5 ml/ phút SKĐ mẫu chuẩn FLU (5,0 µg/ mL) IS với quy trình xử lý mẫu chọn 28 28 30 3.11 SKĐ mẫu huyết tương trắng thẩm định độ chọn lọc 31 3.12 SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha IS thẩm định độ chọn lọc 31 3.13 3.14 SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FLU nồng độ LLOQ (0,2 µg/ mL) IS SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FLU nồng độ 5,0 µg/ mL IS 31 31 SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FLU nồng độ LLOQ 3.15 (0,2 µg/mL) IS 35 ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng gia tăng đáng báo động nhiễm nấm cục nhận thấy cộng đồng (xảy bệnh nhân nhiễm HIV), bệnh viện (chủ yếu xuất bệnh nhân suy giảm miễn dịch) Điều sử dụng ngày nhiều thuốc ức chế miễn dịch hóa trị liệu bệnh nhân ung thư, gia tăng số lượng bệnh nhân cấy ghép hay sử dụng rộng rãi kháng sinh phổ rộng [7], [14], [16], [19] Fluconazol thuốc nhóm thuốc tổng hợp triazole chống nấm mới, sử dụng rộng rãi để chống nấm trường hợp như: viêm màng não Criptococcus neoformans bệnh nhân suy giảm miễn dịch (HIV/AIDS), nhiễm khuẩn toàn thân, nhiễm trùng đường uống tiết niệu, bệnh nấm da (do Tinea pedis, Tinea corporis, Tinea cruris, Tinea versicolor) Nó sử dụng với mục đích dự phòng bệnh nhân có hội chứng suy giảm miễn dịch để ngăn ngừa tái phát nhiễm Candida spp viêm màng não Criptococcus neoforman Fluconazol chống lại hầu hết loại nấm gặp phải thực hành lâm sàng nấm da [1], [14] Tuy nhiên chế tác dụng Fluconazol phức tạp, nhiều tương tác, tương kỵ có nhiều trường hợp bệnh nhân ngộ độc thuốc Hơn thực tế điều trị, tính cá thể thường thể rõ phức tạp Do việc nghiên cứu sinh khả dụng, dược động học, dược lâm sàng chế phẩm Fluconazol, đặc biệt kiểm soát nồng Fluconazol huyết tương bệnh nhân để điều chỉnh liều cho phù hợp với cá thể cần thiết Với mong muốn xây dựng phương pháp xác định nồng độ Fluconazol huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa hoạt chất Fluconazol, tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp phân tích Fluconazol huyết tương HPLC” với mục tiêu: Khảo sát, xây dựng phương pháp định lượng Fluconazol huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao với detector PDA Thẩm định phương pháp xây dựng theo qui định US-FDA CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Fluconazol 1.1.1 Cơng thức hóa học • Cơng thức phân tử: C13H12F2N6O; • Cơng thức cấu tạo: M= 306,3 [2], [15] [2], [15] • Tên khoa học: 2-(2,4-difluorophenyl)-1,3-bis (1H-1,2,4-triazol-l-yl)-2-propanol [2], [15] 1.1.2 Tính chất hóa lí Bột kết tinh hay tinh thể màu trắng gần trắng Dễ tan methanol, tan ethanol, khó tan dicloromethan, nước acid acetic Không tan ether [2] 1.1.3 Dược động học • Fluconazol hấp thụ tốt qua đường uống sinh khả dụng đường uống ≥ 90% Hấp thu không bị ảnh hưởng thức ăn Nồng độ tối đa huyết tương đạt vòng 1-2 (Cmax = 3,7 µg/mL), nồng độ ổn