Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng carbapenem của một số vi khuẩn gram âm phân lập từ bệnh nhân tại bệnh viện việt đức và bệnh viện trung ương quân đội 108

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC VÀ BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108 Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Đặng Đức Anh GS TS Phạm Văn Ty Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu khoa học riêng tơi, tất kết số liệu luận án tơi thực Tất số liệu trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học nước nước ngồi Phần cịn lại luận án chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận án Trần Diệu Linh LỜI CẢM ƠN Lời muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Đức Anh, Viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, người hướng dẫn khoa học, ln giúp đỡ tơi, tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS TS Phạm Văn Ty, nguyên giảng viên Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, giáo viên đồng hướng dẫn, ln nhiệt tình giúp đỡ, bảo động viên tơi q trình học tập thực nghiên cứu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS BS Trần Huy Hồng, Phó Trưởng khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, cố vấn khoa học suốt trình nghiên cứu, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi thực nghiên cứu, tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến GS TS Timothy Walsh, Trường Đại học Cardiff, Anh TS Masato Suzuki, Viện Nghiên cứu Quốc gia Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản hợp tác giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn; TS Rogier Van Doorm, Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford Hà Nội (OUCRU) hỗ trợ phân tích kết quả, tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành tới bạn đồng nghiệp Phịng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương OUCRU quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ tơi q trình thực nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin gửi lời trân trọng cảm ơn tới:  Ban giám đốc, Trung tâm Đảm bảo chất lượng xét nghiệm Kiểm chuẩn, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương;  Ban giám đốc toàn thể cán Khoa Vi sinh vật Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108;  Ban giám đốc toàn thể cán Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức Cuối xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng, dạy dỗ cha mẹ tôi, cha mẹ chồng ủng hộ, động viên, thương u, chăm sóc, khích lệ chồng, em, người bên tôi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, ngày tháng Trần Diệu Linh Nghiên cứu thực sử dụng kinh phí đề tài/dự án: - Đề tài cấp nhà nước "Đánh giá thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Việt Nam, xác định đặc điểm cấu trúc gen yếu tố liên quan vi khuẩn kháng thuốc thường gặp Việt Nam" (Mã số: MOST: NHQT/SPĐP/02.16) TS Trần Huy Hoàng chủ nhiệm - Đề tài nhánh “Dịch tễ học phân tử chủng Enterobacteriaceae Acinetobacter kháng carbapenem" thuộc Dự án "Phát triển áp dụng kỹ thuật chẩn đoán chuyên sâu số bệnh truyền nhiễm Việt Nam" Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Viện Nghiên cứu Quốc gia Bệnh truyền nhiễm Nhật Bản giai đoạn 2016-2019 TS Trần Huy Hoàng chủ nhiệm MỤC LỤC MỤC LỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Gram âm tính kháng kháng sinh 1.1.1 Vi khuẩn Gram âm 1.1.2 Tính kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 1.1.4 Cơ sở di truyền học chế kháng kháng sinh 1.2 Kháng sinh nhóm carbapenem chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm 1.2.1 Kháng sinh nhóm carbapenem 1.2.