định đạt vòng 57 ngày [1], [ 18] • Thuốc phân bố rộng rãi mô dịch thể Nồng độ sữa mẹ, dịch khớp, nước bọt, đờm, dịch âm đạo dịch màng bụng tương tự nồng độ huyết tương Nồng độ dịch não tủy đạt từ 50% đến 90% nồng độ huyết tương màng não không bị viêm Tỉ lệ gắn với protein khoảng 12% [1] • Thuốc thải trừ qua nước tiểu dạng nguyên thể với tỉ lệ 80% cao Thời gian bán thải khoảng 30 giờ, tăng người bệnh suy thận Thuốc loại thẩm tách [1] Như vậy: ✓ Tất điểm đường chuẩn có độ so với giá trị thực nồng độ từ 85-115%, điểm LLOQ có độ so với giá trị thực nằm khoảng 80120% ✓ Hệ số tương quan R đường chuẩn lớn 0,98 → Do khoảng nồng độ từ 0,2 – 10,0 µg/mL có tương quan tuyến tính chặt chẽ nồng độ FLU huyết tương với tỷ lệ diện tích pic FLU/IS thu được, đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn FDA phân tích thuốc dịch sinh học [10] 3.2.4 Giới hạn định lượng Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn FLU nồng độ khoảng 0,2 µg/mL với mẫu độc lập Tiến hành mục 2.3.3.4, xử lý mẫu phân tích với điều kiện sắc ký mục 3.1.3 Kết trình bày hình 3.15 bảng 3.5: Hình 3.15 SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn FLU nồng độ LLOQ (0,2 µg/mL) IS 35 Bảng 3.5 Kết xác định giới hạn định lượng (LLOQ) Mẫu trắng Mẫu chuẩn (0,206 µg/mL) Đáp ứng Stt (mAU.s) FLU Nồng độ tìm IS (a) (mAU.s) (mAU.s) thấy (µg Độ đúng(b) Đạt/Khơng /mL) (%) đạt 1187 13509 341583 0,225 109,3 Đạt 1142 13586 390066 0,198 96,2 Đạt 1219 13065 359214 0,207 100,4 Đạt 1544 12503 311779 0,229 110,8 Đạt 1200 13772 401320 0,195 94,7 Đạt 946 13367 380016 0,200 97,1 Đạt TB 0,209 101,4 CV (%) 6,9 6,9 (a) tính từ phương trình hồi qui Đạt (b) % so với nồng độ thực Kết quả: ✓ Độ nằm khoảng từ 80- 120% so với nồng độ thực (94,7- 110,8%) ✓ Độ xác CV ≤ 20% (6,9%) Như mẫu chuẩn chứa FLU có nồng độ 0,2 µg/mL đáp ứng yêu cầu LLOQ độ đúng, độ xác tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] 3.2.5 Độ đúng- độ lặp lại ngày khác ngày 3.2.5.1 Độ đúng, độ lặp lại ngày Pha mẫu LQC, MQC, HQC mục 2.3.1 Mỗi loại QC gồm mẫu độc lập có nồng độ Tiến hành xử lý mẫu sắc ký theo điều kiện lựa chọn Kết xác định độ đúng, độ lặp lại ngày trình bày bảng 3.6: 36 Bảng 3.6 Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại ngày: Mẫu LQC (0,595µg/mL) Tỷ số diện tích píc FLU/IS MQC (4,958µg/mL) Nồng Độ Tỷ số diện Nồng Độ độ(a) đúng(b) tích píc độ(a) đúng(b) (µg/mL) (%) FLUI/IS (µg/mL) (%) HQC (8,924µg/mL) Tỷ số diện tích píc FLU/IS Nồng Độ độ(a) đúng(b) (µg/mL) (%) 0,091 0,537 90,2 0,783 4,641 93,6 1,470 8,707 97,6 0,106 0,625 105,0 0,792 4,695 94,7 1,342 7,954 89,1 0,097 0,573 96,2 0,771 4,569 92,2 1,466 8,684 97,3 0,097 0,572 96,2 0,792 4,693 94,7 1,464 8,672 97,2 0,104 0,614 103,1 0,763 4,519 91,2 1,431 8,476 95,0 0,092 0,546 91,7 0,763 4,518 91,1 1,391 8,241 92,3 0,578 97,1 4,606 92,9 8,456 94,8 TB CV (%) 6,1 1,8 (a): tính từ phương trình hồi qui (b): % so với nồng độ thực Kết quả: ✓ Độ nằm khoảng từ 85-115% so với nồng độ thực (90,2- 105,0%) ✓ Độ lặp lại CV ≤ 15% (1,8- 6,1%) Như vậy, phương pháp đáp ứng yêu cầu độ độ xác tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] 3.2.5.2 Độ đúng, độ lặp lại khác ngày Tiến hành phân tích mẫu LQC, MQC, HQC chuẩn bị tương tự xác định độ đúng, độ lặp lại ngày theo phương pháp xây dựng ngày khác Xác định nồng độ FLU mẫu QC dựa vào đường chuẩn tiến hành song song ngày Kết xác định độ độ lặp lại khác ngày phương pháp trình bày bảng 3.7 37 3,6 Bảng 3.7 Kết khảo sát độ đúng, độ lặp lại khác ngày LQC (0,6 µg/mL) Ngày Nồng độ(a) (µg/mL) I II III Độ (b) (%) MQC (5,0 µg/mL) HQC (9,0 µg/mL) Nồng độ(a) Độ đúng(b) Nồng độ(a) Độ đúng(b) (µg/mL) (%) (µg/mL) (%) 0,537 90,2 4,641 93,6 8,707 97,6 0,625 105,0 4,695 94,7 7,954 89,1 0,573 96,2 4,569 92,2 8,684 97,3 0,572 96,2 4,693 94,7 8,672 97,2 0,614 103,1 4,519 91,2 8,476 95,0 0,546 91,7 4,518 91,1 8,241 92,3 0,669 108,2 4,607 89,3 9,992 107,7 0,633 102,3 5,010 97,2 9,886 106,5 0,561 90,7 4,790 92,9 9,849 106,1 0,518 83,7 5,097 98,8 8,682 93,5 0,663 107,1 4,976 96,5 9,504 102,4 0,584 94,4 5,041 97,8 9,196 99,1 0,638 103,0 5,852 113,5 10,098 108,8 0,647 104,6 5,055 98,0 9,000 97,0 0,630 101,8 5,518 107,0 9,978 107,5 0,699 113,0 5,313 103,0 8,365 90,1 0,691 111,7 5,876 114,0 9,185 99,0 0,604 97,6 5,384 104,4 8,976 96,7 TB (%) 100,0 98,3 99,0 CV (%) 8,0 7,5 6,2 (a): tính từ phương trình hồi qui (b): % so với nồng độ thực Kết quả: Ở nồng độ (0,6; 5,0 9,0 µg/mL): ✓ Độ nằm khoảng từ 85-115% so với nồng độ thực ✓ Độ lặp lại CV ≤ 15% (6,2- 8,0%) Như vậy, phương pháp đáp ứng yêu cầu độ độ xác tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] 38 3.2.6 Tỉ lệ thu hồi phương pháp 3.2.6.1 Tỉ lệ thu hồi nội chuẩn Xử lý lô mẫu QC theo qui trình lựa chọn Tiến hành phân tích xác định diện tích pic IS Song song, xác định diện tích pic IS mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS trình bày bảng 3.8: Bảng 3.8 Khảo sát tỷ lệ thu hồi IS Đáp ứng IS huyết STT tương sau xử lý mẫu Đáp ứng IS dung môi Tỉ lệ thu hồi IS (%) (mAU.s) (mAU.s) 363569 628098 77,2 337915 619864 72,7 361553 628372 76,7 334329 626868 71,1 348301 626724 74,1 345749 620299 74,3 348569 625038 74,4 3,4 0,6 3,1 TB CV (%) Kết quả: ✓ Tỉ lệ thu hồi nội chuẩn đạt 74,4% (thỏa mãn điều kiện nằm khoảng 30- 110%) ✓ Các giá trị CV ≤ 15% (0,6; 3,1 3,4%) Như vậy, quy trình xử lý mẫu huyết tương nghiên cứu cho tỷ lệ thu hồi nội chuẩn phù hợp tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] 3.2.6.2 Tỉ lệ thu hồi FLU Chuẩn bị lô mẫu QC mục 2.3.1 xử lý mẫu chuẩn FLU pha huyết tương theo phương pháp xây dựng Tiến hành sắc ký, xác định nồng độ FLU có mẫu Song song, định lượng mẫu chuẩn pha dung môi pha mẫu (không qua xử lý) Kết xác định tỷ lệ thu hồi FLU trình bày bảng 3.9: 39 Bảng 3.9 Kết khảo sát tỷ lệ thu hồi FLU STT