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm 28 1.3 Một số phương pháp đại ứng dụng nghiên cứu chế đề kháng carbapenem mức độ phân tử khả lan truyền chủng vi khuẩn mang gen kháng 1.3.1 Các phương pháp nghiên cứu đặc tính chế kháng carbapenem mức độ phân tử chủng vi khuẩn kháng thuốc 1.3.2 Các phương pháp nghiên cứu khả lan truyền chủng vi khuẩn mang gen kháng 1.4 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm giới Việt Nam 1.4.1 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm giới 1.4.2 Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem vi khuẩn Gram âm Việt Nam CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu 2.2 Thiết kế nghiên cứu 2.3 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 2.3.1 Thời gian thực 2.3.2 Địa điểm thực 2.4 Đối tượng nghiên cứu 2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 55 2.5.1 Cỡ mẫu cho mục tiêu 55 2.5.2 Cỡ mẫu cho mục tiêu 56 2.6 Sơ đồ tóm tắt bước nghiên cứu 58 2.6.1 Sơ đồ tóm tắt bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 58 2.6.2 Sơ đồ tóm tắt bước nghiên cứu đáp ứng mục tiêu 59 2.7 Phương pháp nghiên cứu 59 2.7.1 Trang thiết bị 59 2.7.2 Nuôi cấy định danh lại vi khuẩn 59 2.7.3 Tách chiết ADN 60 2.7.4 Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) 60 2.7.5 Giải trình tự gen 60 2.7.6 Thử nghiệm khả sinh enzyme carbapenemase chủng mang gen kháng phương pháp Carba NP cải tiến (Carba NP - direct) 61 2.7.7 Thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế phát triển vi khuẩn (MIC) 62 2.7.8 Kỹ thuật điện di xung trường (PFGE) 63 2.7.9 Kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn (WGS) 65 2.7.10 Kỹ thuật S1-PFGE Southern blot 65 2.7.11 Kỹ thuật tiếp hợp vi khuẩn để truyền plasmid 66 2.8 Xử lý phân tích số liệu 67 2.9 Kiểm sốt tính xác độ tin cậy kỹ thuật trình nghiên cứu 70 2.10 Đạo đức nghiên cứu 70 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 71 3.1 Một số đặc điểm chung chủng vi khuẩn phân lập bệnh viện 71 3.2 Phát có mặt gen mã hoá carbapenemase chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập bệnh viện 74 3.3 Xác định khả sinh enzyme carbapenemase mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 80 3.3.1 Xác định khả sinh enzyme carbapenemase chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 80 3.3.2 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase theo tiêu chuẩn lâm sàng 82 3.4 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase phân lập Bệnh viện Việt Đức Bệnh viện Trung ương quân đội 108 92 3.4.1 Xác định mối liên hệ kiểu gen chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase nghiên cứu kỹ thuật PFGE 92 3.4.2 Xác định mối liên hệ kiểu gen sequence type chủng vi khuẩn sinh enzyme carbapenemase Việt Nam giới kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen vi khuẩn 97 3.5 Xác định chế lan truyền qua trung gian plasmid chủng vi khuẩn mang gen mã hoá carbapenemase 110 3.5.1 Xác định đặc điểm plasmid mang gen mã hoá carbapenemase 110 3.5.2 Xác định khả lan truyền gen kháng qua trung gian plasmid chủng vi khuẩn 117 3.6 Xác định cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen mã hoá carbapenemase 119 3.6.1 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen blaKPC-2 120 3.6.2 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen blaNDM-1 123 3.6.3 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-48 .126 3.6.4 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen blaIMP-1 127 3.6.5 Cấu trúc yếu tố di truyền di động mang gen blaOXA-23 129 KẾT LUẬN 131 KIẾN NGHỊ 133 DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ ĐÃ XUẤT BẢN CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC TÀI LIỆU PHỤ LỤC 1: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ THEO MỘT SỐ NỘI DUNG CỦA MỤC TIÊU PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ HỆ GEN CỦA MỤC TIÊU PHỤ LỤC 3: BẢNG PHIÊN GIẢI KẾT QUẢ MIC THEO TIÊU CHUẨN CLSI 2017 CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết đầy đủ tiếng Anh A baumannii Acinetobacter baumannii Giải nghĩa tiếng Việt Vi khuẩn Acinetobacter baumannii ADN ATCC Deoxyribonucleic acid American Type Culture Collection Axit nucleic Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ blaCTX Gene coding for CTX - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase CTX Gene coding for IMP - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase IMP Gene coding for KPC - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase KPC Gene coding for NDM - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase NDM Gene coding for OXA-23 - Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA- Gene coding for OXA-24 - 23 Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA- Gene coding for OXA-48 - 24 Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA- Gene