Đáp ứng FLU mẫu LQC Đáp ứng FLU mẫu MQC Đáp ứng FLU mẫu HQC (0,6 µg/mL) (mAU.s) (5,0 µg/mL) (mAU.s) (9,0 µg/mL) (mAU.s) Huyết Huyết Huyết Dung mơi tương Dung môi tương Dung môi tương 29756 23110 232552 212067 430908 381995 30280 24595 244440 212887 434224 382175 30553 25255 239019 213434 433150 382341 30167 28420 240576 214221 434427 380958 29926 28067 240815 213654 414760 380505 TB 30136 25889 239480 213253 429494 381595 CV (%) 1,0 8,8 1,8 0,4 1,9 0,2 Tỷ lệ thu hồi (%) 77,6 74,9 75,0 Kết quả: Ở nồng độ (0,6; 5,0 9,0 µg/mL): ✓ Tỷ lệ thu hồi FLU nằm khoảng 30-110% (74,9; 75,0; 77,6%) ✓ Các giá trị CV ≤ 15% (0,2- 8,8%) Như vậy, phương pháp xử lý mẫu xây dựng cho tỷ lệ thu hồi chất phân tích phù hợp tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] 3.2.7 Độ ổn định 3.2.7.1 Độ ổn định thời gian ngắn nhiệt độ phòng dung dịch chuẩn FLU gốc, IS gốc Pha dung dịch chuẩn FLU gốc dung dịch chuẩn nội gốc mục 2.3.1.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn FLU gốc dung dịch IS gốc thời gian ngắn nhiệt độ phòng trình bày bảng 3.10: 40 Bảng 3.10 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn FLU gốc, IS gốc thời gian ngắn nhiệt độ phòng Mẫu chuẩn FLU Mẫu Nồng độ ban đầu (µg/mL) Nồng độ sau (µg/mL) Mẫu IS Độ lệch Nồng độ ban Nồng độ sau Độ lệch (%) đầu (µg/mL) (µg/mL) (%) 529,483 527,379 -0,4 41,926 41,938 0,0 515,575 514,864 -0,1 41,031 41,041 0,0 551,149 553,707 0,5 41,357 41,296 -0,1 TB (%) 0,0 0,0 Kết cho thấy: nồng độ dung dịch chuẩn FLU gốc dung dịch chuẩn nội gốc sau thời gian ngắn (4 giờ) nhiệt độ phòng sai khác với nồng độ dung dịch pha thỏa mãn yêu cầu nhỏ 2% theo tiêu chuẩn FDA phân tích dịch sinh học [10] Như vậy, dung dịch chuẩn FLU gốc dung dịch chuẩn nội gốc đạt độ ổn định thời gian ngắn (4 giờ) nhiệt độ phòng 3.2.7.2 Độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn FLU gốc, IS gốc Pha dung dịch chuẩn FLU gốc chuẩn IS gốc mục 2.3.1.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn FLU gốc dung dịch IS gốc dài ngày nhiệt độ 2oC - 8oC trình bày bảng 3.11 3.12: Bảng 3.11 - Kết độ ổn định dung dịch nội chuẩn gốc thời gian dài nhiệt độ 2oC 8oC: Nồng độ Mẫu Sau ngày ban đầu Nồng (µg/mL) độ Sau ngày Độ lệch Độ Nồng độ (%) lệch (%) Sau 15 ngày Nồng độ Độ lệch (%) Sau 22 ngày Nồng độ Độ lệch (%) 41,961 41,684 -0,7 42,101 0,3 42,003 0,1 42,766 1,9 40,950 40,773 -0,4 40,992 0,1 41,132 0,4 41,741 1,9 41,229 40,991 -0,6 41,370 0,3 41,252 0,1 41,989 1,8 TB (%) -0,6 0,3 41 0,2 1,9 Bảng 3.12 Kết độ ổn định dung dịch chuẩn gốc FLU thời gian dài nhiệt độ 2oC - 8oC Nồng độ Mẫu ban đầu (µg/mL) Sau ngày Sau ngày Sau 15 ngày Nồng độ Độ lệch Nồng độ Độ lệch Nồng độ Độ lệch (µg/mL) (%) (µg/mL) (%) (µg/mL) (%) 525,823 524,794 -0,2 516,453 -1,8 519,570 -1,2 535,517 532,862 -0,5 526,621 -1,7 526,724 -1,6 509,617 512,445 0,6 505,489 -0,8 505,367 -0,8 TB (%) 0,0 -1,4 -1,2 Kết quả: ✓ Nồng độ dung dịch chuẩn IS gốc sau bảo quản 2, 7, 15 22 ngày nhiệt độ 2oC - 8oC sai khác so với nồng độ dung dịch pha thỏa mãn yêu cầu nhỏ 2% ✓ Nồng độ dung dịch chuẩn FLU gốc sau bảo quản 4, 15 ngày nhiệt độ 2oC - 8oC sai khác so với nồng độ dung dịch pha thỏa mãn yêu cầu nhỏ 2% Như vậy, dung dịch chuẩn FLU gốc chuẩn IS gốc đạt độ ổn định thời gian dài ngày nhiệt độ 2oC - 8oC [10] 3.2.7.3 Độ ổn định mẫu huyết tương a Độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kì đơng – rã Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết xác định nồng độ FLU mẫu LQC, HQC sau chu kỳ đơng – rã mẫu tiến hành phân tích sau pha (nồng độ ban đầu) trình bày bảng 3.13: Bảng 3.13 Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương sau chu kỳ đơng- rã Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (0,6 µg/mL) Mẫu HQC (8,0 µg/mL) Ban đầu Sau chu kỳ đông- rã Ban đầu Sau chu kỳ đông- rã 0,569 0,567 8,079 8,456 0,572 0,615 8,444 8,499 0,547 0,563 8,098 9,754 0,554 0,631 8,361 9,881 0,577 0,566 8,046 8,051 42 TB CV (%) 0,578 0,586 8,084 8,207 0,566 0,588 8,186 8,808 2,3 4,9 2,1 9,1 Độ lệch (%) 3,9 7,6 Kết quả: nồng độ FLU mẫu sau chu kỳ đông- rã đông sai khác so với nồng độ ban đầu không 15% (LQC: 3,9% HQC: 7,6%) giá trị CV% kết định lượng ≤ 15% Như mẫu huyết tương ổn định sau chu kỳ đông- rã đông [10] Độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn b Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết xác định nồng độ FLU mẫu LQC, HQC để nhiệt độ phòng thời gian ngắn (4 giờ) nồng độ FLU xử lí sau rã đơng trình bày bảng 3.14: Bảng 3.14 Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu huyết tương nhiệt độ phòng thời gian ngắn Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (0,6 µg/mL) Mẫu HQC (8,0 µg/mL) Xử lý Sau Xử lý Sau 0,575 0,592 8,079 8,014 0,583 0,638 8,444 8,012 0,577 0,608 8,098 7,974 0,573 0,628 8,361 8,070 0,568 0,666 8,046 7,978 0,582 0,583 8,084 7,975 0,576 0,619 8,186 8,004 0,9 5,0 2,1 0,5 TB CV (%) Độ lệch (%) 7,4 - 2,2 Kết quả: nồng độ FLU mẫu xử lí sau để nhiệt độ phòng sai khác so với nồng độ mẫu xử lí không 15% (LQC: 7,4% HQC: 2,2%) giá trị CV% kết định lượng ≤ 15% Như mẫu huyết tương ổn định sau nhiệt độ phòng [10] 43 c Độ ổn định mẫu huyết tương thời gian dài Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương trình bày bàng 3.15: Bảng 3.15 Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương Mẫu LQC Ban đầu (µg/mL) Sau ngày Sau 14 ngày Sau 23 ngày 0,569 0,594 0,527 0,549 0,572 0,659 0,610 0,605 0,547 0,596 0,653 0,637 0,554 0,647 0,616 0,695 0,577 0,591 0,610 0,689 0,578 0,682 0,613 0,670 0,566 0,628 0,605 0,641 2,3 6,3 6,9 8,8 11,0 6,9 13,2 Ban đầu (µg/mL) Sau ngày Sau 14 ngày Sau 23 ngày 8,079 7,833 7,766 7,080 8,444 8,497 9,058 7,155 8,098 7,679 8,043 7,174 8,361 8,316 7,764 8,041 8,046 7,649 9,135 8,174 8,084 8,617 8,273 8,321 8,186 8,099 8,340 7,657 2,1 