coding for OXA-51 - 48 Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA- Gene coding for OXA-58 - 51 Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase OXA- Gene coding for SHV - 58 Gen mã hoá sinh tổng hợp lactamase enzyme -lactamase SHV blaTEM Gene coding for TEM - Gen mã hoá sinh tổng hợp enzyme -lactamase TEM bp CAZ CIP lactamase Base pairs Ceftazidime Ciprofloxacin blaIMP blaKPC blaNDM blaOXA-23 blaOXA-24 blaOXA-48 blaOXA-51 blaOXA-58 blaSHV Cặp bazơ Kháng sinh Ceftazidime Kháng sinh Ciprofloxacin - KPC - 575 568 TT 576 Khoa 569 577 563 570 Phẫu thuật sọ 578 564 571 579 565 566 567 572 Hồi sức sau mổ não Phẫu thuật nhiễm khuẩn Cấp cứu bụng 573 574 Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Phẫu thuật Mủ nhiễm khuẩn Phẫu thuật sọ KPC G não (881bp) Hồi sức sau mổ Thận lọc máu - Thận lọc máu - Hồi sức sau mổ Mủ - Hồi sức sau mổ Khoa phẫu thuật - nhi Phẫu thuật tim - mạch Hồi sức sau mổ - Hồi sức sau mổ Mủ - (863 Hồi tỉnh Chấn thương 590 Khoa TT Hồi sức sau mổ 591 Hồi sức sau mổ 580 581 592 Hồi sức cấp cứu 593 Hồi sức cấp cứu Phẫu thuật sọ 582 583 594 não 595 Hồi sức sau mổ Cấp cứu bụng 584 596 Phẫu thuật tim mạch 585 586 Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ 587 Hồi sức sau mổ 588 589 Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ - KPC Mủ - Mủ + 598 609 602 606 599 TT 610 603 607 600 611 604 597 601 608 605 612 613 Khoa Hồi sức sau mổ Hồi tỉnh Phẫu thuật tim mạch Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Phẫu thuật tim mạch Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Hồi tỉnh Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Phẫ u thuậ t sọ não Hồi sức sau mổ Phẫ u thuậ t nhiễ m khu ẩn Hồi sức sau mổ Hồi sức sau mổ Năm 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 2015 tủy KPC - Mã Bệnh mẫu viện TT Khoa Năm Việt 614 2109 Hồi sức sau mổ 2015 Hồi sức sau mổ 2015 Hồi sức sau mổ 2015 Đức Việt 615 2110 Đức Việt 616 2111 Đức Việt 617 2015 Đức Việt 618 Phẫu thuật sọ 2112 2115 não Hồi sức sau mổ 2015 Hồi sức sau mổ 2015 Đức Việt 619 2117 Đức Việt 620 2014 Đức Việt 621 622 Phẫu thuật sọ 2119 2120 2121 Đức Việt não Chấn thương 2014 Hồi sức sau mổ 2014 Đức PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH MẪU NGHIÊN CỨU ĐƯỢC GIẢI TRÌNH TỰ TỒN BỘ HỆ GEN CỦA MỤC TIÊU TT 10 11 12 13 14 15 Mã mẫu 01406 01441 01445 01460 01462 01471 01478 01479 01498 01499 01509 01512 01536 01555 01556 16 01557 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 01558 01560 01562 01563 01566 01567 01568 01569 01572 015141 015166 17 21 22 23 34 48 50 54 90 91 102 104 106 TT 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 Mã mẫu 134 300 330 412 417 484 629 636 643 848 943 1000 1017 1033 1037 1224 1413 1359 1361 1362 1443 1555 1651 1656 1681 1683 1730 1765 2090 2106 TN01 TN02 TN03 TN04 TN05 TN06 TN07 TN08 TN09 TN10 TN11 TT 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 Mã mẫu TN12 TN13 TN14 TN15 TN16 TN17 TN18 TN19 TN20 TN21 TN22 TN23 XP01 XP02 XP03 XP04 XP05 XP06 XP07 XP08 XP09 XP10 XP11 XP12 XP13 XP14 XP15 XP16 XP17 XP18 XP19 XP20 XP21 XP22 XP23 XP24 XP25 XP26 XP27 XP28 XP29 TT 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 Mã mẫu XP30 XP31 XP32 XP33 XP34 XP35 XP36 XP37 XP38 XP39 XP40 XP41 XP42 XP43 XP44 XP45 XP46 XP47 XP48 XP49 XP50 XP51 XP52 XP53 XP54 XP55 XP56 XP57 PHỤ LỤC 3: BẢNG PHIÊN GIẢI KẾT QUẢ MIC THEO TIÊU CHUẨN CLSI 2017 Kháng sinh Imipenem (IMP) Meropenem (MEM) Ciprofloxacin (CIP) Ceftazidime (CAZ) Cefotaxime (CTX) Colistin (CS) Imipenem (IMP) Meropenem (MEM) Ciprofloxacin (CIP) Ceftazidime (CAZ) Cefotaxime (CTX) Colistin (CS) ... DIỆU LINH NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VI? ??N VI? ??T ĐỨC VÀ BỆNH VI? ??N TRUNG ƯƠNG QUÂN ĐỘI 108 Chuyên ngành: Vi sinh... lớn trở thành nhu cầu cấp thiết sở để thực đề tài: "Nghiên cứu mức độ phân tử khả kháng carbapenem số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân Bệnh vi? ??n Vi? ??t Đức Bệnh vi? ??n Trung ương Quân đội 108" ... mã hoá carbapenemase chủng vi khuẩn E coli, K pneumoniae, A baumannii kháng carbapenem phân lập Bệnh vi? ??n Vi? ??t Đức Bệnh vi? ??n Trung ương Quân đội 108 Xác định số đặc điểm phân tử chủng vi khuẩn