5,3 7,4 7,6 -1,1 1,9 -6,5 (0,6 µg/mL) TB CV (%) Độ lệch (%) Mẫu HQC (8,0 µg/mL) TB CV (%) Độ lệch (%) Kết quả: nồng độ LQC, HQC FLU mẫu sau bảo quản 7, 14, 23 ngày sai khác với nồng độ ban đầu không 15% giá trị CV% kết định lượng nồng độ nhỏ 15% Như mẫu huyết tương đạt tiêu độ ổn định dài ngày [10] 44 d Độ ổn định mẫu sau xử lý (trong auto- sampler) Pha mẫu LQC HQC mục 2.3.1 tiến hành mục 2.3.3.8 Kết độ ổn định auto-sampler trình bày bảng 3.16: Bảng 3.16 Kết độ ổn định mẫu sau xử lý auto- sampler Nồng độ (µg/mL) Mẫu Mẫu LQC (0,6 µg/mL) Mẫu HQC (9,0 µg/mL) Tiêm Sau 22 Tiêm Sau 22 0,669 0,656 9,992 10,365 0,633 0,651 9,886 10,216 0,561 0,590 9,849 10,165 0,518 0,540 8,682 9,113 0,663 0,699 9,504 9,860 0,584 0,585 9,196 9,747 TB 0,605 0,620 9,518 9,911 CV (%) 10,0 9,4 5,3 4,6 Độ lệch (%) 2,7 4,2 Kết quả: nồng độ mẫu LQC, HQC FLU sau xử lý (trong auto-sampler) sai khác với nồng độ mẫu LQC, HQC tiêm không 15% giá trị CV% kết định lượng nồng độ nhỏ 15% Như mẫu huyết tương đạt độ ổn định mẫu sau xử lý (trong auto-sampler) [10] Nhận xét chung Từ kết thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp HPLC xây dựng để định lượng Fluconazol huyết tương đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học 45 BÀN LUẬN Phương pháp xây dựng áp dụng mẫu huyết tương bệnh thực tế sử dụng Fluconazol cho kết phù hợp liệu dược động học thuốc y văn Nồng độ thuốc bệnh nhân thực tế dao động lớn cá thể khác cho thấy tầm quan trọng việc giám sát nồng độ thuốc máu để cá thể hóa điều trị Để đảm bảo định lượng FLU với nồng độ thấp huyết tương có thành phần phức tạp tỷ lệ tạp chất lớn quy trình xử lý mẫu phù hợp cần thiết Xử lý mẫu giúp loại bỏ thành phần tạp chất có mẫu, giúp cho q trình phân tách, định lượng FLU HPLC thuận lợi Qua kết khảo sát phương pháp tủa protein chiết lỏng- lỏng với nhiều dung môi khác nhau, lựa chọn phương pháp chiết lỏng- lỏng với hệ dung môi diethylether-dicloromethan do: hiệu suất chiết cao, khả loại tạp tốt, dễ kiếm, tiết kiệm thời gian, trình tiến hành đơn giản độ ổn định phép phân tích cao Ngồi ra, việc lựa chọn Acetanilid làm chất chuẩn nội đáp ứng yêu cầu chất chuẩn nội: chất chuẩn nội tách hồn tồn khỏi chất cần phân tích điều kiện sắc ký, không phản ứng với thành phần mẫu thử dễ kiếm Mẫu huyết tương bệnh nhân đơi có mẫu phức tạp, sử dụng nhiều loại thuốc, lựa chọn đảm bảo chất chuẩn nội chất phân tích có độ phân giải tốt khơng bị ảnh hưởng pic tạp có huyết tương Từ kết thẩm định tính đặc hiệu- chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng- độ xác, tỷ lệ thu hồi, nghiên cứu độ ổn định cho thấy, phương pháp HPLC xây dựng để định lượng FLU huyết tương sử dụng nghiên cứu đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích dùng dịch sinh học 46 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Khóa luận hồn thành mục tiêu đề ra, bao gồm: a Xây dựng phương pháp định lượng FLU huyết tương với xử lý mẫu huyết tương chiết lỏng-lỏng sử dụng dung môi chiết hỗn hợp diethylether-dicloromethan (7:3, v:v) phân tích FLU cột Rp18 với dung môi hỗn hợp đệm phosphate pH 7,0 – MeCN (75: 25) chế độ rửa giải đẳng dòng với tốc độ dòng 1,5 ml/phút FLU định lượng sử dụng chuẩn nội acetanilid, sắc ký đồ ghi bước sóng 210 nm b Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng FLU huyết tương với tiêu: độ đặc hiệu/ chọn lọc,độ phù hợp hệ thống, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng- độ lặp lại, độ ổn định, tỷ lệ thu hồi Kết cho thấy: • Phương pháp có độ đặc hiệu- chọn lọc với FLU • Phương pháp đáp ứng yêu cầu độ phù hợp hệ thống • Có tương quan chặt chẽ đáp ứng phân tích nồng độ FLU khoảng nồng độ khảo sát với r > 0,98 • Phương pháp đạt độ (đều nằm khoảng 85%- 115%), độ lặp lại với giá trị CV ≤ 15% • Tỷ lệ thu hồi cao (74,9%- 77,6%) • Đạt tiêu độ ổn định Như vậy, phương pháp nghiên cứu đáp ứng yêu cầu phương pháp phân tích chất dịch sinh học US- FDA 4.2 Kiến nghị Từ kết nghiên cứu, chúng tơi nhận thấy phương pháp xây dựng tham khảo để sử dụng định lượng Fluconazol huyết tương nhằm phục vụ mục đích nghiên cứu thực tiễn như: nghiên cứu BA/ BE, nghiên cứu dược động học Fluconazol, nghiên cứu giám sát điều trị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bộ Y tế (2009), Dược thư quốc gia Việt Nam Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam IV Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích, Trường đại học Dược Hà Nội, tập 2, Nhà xuất Y học, tr.123 – 141, tr.168 – 200 Bộ Y tế (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, tr.84 – 104 Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương (2015), “Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học HPLC” Tiếng Anh: Agudela C.A., Munoz C., Ramirez A (2014), “Response to therapy in patients with cryptococcosis and AIDS: Association with in vitro susceptibility to Fluconazol”, Revista Iberoamericana de Micologia, 32(4), pp.214-220 Bennett J.E (2005), Principles and practice of infectious diseases, Churchill Livingstone, Scotland, pp.2935-2938 Dong M., Ahuja S (2005), Handbook of pharmaceutical analysis by HPLC, United Kingdom, pp.19 – 45 EMA 2011, “Guideline on bioanalytical method validation” 10 FDA 2013, “Bioanalytical method validation” 11 Gordien JB, Pigneux A, Vigouroux S, Tabrizi R, Accoceberry I, Bernadou JM, Rouault A, Saux MC, Breilh D (2009), “Simultaneous determination of five systemic azoles in plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection”, Jounal of Pharmaceutical and Biomedical Ananlysis, 50(5), pp.932-938 12 Kim SS, Im HT, Kang IM, Lee HS, Lee HW, Cho SH, Kim JB, Lee KT (2007), “An optimized analytical method of Fluconazol in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection and its application to a bioequivalence study”, Journal of Chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 852(1-2), p174-179 13 Koks CH, Rosing H, Meenhorst PL, Bult A, Beijnen JH (1995), “High- performance liquid chromatographic determination of the antifungal drug Fluconazol in plasma and saliva of human immunodeficiency virus-infected patients”, Journal of Chromatography B: Biomediacal sciences and Applications, 663(2), pp.345-351 48 14 Lénárd Farczádi, Orsolya Melles, Laurian Vlase, Brindusa Tilea (2015), “Liquid chromatography tandem mass spectrometry determination of Fluconazol levels in human plasma for bioavailability studies”, Farmacia, 64(1), pp.88-94 15 Saleh Al Dgither, Ahmed Yusuf, Muhammad M Hammami (2012), “Fluconazol: Stability and analysis in human plasma by simple high performance liquid chromatography”, Fabad Journal of Pharmaceutical Sciences, 34(4), pp.77-81 16 Singh N (2001), “Trends in the epidemiology of opportunistic fungal infections: predisposing factors and the impact of antimicrobial use practice”, Clinical Infectious Diseases, 33(10), pp.1692-1696 17 Triporn Wattananat, Wiyada Akarawut (2007), “Bioequivalence study of two Fluconazol capsule formulations in healthy volunteers”, International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 42(1), pp 39-42 18 V.Porta, K.H.Chang, S.Storpirtis (2005), “Evaluation of the bioequivalence of capsules containing 150 mg of Fluconazol”, International Journal of Pharmaceutics, 288(1), pp 81-86 19 Wisplinghoff H (2004), “ Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24.179 cases from a prospective nationwide surveillance study”, Clinical Infectious Diseases, 39(3), pp.309-317 20 Zahra Safaei, Eskandar Lipour, Alireza Shafaati and Afshin Zarghi (2015), “Determination of Fluconazol in human plasma by reverse phase high performance liquid chromatography”, Acta Poloniae Pharmaceutica, 72(2), pp.227-233 21 Zhang S, Mada SR, Torch M, Goyal RK, Venkataramanan R (2008), “Development and validation of a high-performance liquid chromatographic assay for the determination of Fluconazol in human whole blood using solid phase extraction”, Therapeutic Drug Monitoring, 30(3), pp.314-319 Websites: 22 https://www.medicines.org.uk/emc/product/4960/smpc 23 http://www.nidqc.org.vn/duocthu/fluconazol.html 49 ... 1.4 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc huyết tương HPLC thẩm định phương pháp phân tích 1.4.1 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc huyết tương HPLC Quá trình xây dựng phương pháp phân tích. .. HPLC 1.3.4 Các phương pháp định lượng sắc kí lỏng hiệu cao .9 1.4 Xây dựng phương pháp phân tích thuốc huyết tương HPLC thẩm định phương pháp phân tích 10 1.4.1 Xây dựng phương. .. đánh giá tương đương sinh học chế phẩm chứa hoạt chất Fluconazol, tiến hành đề tài: Xây dựng phương pháp phân tích Fluconazol huyết tương HPLC với mục tiêu: Khảo sát, xây dựng phương pháp định